鼠李糖乳桿菌制劑及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及鼠李糖乳桿菌制劑及其應(yīng)用，具體涉及鼠李糖乳桿菌作為主要活性成 份制成微生態(tài)制劑，及該微生態(tài)制劑在治療相關(guān)疾病中的應(yīng)用，屬于生物藥領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002] 鼠李糖乳桿菌在預(yù)防和治療疾病方面發(fā)揮越來越重要的作用，但目前已經(jīng)上市的 含有鼠李糖乳桿菌的產(chǎn)品效果不理想，因此篩選高效鼠李糖乳桿菌菌種是目前亟需解決的 問題，尤其篩選到具有顯著抗過敏作用的鼠李糖乳桿菌菌種。
[0003] 近年來，過敏疾病的發(fā)生率呈上升趨勢，根據(jù)世界衛(wèi)生組織的數(shù)據(jù)，目前全球有 22 %的人患過敏性疾病，并且發(fā)病率迅猛增長，截止到2015年，全球已有40-50 %的人患有 過敏癥，WHO已把過敏性疾病列為21世紀(jì)需要重點(diǎn)研究和防治的三大疾病之一。據(jù)統(tǒng)計(jì)我國 過敏性疾病的發(fā)病率高達(dá)37.3%，主要影響人群為嬰幼兒。
[0004] 尋找有效的過敏防治措施迫在眉睫。目前針對治療過敏性疾病比較普遍的方法是 使用藥物治療。如組胺拮抗劑，可通過堵塞組胺感受器來抑制組胺反應(yīng)，以及類固醇和抑制 肥大細(xì)胞釋放發(fā)炎物質(zhì)的藥物、氣管擴(kuò)張劑藥物等。但是這類藥物僅提供暫時(shí)的癥狀緩解， 無法真正改變過敏免疫反應(yīng)，治標(biāo)不治本。
[0005] 本發(fā)明鼠李糖乳桿菌微生態(tài)制劑防治過敏等疾病療效顯著，并可作為藥品、保健 品、食品、獸藥和飼料添加劑等應(yīng)用，社會意義巨大，且未見相關(guān)研究報(bào)道，特申請此發(fā)明專 利。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明的目的是提供一種微生態(tài)制劑，該微生態(tài)制劑的活性成分為鼠李糖乳桿菌 DH099,保藏編號CGMCC No. 11229,該微生態(tài)制劑具有預(yù)防或治療機(jī)體過敏反應(yīng)等作用。
[0007] 根據(jù)菌株的菌落、菌體形態(tài)特征，16SrDNA序列分析及API細(xì)菌鑒定系統(tǒng)分析結(jié)果 來確認(rèn)菌株在分類學(xué)地位，發(fā)現(xiàn)編號DH099的菌株為鼠李糖乳桿菌;該株菌在形態(tài)學(xué)及一般 性質(zhì)上的特征如下：
[0008] 1、菌體或菌落形態(tài)
[0009] 菌體形態(tài):菌體在顯微鏡下呈短桿狀，兩端圓形。菌體成單、成對或成鏈，不形成芽 孢。
[0010] 菌落形態(tài)：固體培養(yǎng)基上形成明顯菌落，直徑在0.5-1.0mm之間，圓形，邊緣整齊， 乳白色，不透明，表面濕潤光滑。
[0011] 2、生理生化特征：
[0012] 生長溫度范圍2-53°C，最適生長溫度為35-38°C，兼性厭氧。菌株的最適生長pH值 5.5-6.0。不具有致病性，不產(chǎn)毒素。
[0013] 在糖發(fā)酵中，苦杏仁苷、阿拉伯糖、纖維二糖、七葉靈、果糖、半乳糖、葡萄糖、葡糖 酸鹽、乳糖、麥芽糖、甘露醇、甘露糖、松三糖、鼠李糖、核糖、水楊苷、山梨醇、蔗糖、海藻糖均 能被發(fā)酵，密二糖、綿子糖、木糖不能被發(fā)酵;精氨酸產(chǎn)NH3; PH值在6.0以上時(shí)能還原硝酸 鹽;不液化明膠;不分解酪素，能產(chǎn)生少量的可溶性氮;不產(chǎn)吲哚和H2S;接觸酶陰性;無細(xì)胞 色素;聯(lián)苯胺反應(yīng)陰性。
[0014] 本微生態(tài)制劑制成固體組合物包含的總活菌數(shù)不低于IX 106CFU/g，一般在IX 109CFU/g以上，最高可達(dá)到1 X 10nCFU/g或1 X 10nCFU/g以上；制成液體組合物包含的總活 菌數(shù)不能低于1 X 106CFU/mL，一般在1 X 109CFU/mL以上，最高可達(dá)到1 X 10nCFU/mL或1 X 10nCFU/mL 以上。
[0015] 本微生態(tài)制劑可用于預(yù)防或治療機(jī)體過敏反應(yīng)等多種人體疾病，進(jìn)一步治療濕 疹、過敏性鼻炎、異位性皮炎、過敏性哮喘或食物過敏等疾病。
[0016] 本微生態(tài)制劑可制成藥品組合物、保健品、食品、獸藥或飼料添加劑等。
[0017] 本微生態(tài)制劑所述鼠李糖乳桿菌指活的生物個(gè)體。
【具體實(shí)施方式】
[0018] 制備例說明：這里通過鼠李糖乳桿菌DH099保藏編號CGMCC11229散劑為例進(jìn)行具 體說明，其他鼠李糖乳桿菌菌種制劑的制備方法本領(lǐng)域技術(shù)人員通過本實(shí)施例很容易掌 握，其他劑型的制備方法本領(lǐng)域技術(shù)人員通過本實(shí)施很容易掌握，在此不再一一敘述說明。 制備方法并不局限于本發(fā)明實(shí)施例所述，公知的能夠達(dá)到制備目的的方法均可以，實(shí)施例 的制備說明只是對本發(fā)明的說明，并不是對本發(fā)明保護(hù)范圍的限制。
[0019] 制備實(shí)施例鼠李糖乳桿菌散劑的制備
[0020] 1菌粉的制備和菌種的鑒定
[0021] 用無菌容器收集自然排出的新鮮糞便5-10g，迅速放入?yún)捬豕拗校瑤Щ貙?shí)驗(yàn)室進(jìn)行 菌種分離。取奠便樣品1.5g，用15mlPBS緩沖液懸浮混勾，400g離心5min收集上清池液，再加 入適量PBS緩沖液8000g離心10min，收集上清濁液，即得到供試樣品。吸取lml上濁液加入一 支裝有9mlPBS稀釋液(含有5% QL-半胱氨酸）的試管中渦旋混勻，作為10-2稀釋液，用同樣方 法稀釋至10-3，分別取糞便原液、10- 2稀釋液、10-3稀釋液各0. lml涂布于MRS平板上，置于37 °C恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24小時(shí)后，選擇培養(yǎng)基上呈圓形，邊緣整齊，隆起，乳白色不透明，表明 濕潤光滑，直徑大小在0.5-1.0_的菌落，接種于MRS液體培養(yǎng)基中，37 °C培養(yǎng)24h后，將所得 培養(yǎng)液離心（12000rpm)分離出菌體后，將菌體冷凍真空干燥，調(diào)制出干燥菌粉，活菌數(shù)均為 IX 109CFU/g以上。同時(shí)對菌株展開生理生化特征鑒定。通過對分離獲得的菌株分別進(jìn)行接 觸酶實(shí)驗(yàn)及凝乳實(shí)驗(yàn)，去除接觸酶陽性及無凝乳現(xiàn)象之菌株，排除非目的菌株后，對其余的 菌株繼續(xù)通過BIOLOG及API 50CH進(jìn)行生理生化特征鑒定，最后通過提取DNA測序，進(jìn)一步明 確菌株的分類地位。經(jīng)鑒定為鼠李糖乳桿菌DH099、鼠李糖乳桿DH105、鼠李糖乳桿DH117、鼠 李糖乳桿DH033、鼠李糖乳桿DH021。
[0022] 2毒性試驗(yàn)
[0023] 2.1動(dòng)物及分組取60只SPF級別小鼠，6~8周齡，體重15~19g，隨機(jī)分入各鼠李糖 乳桿菌組和未給藥組，每組10只。
[0024] 2.2制備菌液將上述鼠李糖乳桿菌菌粉分別用純化水調(diào)制為含菌數(shù)均為1 X 109CFU/mL 的菌液。
[0025] 2.3方法鼠李糖乳桿菌組和未給藥組均給予相同的基礎(chǔ)飼料，且飼養(yǎng)條件均一 致，鼠李糖桿菌組每天灌服鼠李糖乳桿菌菌液0.5mL，未給藥組每天灌服純化水0.5mL，飼喂 6個(gè)月，觀察毒性反應(yīng)。
[0026] 2.4結(jié)果
[0027] 各組小鼠均未出現(xiàn)異常情況，未發(fā)生振顫、痙攣、運(yùn)動(dòng)失調(diào)、姿態(tài)異常，無眼球突 出，排尿正常，皮膚、呼吸正常，無死亡情況，表明鼠李糖乳桿菌不存在毒性。
[0028] 3制備成散劑等劑型
[0029] 根據(jù)上述步驟和方法分離鑒定后，經(jīng)實(shí)驗(yàn)檢驗(yàn)無毒性，就可將鼠李糖乳桿菌菌種 制成菌粉，然后按照需要添加相關(guān)輔料制成各種劑型，優(yōu)選根據(jù)鼠李糖乳桿菌菌粉的活菌 數(shù)，制成散劑，使活菌數(shù)不低于1 X l〇7CFU/g，然后裝袋。
[0030] 應(yīng)用效果實(shí)施例說明：本發(fā)明以鼠李糖乳桿菌DH099保藏編號CGMCC11229為代表 說明鼠李糖乳桿菌的應(yīng)用效果，但不是對本發(fā)明的限制。
[0031 ]應(yīng)用效果實(shí)施例1:鼠李糖乳桿菌緩解過敏試驗(yàn)研究 [0032] 1材料與方法
[0033] 1.1材料
[0034] 1.1.1試驗(yàn)產(chǎn)品
[0035] 鼠李糖乳桿菌活菌DH099、DH105、DH117、DH033、DH021散劑，活菌數(shù)均為1 X 107CFU/g以上。
[0036] 1.1.2試驗(yàn)動(dòng)物
[0037]清潔級3周齡斷乳雄性BALB/c近交系小鼠49只。
[0038] 1.2方法
[0039] 將49只小鼠隨機(jī)分為7組，每組各7只。將各組的益生菌溶于生理鹽水中混勻制成 混濁液，使終濃度為1 X 108cfu/ml。灌胃給予20ml/kg，每日劑量分兩次灌胃。陰性對照組： 將凍干保護(hù)劑溶于生理鹽水中制成渾濁液，小鼠每天灌胃20ml/kg，每日劑量分兩次灌胃。 陽性對照組:選用從市場上同類益生菌產(chǎn)品中分離獲得的鼠李糖乳桿菌，將該菌株菌體溶 于生理鹽水中制成lX10 8cfu/ml混濁液，小鼠每天灌胃20ml/kg，每日劑量分兩次灌胃。
[0040] 1.3建立遲發(fā)型超敏反應(yīng)動(dòng)物模型
[0041] 首次灌胃第二日小鼠腹部剃毛，3cmX3cm范圍，以使致敏部位充分暴露。均勻涂布 20yL 0.5 %DNFB溶液（溶于4:1丙酮:橄欖油中）致敏。對各組小鼠按上述方法連續(xù)灌胃14 天，末次給藥后1小時(shí)，在小鼠左耳兩面均勻涂布〇. 25 %DNFB溶液10yL進(jìn)行攻擊，誘發(fā)小鼠 遲發(fā)型超敏反應(yīng)模型。60min后剪下雙耳稱重。
[0042] 1.4觀察指標(biāo)
[0043] 耳重量：以打孔器取耳中部組織塊，分析天平稱重，計(jì)算左右耳組織塊的重量差。 比較各組數(shù)值，以樣本均值差異顯著性t檢驗(yàn)作統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。
[0044] 1.5計(jì)算公式
[0045] 腫脹度(mg)=右耳片重量-左耳片重量
[0046] 抑制率（％) =(空白對照組平均腫脹度-各給藥組平均腫脹度)/空白對照組平均 腫脹度X 100%
[0047] 2試驗(yàn)結(jié)果及分析
[0048] 2.1試驗(yàn)結(jié)果
[0049] 表1不同益生菌菌株對小鼠遲發(fā)型超敏反應(yīng)的影響(n = 7)
[0050]
[0051 ] 2.2分析
[0052]與市場上知名同類產(chǎn)品分離獲得的鼠李糖乳桿菌及從樣品中同時(shí)分離的其它菌 株相比，鼠李糖乳桿菌DH099能顯著抑制由DNFB誘發(fā)的小鼠遲發(fā)型超敏反應(yīng)的耳腫脹程度， 抑制率為67.35 %，差別具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。因此該株益生菌相較于其它菌株具有 良好的抑制機(jī)體的過敏反應(yīng)功能。
[0053]本發(fā)明在實(shí)施過程中所使用的微生物菌種已于2015年08年11日在中國微生物菌 種保藏管理委員會普通微生物中心（北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號，中國科學(xué)院微生物 研究所郵編100101)保藏，微生物菌種信息如下。
[0054] 分類命名：鼠李糖乳桿菌Lactobacillus rhamnosus，保存編號CGMCC No. 11229。
[0055] 上述微生物菌種經(jīng)該微生物中心檢測，檢測結(jié)果為存活。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種微生態(tài)制劑，其特征在于該微生態(tài)制劑的活性成分為鼠李糖乳桿菌，所述鼠李 糖乳桿菌為鼠李糖乳桿菌DH099,保藏編號CGMCC No. 11229。2. 按權(quán)利要求1所述的微生態(tài)制劑，其特征在于鼠李糖乳桿菌指活的生物個(gè)體。3. 權(quán)利要求1所述的微生態(tài)制劑的應(yīng)用，其特征在于有效劑量的鼠李糖乳桿菌作為活 性成份制成藥品組合物、保健品、食品、獸藥或飼料添加劑。4. 權(quán)利要求1所述的微生態(tài)制劑在制備預(yù)防或治療機(jī)體過敏反應(yīng)用組合物中的用途。5. 權(quán)利要求1所述的微生態(tài)制劑在制備治療濕疹、過敏性鼻炎、異位性皮炎、過敏性哮 喘或食物過敏用組合物中的用途。6. 按權(quán)利要求1所的微生態(tài)制劑，其特征在于固體組合物包含的總活菌數(shù)不低于IX 106CFU/g，一般在1 X 109CFU/g以上，最高可達(dá)到1 X 10nCFU/g或1 X 10nCFU/g以上;或液體 組合物包含的總活菌數(shù)不能低于1 X 106CFU/mL，一般在1 X 109CFU/mL以上，最高可達(dá)到1 X 10nCFU/mL或 1 X 10nCFU/mL 以上。
【專利摘要】本發(fā)明涉及鼠李糖乳桿菌制劑及其應(yīng)用，具體涉及鼠李糖乳桿菌作為主要活性成份制成微生態(tài)制劑，及該微生態(tài)制劑在治療過敏等相關(guān)疾病中的應(yīng)用，所述鼠李糖乳桿菌為鼠李糖乳桿菌DH099，保藏編號CGMCC？No.11229，屬于生物藥領(lǐng)域。CGMCC NO.1122920150811
【IPC分類】A23L33/135, C12N1/20, A61K35/747, C12R1/225, A61P37/08, A23K10/18
【公開號】CN105624069
【申請?zhí)枴緾N201610143184
【發(fā)明人】崔云龍, 郁聰
【申請人】青島東海藥業(yè)有限公司
【公開日】2016年6月1日
【申請日】2016年3月14日