一株提高蛋殼強度并改善蛋雞生產(chǎn)性能的鼠李糖乳酸桿菌w27及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001 ]本發(fā)明屬于動物飼料技術(shù)領(lǐng)域，涉及飼料添加劑，具體涉及一株提高蛋殼強度并 改善蛋雞生產(chǎn)性能的鼠李糖乳酸桿菌W27及其應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]血鈣不足會對蛋殼質(zhì)量形成不利影響，一個雞蛋含有2克的鈣，要保持好的蛋殼品 質(zhì)母雞每天需要攝入4克的鈣，日糧中的鈣只有50-60%用于蛋殼的形成。產(chǎn)蛋雞對鈣的需求 量是非產(chǎn)蛋雞的4-6倍，在產(chǎn)蛋前19 h，雞蛋進入輸卵管-子宮的殼腺區(qū)域，蛋殼不會在蛋白 基質(zhì)上沉積鈣離子。在蛋殼形成的最后15 h，通過殼腺的鈣離子達到100-150 mg/h。鈣來源 于兩個方面：日糧和骨骼。一般血鈣水平是20-30 mg/dl，而母雞日糧中鈣的含量是2%，大約 還要從骨骼中動員30-40%的鈣，此時血鈣濃度是3.56%或者更高。因此在小母雞階段就需要 在機體中貯存高水平的鈣。當殼腺未激活時，腸道從日糧中吸收的鈣是40%，激活后達到 72%。
[0003]蛋殼中磷的含量很少，只有20 mg。磷在蛋殼內(nèi)外層分布不均，磷元素影響CaC〇3的 吸收，參與蛋殼形成的最后階段。血液中的磷含量水平過高會影響骨骼中鈣的代謝，鈣和磷 的吸收相互關(guān)聯(lián)，會受到鈣磷的來源和形式、腸道pH值、鈣磷的比例、維生素 D3等因素的影 響。
[0004] 益生素是活的微生物，它能夠做成不同類型的產(chǎn)品，包括食品、藥品和食品添加 劑。通常用于益生素的菌株為乳酸桿菌和雙歧桿菌，但也有啤酒酵母和一些大腸桿菌和芽 孢桿菌被用于益生素。千百年來乳酸桿菌被利用通過發(fā)酵來進行食品保存，乳酸桿菌具有 雙重的作用不僅用于食品發(fā)酵還有利于人類健康。嚴格來講，名詞"益生素"應(yīng)該是能促進 人類健康的活的微生物。發(fā)酵食品不僅具有特別的味道并且低pH值還能抑制有害微生物的 污染。發(fā)酵已被不同國家的人用于初級農(nóng)產(chǎn)品的保存(谷物、根莖、塊莖，水果和蔬菜，牛奶， 肉，魚等）。
[0005] 有許多研究表明益生素能夠促進骨骼增長，可能是因為益生菌能夠產(chǎn)生酶類和維 生素或者能夠釋放代謝產(chǎn)物，有相當多的維生素像維生素 C、D或K有助于骨基質(zhì)的形成并促 進骨骼的生長。益生素菌株產(chǎn)生的短鏈脂肪酸有助于提高礦物質(zhì)的溶解度，益生菌的發(fā)酵 副產(chǎn)物如丁酸和乳酸可促進腸細胞的繁殖從而增加整個吸收表面。有證據(jù)表明當益生菌添 加劑量合適時宿主機體與鈣結(jié)合和吸收相關(guān)的蛋白就會大量表達。并且，許多最新研究進 展明確的證明了益生菌在改善骨礦物質(zhì)密度方面的作用。研究表明發(fā)酵乳中的瑞士乳酸桿 菌有助于絕經(jīng)期婦女鈣的代謝，這種細菌能夠降低宿主體內(nèi)的甲狀旁腺素，并增加血漿中 鈣的水平。鈣代謝發(fā)生變化可能是因為腸細胞對鈣的吸收增加，選擇合適的益生菌菌株對 于增進該的吸收非常重要，Gilman等研究發(fā)現(xiàn)不僅是嬰兒雙歧桿菌，唾液乳酸桿菌也能用 于促進鈣的吸收。發(fā)表于細胞生理學(xué)的一項研究表明羅伊氏乳酸桿菌可提高血漿中的成骨 細胞數(shù)量，并促進骨質(zhì)的形成。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明的目的在于提供了一株提高蛋殼強度并改善蛋雞生產(chǎn)性能的鼠李糖乳酸 桿菌W27及其應(yīng)用。該菌株能顯著提高產(chǎn)蛋雞蛋殼破碎強度、蛋殼密度和蛋殼相對重量，并 顯著降低破軟殼率;同時該菌株提高了蛋雞的產(chǎn)蛋率，并降低了料蛋比。
[0007] 為實現(xiàn)上述發(fā)明目的，本發(fā)明所采取的技術(shù)方案是： 本發(fā)明提供了一株鼠李糖乳酸桿菌W27,其分類命名為Lactobacillus rhamnosus，已 保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏編號為CGMCC No. 11387。
[0008] 進一步的：所述鼠李糖乳酸桿菌W27革蘭氏染色陽性，呈細長絲狀桿菌；乳白色菌 落，菌落圓形隆起，菌落邊緣整齊。
[0009] 進一步的:所述鼠李糖乳酸桿菌W27兼性厭氧菌生長，生長溫度范圍為26-73°C，生 長pH值范圍為ρΗ5·6-8·7。
[0010] 進一步的:所述鼠李糖乳酸桿菌W27的氧化氫酶試驗、硝酸鹽試驗檢驗均為陰性。
[0011] 本發(fā)明還提供了所述的鼠李糖乳酸桿菌W27在制備用于提高蛋殼強度的微生態(tài)制 劑中的應(yīng)用。
[0012]進一步的：所述鼠李糖乳酸桿菌W27的添加量為1.0 X 104 CFU/g全價料~1.0 X 106 CFU/g全價料。
[0013] 本發(fā)明還提供了所述的鼠李糖乳酸桿菌W27在制備用于改善蛋雞生產(chǎn)性能的微生 態(tài)制劑中的應(yīng)用。
[0014] 進一步的:所述鼠李糖乳酸桿菌W27的添加量為1.0X 104 CFU/g全價料~1 .OX 106 CFU/g全價料。
[0015] 與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果是： 1).本發(fā)明的鼠李糖乳酸桿菌Lactobacillus rhamnosus W27是一株可以促進宿主鈣 磷吸收的益生菌，能夠提高蛋殼強度，對于改善蛋雞生產(chǎn)性能具有重要的意義。
[0016] 2).本發(fā)明菌株是從健康動物分離出來的菌株，安全可靠，并且經(jīng)過反復(fù)的檢查 篩選，證明其可靠穩(wěn)定。
[0017] 3).本發(fā)明菌株是以針對提高蛋殼強度而開發(fā)的菌株，對于促進宿主鈣磷吸收具 有針對性，并且效果良好。
【附圖說明】
[0018] 圖1為鼠李糖乳酸菌Lactobacillus rhamnosus W27的菌體形態(tài)顯微鏡照片； 圖2為鼠李糖乳酸菌Lactobacillus rhamnosus W27的生長曲線。
【具體實施方式】
[0019] 下面結(jié)合具體實施例對本發(fā)明做進一步的說明，但并不局限于此。
[0020] 實施例1、鼠李糖乳酸桿菌Lactobacillus rhamnosus W27的篩選 1、鼠李糖乳酸桿菌Lactobacillus rhamnosus W27從健康雞的盲腸食糜中分離得到： 用無菌載玻片刮取盲腸黏膜于無菌水中，振蕩混勻進行梯度稀釋，MRS培養(yǎng)基傾注培養(yǎng)篩選 "溶鈣圈"明顯的菌落，多次純化后得到單菌落，命名為W27，保存。
[0021] 2、鼠李糖乳酸桿菌Lactobacillus rhamnosus W27的主要特性 菌體形態(tài)特征:革蘭氏染色陽性，呈細長絲狀桿菌，如圖1所示。
[0022] 菌落形態(tài)特征:乳白色菌落，圓形隆起，邊緣整齊。
[0023]生長特征：兼性厭氧菌生長，生長溫度范圍為26-73 °C (最適溫度為38 °C )，生長pH 值范圍為ρΗ5·6-8·7(最適ρΗ6·3)。
[0024]生長曲線：使用MRS液體培養(yǎng)基（蛋白胨2 g/L;酵母浸膏2 g/L;氯化鈉0.1 g/L; K2HPO4 0.04 g/L;KH2P〇4〇.04 g/L;CaCl2.6H2〇 0.01 g/L;MgS〇4.7H20 0.01 g/L;NaHC03 2 g/L;吐溫-80 2 mL/L;氯化血紅素0.02 g/L;維生素 K1 10 yL/L;半胱氨酸鹽酸鹽0.5 g/ L;膽鹽0.5 g/L)37°C條件下培養(yǎng)，結(jié)果表明，3 h-12 h為對數(shù)生長期，12 h進入平臺期，細 菌幾乎停止生長，活菌數(shù)量和凋亡細菌處于一個平衡時期，如圖2所示。
[0025] 3、生化鑒定 根據(jù)《伯杰氏細菌鑒定手冊》，做如下生化試驗:經(jīng)過氧化氫酶試驗、硝酸鹽試驗檢驗均 為陰性，且不液化明膠，不產(chǎn)生11引噪和硫化氫，判定所篩選出的Lactobaci 1 lus rhamnosus W27菌株屬于乳酸菌(Lactobacillus)屬。
[0026] 4、16S rRNA基因測序 使用細菌通用引物(Lane，1991)擴增細菌16S rRNA基因全長序列，PCR反應(yīng)參照寶生物 公司rTaq DNA聚合酶的使用說明書進行，PCR反應(yīng)體系（50 uL)為：Buffer 5 uL;dNTP 4 uL;上下游引物各1 uL;Taq酶0.25 uL;水37.75 uL;模板1 uL。擴增細菌16S rRNA基因全 序列，擴增產(chǎn)物進行測序（Invitrogen，上海）。所述鼠李糖乳酸桿菌亞種(Lactobacillus rhamnosus W27)的16S rRNA基因全序列如SEQ ID No: 1所示。序列的同源性通過互聯(lián)網(wǎng)與 GenBank進行比較（網(wǎng)址：http://www.ncbi .nlm.nih.gov)，比較結(jié)果顯示出所篩選出的 Lactobacillus rhamnosus W27菌株與鼠李糖乳酸桿菌相似度最高，說明其為鼠李糖乳酸 桿菌。
[0027] 將篩選到的菌株W27進行菌種保藏，保藏單位：中國微生物菌種保藏管理委員會普 通微生物中心(CGMCC);地址:北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號，中國科學(xué)院微生物研究所； 保藏日期:2015年9月16日；鼠李糖乳酸桿菌Lactobacillus rhamnosus的保藏編號為CGMCC No. 11387〇
[0028] 實施例2、動物試驗 試驗選擇540只22周齡體重整齊的海蘭褐蛋雞，采用三層全階梯式籠養(yǎng)雞舍(40Χ42Χ 48 cm)，試驗隨機分為對照組、低劑量試驗組和高劑量試驗組，每個處理組6個重復(fù)，每個處 理組60只籠，每只籠3只雞。10只臨近的籠子(共30只雞)被認為是一個試驗重復(fù)。各處理組 飼喂等能等氮日糧，對照組日糧中不添加任何微生態(tài)或添加劑，試驗組日糧中添加 Lactobacillus rhamnosus W27,低劑量試驗組的添加劑量為1.0X104 CFU/g全價料，高劑 量試驗組的添加劑量為1.0 X 1〇6 CFU/g全價料，試驗在半開放式雞舍進行，在9月份和來年 的4月份之間的冬春季節(jié)進行，蛋雞舍室溫在12° C到24° C之間，試驗持續(xù)28周。益生菌劑首 先用混合機與2 kg麩