基于dpo引物的實時熒光pcr檢測鼠李糖乳桿菌的方法、引物及試劑盒的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明設(shè)及菌株檢測領(lǐng)域，特別設(shè)及檢測樣品如微生物肥料、食品、醫(yī)用益生菌制 劑等中鼠李糖乳桿菌或者含有鼠李糖乳桿菌DNA的方法W及用于該方法的引物、含有該引 物的組合物和試劑盒。
【背景技術(shù)】
[0002] 鼠李糖乳桿菌化actobacillusrhamnosus)是一種廣泛使用的益生菌，具有維持 腸道微生態(tài)平衡，提高機體免疫力等功效，目前已經(jīng)被應(yīng)用于食品、醫(yī)用益生菌制劑等領(lǐng) 域。近年來，該菌的功能不斷被開發(fā)，目前鼠李糖乳桿菌已經(jīng)應(yīng)用在微生物肥料領(lǐng)域，對運 些產(chǎn)品中微生物的準(zhǔn)確鑒定是產(chǎn)品質(zhì)量控制的重要依據(jù)，因此建立一種快速、準(zhǔn)確的鑒定 方法具有重要意義。
[0003] 目前鼠李糖乳桿菌的檢測主要依靠傳統(tǒng)生理生化和分子生物學(xué)方法進行。
[0004] 傳統(tǒng)生理生化耗時耗力，而且由于乳桿菌屬許多種非常相似，生理生化特征也存 在許多相似之處，實際檢測過程中難W判斷，不能滿足實際檢測的需要。
[0005] 基于特異性引物的PCR的方法具備快速、準(zhǔn)確、低成本的優(yōu)點，目前被廣泛用于轉(zhuǎn) 基因、食源性微生物、醫(yī)學(xué)病原菌等方面的檢測。目前PCR法已經(jīng)被應(yīng)用于鼠李糖乳桿菌的 檢測，Kwon等建立用于檢測鼠李糖乳桿菌的特異性引物，但需要另外一對引物將鼠李糖乳 桿菌與干酪乳桿菌區(qū)分開；楊小紅等建立了普通PCR法檢測鼠李糖乳桿菌，并用40株標(biāo)準(zhǔn) 菌株驗證了方法的特異性，并將該特異性引物成功轉(zhuǎn)化成為農(nóng)業(yè)部標(biāo)準(zhǔn)NY/T2066-2011。 W往報道的特異性引物檢測鼠李糖乳桿菌全部使用的是普通引物，需要嚴格控制反應(yīng)條 件尤其是退火溫度，退火溫度的變化可能會影響到引物的特異性，例如農(nóng)業(yè)部標(biāo)準(zhǔn)NY/T 2066-2011中所使用的鼠李糖乳桿菌特異性引物W較高的退火溫度（67°C)來保證引物的 特異性。而不同實驗室之間由于儀器、人員等差異，可能會無法精確重復(fù)出試驗的各項條 件，導(dǎo)致檢測特異性受到影響，可能照成誤判，而且普通PCR法需要進一步凝膠電泳判斷結(jié) 果，增加了檢測所需時間。
[0006] 實時巧光PCR中使用化qMan探針能檢測PCR中的特異性擴增產(chǎn)物，而不受非特異 性擴增產(chǎn)物的影響，因此被廣泛應(yīng)用于微生物的定性及定量檢測，但一條有效的巧光探針 需要具備很高的保守性、合適的GC含量和長度、W及合適的Tm值等，而且不同乳桿菌之間 的差異較小，運使探針設(shè)計的難度大大增加。另外，探針合成的價格比較昂貴，因而在一定 程度上限制了特異性巧光探針的使用。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是提供一種特異性強、靈敏度高、具備定量能力、通用性 和實用性強的基于DP0引物的實時巧光PCR用于檢測鼠李糖乳桿菌的方法，本發(fā)明還提供 了用于該方法的DP0引物和含有該DP0引物的試劑盒。
[0008] 為了解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明通過如下技術(shù)方案實現(xiàn)：
[0009] 本發(fā)明提供了一種引物對，其中一條引物包含SEQ ID NO :1所示的核巧酸序列，另 一條引物包含SEQ ID NO :2所示的核巧酸序列。
[0010] 本發(fā)明還提供了所述的引物對在制備檢測鼠李糖乳桿菌的試劑盒中的用途。
[0011] 進一步的，本發(fā)明還提供了一種檢測樣品中鼠李糖乳桿菌的試劑盒，所述試劑盒 中含有權(quán)利要求1所述的引物對。
[0012] 所述試劑盒還包括Taq酶和d地2〇,所述Taq酶優(yōu)選為與SYBR染料預(yù)混好的Ex化q 酶。
[0013] 所述試劑盒還包括細菌基因組DNA提取試劑。
[0014] 更進一步的，本發(fā)明提供了一種檢測樣品中鼠李糖乳桿菌的方法，包括使用上述 的引物對、上述試劑盒的步驟。
[0015] 上述檢測樣品中鼠李糖乳桿菌的方法優(yōu)選包括如下步驟：
[001引1)實時巧光PCR反應(yīng)
[0017] W含有DNA的樣品為模板與DP0引物進行實時巧光PCR反應(yīng)，所述DP0引物為SEQ ID NO :1和沈Q ID NO :2 ;
[0018] 2)判斷待檢樣品。
[0019] 優(yōu)選的，在步驟1)之前還包括DNA的提取步驟。
[0020] 優(yōu)選的，所述實時巧光PCR反應(yīng)的反應(yīng)體系如下：
[0021] SYBR Premix Ex Taq? 10 μL
[002引DPO引物 終濃度為0. 2 μ mol/L
[0023]DNA模板 50ng
[0024] (1地2〇補足至20yL。
[0025] 優(yōu)選的，所述實時巧光PCR反應(yīng)的反應(yīng)體系如下：所述實時巧光PCR反應(yīng)的程序如 下：95°(：預(yù)變性303;95°(：變性53、50-60°(：退火303、72°(：延伸303,35個循環(huán)。
[0026] 本發(fā)明的有益效果包括：
[0027] (1)本發(fā)明針對鼠李糖乳桿菌的gy巧基因設(shè)計特異性DP0引物，建立了實時巧光 PCR法，成功實現(xiàn)了種水平的鑒定，其靈敏度高于農(nóng)業(yè)部標(biāo)準(zhǔn)1個數(shù)量級。
[002引 似本發(fā)明將SYBRGreenI實時巧光PCR和DP0引物檢測技術(shù)相結(jié)合，吸收了DP0 引物高特異性且引物之間難W形成二聚體等優(yōu)點，成功建立了一種特異性強、靈敏度高、具 備定量能力的鼠李糖乳桿菌的檢測方法。
[0029] (3)本發(fā)明的DP0引物的特異性在較低退火溫度（50°C)和較高的退火溫度下 (6(TC)下結(jié)果均與農(nóng)業(yè)部標(biāo)準(zhǔn)一致，運大大增強了本發(fā)明的DP0引物和方法在不同實驗室 之間的通用性。
[0030] (4)本發(fā)明將DP0引物和SYBRGreenI的實時巧光PCR結(jié)合起來，檢測結(jié)果易于 判斷，無需凝膠電泳，運也增強了本方法的實用性。
【附圖說明】
[003。 圖1是基于DP0引物的鼠李糖乳桿菌的實時巧光PCR的擴增曲線，其中橫坐標(biāo)為 循環(huán)數(shù)，縱坐標(biāo)為巧光值，其中1-12分別代表表1中1-12號菌株。
[0032] 圖2是采用本發(fā)明的DPO引物對梯度稀釋的鼠李糖乳桿菌的DM進行實時巧光 PCR的靈敏度檢測結(jié)果，其中從左至右的DNA模板濃度依次為long/μLIng/μ LO.Ing/ μLO.Olng/μL最右為陰性對照。
[0033] 圖3為利用農(nóng)業(yè)部標(biāo)準(zhǔn)NY/T2066-2011對梯度稀釋的鼠李糖乳桿菌的DM進行 常規(guī)PCR的靈敏度檢測結(jié)果，其中Μ代表MarkerDL2000 ;1-4的DNA模板濃度按順序從左 至右分別是lOng/μLIng/μ^0.Ing/μ^0.Olng/μL5 為陰性對照。
【具體實施方式】：
[0034] 除非特殊說明，本發(fā)明所用術(shù)語具有本發(fā)明所屬領(lǐng)域中的一般含義。
[0035] 鼠李糖乳桿菌作為益生菌被廣泛應(yīng)用于食品、醫(yī)藥、農(nóng)業(yè)等領(lǐng)域，因此建立運些產(chǎn) 品中鼠李糖乳桿菌的檢測方法具有重要意義。在細菌進化過程中，核糖體RNA(rRNA)基因 的進化相對保守，因此被認為是對細菌進行親緣關(guān)系分析的最理想的基因，該基因序列幾 乎可W對所有細菌進行屬水平上的鑒定。然而，由于16SrRNA基因的高度保守性，對相似 性極高的近源種無法做出進一步區(qū)分，很難設(shè)計出種特異性引物。單拷貝gy巧基因作為另 外一種看家基因，由于其進化速度較16SrRNA基因快，目前已經(jīng)被廣泛應(yīng)用于微生物鑒定 中。
[0036] 本發(fā)明通過檢測鼠李糖乳桿菌的gy巧基因來檢測樣品中的鼠李糖乳桿菌。由此， 運用本方法可W快速的檢測出樣品中的鼠李糖乳桿菌。
[0037] 本發(fā)明檢測鼠李糖乳桿菌的gy巧基因是通過實時巧光定量PCR來實現(xiàn)的。
[0038] 為了實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明針對鼠李糖乳桿菌的gy巧基因設(shè)計了特異性DP0引 物。
[0039] 在一個具體實施例中，所用的特異性DP0引物包含SEQIDNO: 1和SEQIDNO:2 所示的核巧酸序列。
[0040] 本發(fā)明DP0引物的特異性在較低退火溫度（50°C)和較高的退火溫度下（60°C) 下的結(jié)果顯示與農(nóng)業(yè)部標(biāo)準(zhǔn)一致，運大大增強了本方法在不同實驗室之間的通用性。
[0041] 在一個具體方面，本發(fā)明設(shè)及一種檢測樣品中鼠李糖乳桿菌的方法，該方法包 括：
[004引 1)實時巧光PCR反應(yīng)
[004引 W含有DNA的樣品為模板與DP0引物進行實時巧光PCR反應(yīng)，所述DP0引物為SEQ IDNO:1 和沈QIDNO:2;
[0044]。判斷待檢樣品
[0045] 在步驟1)之前還可W包括DNA的提取步驟。
[0046] 所述實時巧光PCR反應(yīng)的反應(yīng)體系優(yōu)選如下：
[0047] SYB民PremixExTaqI、； 10.uL DPO引物 巧化巧為0.2ymol/L DNA模板 50ng 加H:0 i;|、記午.20|iL·，
[0048] 所述實時巧光PCR反應(yīng)的反應(yīng)體系優(yōu)選如下：所述實時巧光PCR反應(yīng)的程序如下： 95°C預(yù)變性 30s;95°C變性 5s、50-60°C退火 30s、72°C延伸 30s，35 個循環(huán)。
[0049] 上述提到的樣品可W包括但不限于是食品、醫(yī)用益生菌制劑、微生物肥料等。
[0050] 下面參考具體實施例和附圖，對本發(fā)明進行說明，需要說明的是，運些實施例僅僅 是說明性的，而不能理解為對本發(fā)明的限制。實施例中未注明具體技術(shù)或條件的，按照本領(lǐng) 域內(nèi)的文獻所描述的技術(shù)或條件或者按照產(chǎn)品說明書進行。所用試劑或儀器未注明生產(chǎn)廠 商者，均為可W通過市購獲得的常規(guī)產(chǎn)品。
[00川 實施例1
[0052] 本實施例提供了樣品中鼠李糖乳桿菌的檢測方法，包括如下步驟：
[005引步驟一：基因組DNA的提取
[0054] 采用細菌基因組DNA提取試劑盒（購自天根生化科技（北京）有限公司，貨號為 DP302)對樣品提取DNA，參照說明書的要求操作。
[005引步驟二：實時巧光PCR反應(yīng)
[0056] 實時巧光PCR反應(yīng)體系如下：
[0057] SYB民PremixExTaq'i、i 10 μΙ. ΟΡΟ引物終濃度為0.2μηιο1/Ι_
[0058] DNA模板 50ng ddH2〇外化中.20,止。
[0059] 所述SYBRPremixExTaq?II燈liRNas細Plus)購自寶生物工程（大連）有限 公司，貨號為RR820Q