一種槲皮素與鼠李糖加熱生成物及其制備方法和應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于止血化合物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種槲皮素與鼠李糖加熱生成物及其 制備方法和應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 槐花為豆科植物槐（Sophora japanica L.)的干燥花及花蕾，有涼血止血，清肝瀉 火之效。用于便血、痣血、血痢、崩漏、吐血，衄血。植物化學研究顯示槐花的主要化學成分 是黃酮、異黃酮、類異黃酮?；被ㄌ渴腔被ǖ姆ǘㄅ谥破罚刺亢笪犊酀?，清熱涼血作用弱， 以止血力勝。
[0003] 槲皮素，又名櫟精，槲皮黃素，溶于冰醋酸，堿性水溶液呈黃色，幾乎不溶于水，乙 醇溶液味很苦?？勺鳛樗幤?，具有較好的祛痰、止咳作用，并有一定的平喘作用。此外還有 降低血壓、增強毛細血管抵抗力、減少毛細血管脆性、降血脂、擴張冠狀動脈，增加冠脈血流 量等作用。用于治療慢性支氣管炎。對冠心病及高血壓患者也有輔助治療作用。
[0004] 鼠李糖，6-脫氧-L-甘露糖，廣泛存在于植物的多糖、糖苷、植物膠和細菌多糖中。 其甜度為蔗糖的33%，可用來測定腸道的滲透性，可用作甜味劑，還可用于生產(chǎn)香精香料， 可食用。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 解決的技術(shù)問題：本發(fā)明一種槲皮素與鼠李糖加熱生成物及其制備方法和應(yīng)用， 經(jīng)體外活性實驗驗證其具有較好的止血作用。
[0006] 技術(shù)方案：一種槲皮素與鼠李糖加熱生成物的制備方法，制備步驟為：槲皮素與 鼠李糖分別以摩爾比為1: (1~4)，于200°C~250°C馬弗爐中加熱反應(yīng)10_30min。
[0007] 優(yōu)選的，上述槲皮素與鼠李糖的反應(yīng)比例為1: 3。
[0008] 優(yōu)選的，上述加熱反應(yīng)為250°C馬弗爐中加熱反應(yīng)10min-15min。
[0009] 優(yōu)選的，上述加熱反應(yīng)為200°C馬弗爐中加熱反應(yīng)25min-30min。
[0010] 上述制備方法所制得的槲皮素與鼠李糖加熱生成物。
[0011] 上述槲皮素與鼠李糖加熱生成物在制備止血藥物中的應(yīng)用。
[0012] -種止血藥物，有效成分為上述的槲皮素與鼠李糖加熱生成物。
[0013] 加熱時間需嚴格控制。加熱時間過長或過短，槲皮素與鼠李糖加熱反應(yīng)無法生成 該生成物。
[0014] 有益效果：本發(fā)明生成物能縮短APTT和PT，具有促凝血活性，且表現(xiàn)為劑量依賴 關(guān)系。體外止血活性實驗結(jié)果表明，本發(fā)明生成物具有良好的止血活性，表現(xiàn)為促進血漿血 小板聚集和促凝血活性。
【附圖說明】
[0015] 圖1為實施例1的HPLC-MS/MS分析驗證圖；
[0016] 圖2為實施例2的HPLC-MS/MS分析驗證圖；
[0017] 圖3為實施例3的HPLC-MS/MS分析驗證圖；
[0018] 圖4為實施例4的HPLC-MS/MS分析驗證圖；
[0019] 圖5為實施例5的HPLC-MS/MS分析驗證圖；
[0020] 圖6為實施例6的HPLC-MS/MS分析驗證圖；
[0021] 圖7為實施例7的HPLC-MS/MS分析驗證圖；
[0022] 圖8為實施例8的HPLC-MS/MS分析驗證圖；
[0023] 圖9為實施例9的HPLC-MS/MS分析驗證圖；
[0024] 圖10本發(fā)明實例2生成物對ADP、膠原、凝血酶誘導(dǎo)的新西蘭兔血漿血小板聚集的 影響示意圖（X 土SD，n=6 );
[0025] 圖11本發(fā)明實例2生成物對新西蘭兔血漿APTT的影響示意閣（x:t_SD, n=6 );
[0026] 圖12本發(fā)明實例2生成物對新西蘭兔血漿PT的影響示意圖（[土SD, n=6
[0027] 圖13本發(fā)明不同實例生成物對ADP、膠原、凝血酶誘導(dǎo)的新西蘭兔血漿血小板聚 集的影響示意圖（I士SD, n=6 :?
[0028] 圖14本發(fā)明不同實例生成物對新西蘭兔血漿APTT的影響示意圖（n=6 ):丨
[0029] 圖15本發(fā)明不同實例生成物對新西蘭兔血漿PT的影響示意圖（7士SD, n=6 )。
【具體實施方式】
[0030] 本發(fā)明所述的生成物是從槲皮素和鼠李糖加熱反應(yīng)并經(jīng)HPLC-MS/MS分析等方法 確定得到。以下結(jié)合實際情況，對本發(fā)明的【具體實施方式】進行詳細說明：
[0031] 實施例1
[0032] 0· 164g 鼠李糖（0· OOlmol)與 0· 302g 槲皮素（0· OOlmol)置于 100mL 坩堝，混合均 勻，于250°C馬弗爐中加熱5min。加熱反應(yīng)產(chǎn)物經(jīng)HPLC-MS/MS分析驗證，結(jié)果見圖1。
[0033] 實施例2
[0034] 0· 164g 鼠李糖（0· OOlmol)與 0· 302g 槲皮素（0· OOlmol)置于 100mL 坩堝，混合均 勻，于250°C馬弗爐中加熱10min。加熱反應(yīng)產(chǎn)物經(jīng)HPLC-MS/MS分析驗證，結(jié)果見圖2。
[0035] 實施例3
[0036] 0· 164g 鼠李糖（0· OOlmol)與 0· 302g 槲皮素（0· OOlmol)置于 100mL 坩堝，混合均 勻，于250°C馬弗爐中加熱20min。加熱反應(yīng)產(chǎn)物經(jīng)HPLC-MS/MS分析驗證，結(jié)果見圖3。
[0037] 實施例4
[0038] 0· 328g 鼠李糖（0· 002mol)與 0· 302g 槲皮素（0· OOlmol)置于 100mL 坩堝，混合均 勻，于250°C馬弗爐中加熱10min。加熱反應(yīng)產(chǎn)物經(jīng)HPLC-MS/MS分析驗證，結(jié)果見圖4。
[0039] 實施例5
[0040] 0· 492g 鼠李糖（0· 003mol)與 0· 302g 槲皮素（0· OOlmol)置于 100mL 坩堝，混合均 勻，于250°C馬弗爐中加熱10min。加熱反應(yīng)產(chǎn)物經(jīng)HPLC-MS/MS分析驗證，結(jié)果見圖5。
[0041] 實施例6
[0042] 0· 656g 鼠李糖（0· 004mol)與 0· 302g 槲皮素（0· OOlmol)置于 100mL 坩堝，混合均 勻，于250°C馬弗爐中加熱lOmin。加熱反應(yīng)產(chǎn)物經(jīng)HPLC-MS/MS分析驗證，結(jié)果見圖6。
[0043] 實施例7
[0044] 0· 164g 鼠李糖（0· OOlmol)與 0· 302g 槲皮素（0· OOlmol)置于 lOOmL 坩堝，混合均 勻，于200°C馬弗爐中加熱15min。加熱反應(yīng)產(chǎn)物經(jīng)HPLC-MS/MS分析驗證，結(jié)果見圖7。
[0045] 實施例8
[0046] 0· 164g 鼠李糖（0· OOlmol)與 0· 302g 槲皮素（0· OOlmol)置于 100mL 坩堝，混合均 勻，于200°C馬弗爐中加熱25min。加熱反應(yīng)產(chǎn)物經(jīng)HPLC-MS/MS分析驗證，結(jié)果見圖8。
[0047] 實施例9
[0048] 0· 164g 鼠李糖（0· OOlmol)與 0· 302g 槲皮素（0· OOlmol)置于 100mL 坩堝，混合均 勻，于200°C馬弗爐中加熱35min。加熱反應(yīng)產(chǎn)物經(jīng)HPLC-MS/MS分析驗證，結(jié)果見圖9。
[0049] 實施例10
[0050] 本發(fā)明實施例2、實施例4及實施例5生成物體外止血活性測定
[0051] 1.樣品準備
[0052] 將不同實例生成物溶解于含二甲亞砜（DMS0)的生理鹽水溶液中（DMS0的終濃度 為2 % )制得儲備液。將儲備液稀釋至終濃度為100 μ Μ用于血小板聚集，終濃度為50 μ Μ 用于促凝血實驗。以2% DMS0為空白對照（Cont)，酚磺乙胺（5 μ g/mL)和血凝酶（0. lku/ mL)為陽性對照。
[0053] 2.血液收集和處理
[0054] 普通級雄性新西蘭兔，體重2. 5kg_3kg，實驗前標準實驗室飲食自來水適應(yīng)性喂養(yǎng) 一星期，實驗當天早上用戊巴比妥鈉（50mg/kg)麻醉后，兔頸總動脈插管取血，與0. 109M的 朽1檬酸三鈉按9:1均勾混合，經(jīng)抗凝后的全血用于觀察血小板聚集。全血以2500Xg離心 15min，收集上層液體（血漿）用于觀察促凝血活性。
[0055] 3.促血小板聚集實驗
[0056] 抗凝全血以800rpm/min離心10min，收集上層富血小板血漿（PRP)，剩余部分以 3000rpm/min離心10min，收集貧血小板血衆(zhòng)（PPP)。向PRP中加入PPP調(diào)節(jié)血小板數(shù)量為 4X1012-5X1012。在塑料測試杯中，加入290 yL PPP和10yL溶劑DMS0調(diào)零。10yL生成 物溶液和290 yL PRP加入到測試杯中，37°C溫育，5min后加入10yL ADP、膠原、凝血酶（終 濃度分別為0. 05 ymol/L、0. 03 μ g/mL、0. 01U/mL)，測定血小板6min內(nèi)的最大聚集率。本實 驗采用的是比濁法。測定前用DMS0調(diào)零。實驗在取血后2h內(nèi)完成。
[0057] 4.促凝血實驗
[0058] 按照試劑盒說明書測定活化部分凝血活酶時間（APTT)和凝血酶原時間（PT)。這 里作簡要說明，APTT試劑平衡至室溫，Cacl2預(yù)熱至37°C，45 μ L血漿、5 μ L各單體樣品溶 液和ΑΡΤΤ試劑50 μ L混勻后37°C孵育3min，再加50 μ L預(yù)熱的Cacl2試劑，計時；ΡΤ試劑 37°C預(yù)熱15min，45 μ L血漿和5 μ L各單體樣品溶液混勻后37°C孵育3min，再加100 μ L預(yù) 熱的ΡΤ試劑，計時。APTT和ΡΤ的結(jié)果值以秒表示。
[0059] 5.實驗結(jié)果
[0060] 圖10表示的是本發(fā)明實施例2生成物對新西蘭兔血漿ADP、膠原和凝血酶誘導(dǎo)的 血小板聚集的影響。結(jié)果表明，本發(fā)明實施例2生成物能促進膠原誘導(dǎo)的血小板聚集，且表 現(xiàn)為劑量依賴關(guān)系。圖11、圖12表示的是本發(fā)明實施例2生成物對新西蘭兔血漿APTT和 PT的影響。結(jié)果表明，本發(fā)明實施例2生成物能縮短APTT和PT，具有促凝血活性，且表現(xiàn) 為劑量依賴關(guān)系。體外止血活性實驗結(jié)果表明，本發(fā)明生成物具有良好的止血活性，表現(xiàn)為 促進血漿血小板聚集和促凝血活性。
[0061] 圖13、圖14和圖15分別比較了不同實例對新西蘭兔血漿ADP、膠原和凝血酶誘導(dǎo) 的血小板聚集、對新西蘭兔血漿ΑΡΤΤ和ΡΤ的影響。結(jié)果表明，止血活性強弱順序為實例5 >實例4 >實例2,說明工藝5優(yōu)于工藝、工藝2,鼠李糖與槲皮素的最佳比例為3:1。
【主權(quán)項】
1. 一種槲皮素與鼠李糖加熱生成物的制備方法，其特征在于制備步驟為：槲皮素與鼠 李糖分別以摩爾比為1: (1~4)，于200°C~250°C馬弗爐中加熱反應(yīng)10-30min。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述槲皮素與鼠李糖加熱生成物的制備方法，其特征在于所述槲皮 素與鼠李糖的反應(yīng)比例為1:3。3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述槲皮素與鼠李糖加熱生成物的制備方法，其特征在于所述加熱 反應(yīng)為250°C馬弗爐中加熱反應(yīng)10min-15min。4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述槲皮素與鼠李糖加熱生成物的制備方法，其特征在于所述加熱 反應(yīng)為200°C馬弗爐中加熱反應(yīng)25min-30min。5. 權(quán)利要求1~4任一所述制備方法所制得的槲皮素與鼠李糖加熱生成物。6. 權(quán)利要求5所述槲皮素與鼠李糖加熱生成物在制備止血藥物中的應(yīng)用。7. -種止血藥物，其特征在于有效成分為權(quán)利要求1~4所述的槲皮素與鼠李糖加熱生 成物。
【專利摘要】一種槲皮素與鼠李糖加熱生成物及其制備方法和應(yīng)用，制備步驟為：槲皮素與鼠李糖分別以摩爾比為1:（1~4），于200℃~250℃馬弗爐中加熱反應(yīng)10-30min。本發(fā)明生成物能縮短APTT和PT，具有促凝血活性，且表現(xiàn)為劑量依賴關(guān)系。體外止血活性實驗結(jié)果表明，本發(fā)明生成物具有良好的止血活性，表現(xiàn)為促進血漿血小板聚集和促凝血活性。
【IPC分類】A61K31/7048, C07H15/26, C07H17/07, A61P7/04, C07H1/00
【公開號】CN105315317
【申請?zhí)枴緾N201510724042
【發(fā)明人】吳皓, 陳葉青, 郁紅禮, 王欣之, 李偉
【申請人】南京中醫(yī)藥大學
【公開日】2016年2月10日
【申請日】2015年10月29日