專利名稱：具有超強抗癌活性的總草苔蟲內(nèi)酯的提取分離方法
技術領域：
本發(fā)明涉及采用乙醇提取法和層析法從海洋生物草苔蟲中提取分離的總草苔蟲內(nèi)酯，抗腫瘤活性試驗顯示對K562腫瘤細胞具有超強的抗癌活性。
草苔蟲又稱苔蘚蟲，屬真體腔動物，是海洋底棲動物的重要組成之一。最常見的種是總合草苔蟲Bugula neritina(Linnaeus,1758)。其群體常附著于船底、魚排及網(wǎng)箱等水下設施上，是海洋主要污損物之一。1982年美國亞利桑那州立大學Pettit教授領導的研究小組成功地從生長于加利福尼亞海域的總合草苔蟲中分離到第一個具有抗癌活性單體，用X-單晶衍射法確定了它的化學結(jié)構(gòu)，為一大環(huán)內(nèi)酯類化合物，并命名為草苔蟲內(nèi)酯1(bryostatin 1)。此后，美國和日本學者又相繼發(fā)現(xiàn)了18種此類成分(bryostatin 1～18)，(詳見1.G.R.Pettit,et al,Tetrahadron,47(22):3601,1991；2.G.R.Pettit,et al,J.Nat.Prod.,59:286,1996)。我們從中國南海產(chǎn)的總合草苔蟲中分離鑒定了一種新的草苔蟲內(nèi)酯，命名為草苔蟲內(nèi)酯19(bryostatin 19)，(詳見林厚文等，中國海洋藥物，17(1):1,1998)。其中bryostatin 1在美國已進入臨床試驗，是極有希望的新型抗癌藥物。
本發(fā)明目的在于利用中國的海洋生物資源，應用新的提取分離方法提取分離出總草苔蟲內(nèi)酯成分，確定其抗癌活性，為研究開發(fā)新的抗癌藥物提供科學依據(jù)。
本發(fā)明是以中國南部海域大量生長的總合草苔蟲為原料，經(jīng)溶劑提取，配合多種層析方法進行分離，得到總草苔蟲內(nèi)酯。具體方法如下將風干的草苔蟲用95％乙醇在室溫下浸漬提取或加熱回流提取，乙醇提取液減壓濃縮至浸膏狀，加入3～5倍量的90％甲醇混懸，混懸液先以石油醚萃取數(shù)次脫酯，經(jīng)萃取后的混懸液加入計算量的蒸餾水，使成40～60％甲醇混懸液，以醋酸乙酯萃取，得醋酸乙酯萃取液，為活性有效部位。該有效部位先經(jīng)硅膠柱層析，以甲醇∶二氯甲烷梯度洗脫(0～10％)，用薄層檢測進行跟蹤，收集含有草苔蟲內(nèi)酯的流份，再經(jīng)一次硅膠柱層析，用石油醚∶丙酮(5∶1→1∶1)或用石油醚∶乙酸乙酯(3∶1→1∶1)洗脫。然后經(jīng)Sephadex LH-20柱層析，以正己烷∶二氯甲烷∶甲醇(4∶5∶1)或用二氯甲烷∶甲醇(1∶1)為洗脫劑，進行洗脫，收集含草苔蟲內(nèi)酯流份，最后經(jīng)ODS反相硅膠快速柱層析，以50-100％甲醇梯度洗脫，收集含草苔蟲內(nèi)酯流份，減壓濃縮，得淺黃色粉末，即總草苔蟲內(nèi)酯。硅膠柱層析和ODS反相柱層析可視具體情況增減次數(shù)。
總草苔蟲內(nèi)酯用高效液相層析儀進行檢測，顯示有9種不同的大環(huán)內(nèi)酯。檢測條件如下Waters 510高效液相色譜儀，PAD996紫外檢測器，Partisil 100DS-2層析柱(9.5×500mm),85％甲醇為洗脫劑，流速2ml/min，檢測波長228.7nm。檢測結(jié)果如

圖1。圖1為總草苔蟲內(nèi)酯高效液相色譜峰中各峰所代表的草苔蟲內(nèi)酯如下1．bryostatin-112．bryostatin-63．bryostatin-5 4．bryostatin-185．bryostatin-196．bryostatin-87．bryostatin-108．bryostatin-49．bryostatin-16
Bryostatin 18 (4) Bryostatin 16 (9)
Bryostatin 19 (5)Bryostatin 11 (1): R1=OCCH3, R2=HBryostatin 6 (2): R1=OCCH2CH2CH3,R2=OCCH3Bryostatin 5 (3): R1=OCC(CH3)3,R2=OCCH3Bryostatin 8 (6): R1=OCCH2CH2CH3,R2=OCCH2CH2CH3Bryostatin 10 (7): R1=OCC(CH3)3,R2=HBryostatin 4 (8): R1=OCC(CH3)3,R2=OCCH2CH2CH3
總草苔蟲內(nèi)酯體外抗癌活性試驗由上海藥物所腫瘤藥理室完成，實驗結(jié)果表明對K562人紅白血病細胞具有超強抑制作用，IC50＜1×10-15μg/ml，對U937人單核粒細胞白血病亦有一定的抑制活性，IC50平均為1.7μg/ml。實驗數(shù)據(jù)如下。
表1總草蟲內(nèi)酯體外對K562細胞抗癌試驗結(jié)果<
表2總草蟲內(nèi)酯體外對U937細胞抗癌試驗結(jié)果<
實驗方法采用臺盼蘭排染法，于96孔板中每孔加入1.2×104/ml濃度的腫瘤細胞，分別加入不同濃度的藥物作用72小時后用臺盼蘭計數(shù)活細胞數(shù)。抑制率=(對照組細胞數(shù)-用藥組細胞數(shù))÷對照組細胞數(shù)×100％。
本發(fā)明具有如下優(yōu)點和積極效果本發(fā)明采用的乙醇提取和醋酸乙酯萃取法成本低，方法簡便，所得的總草苔蟲內(nèi)酯純度高，可達95％以上?？偛萏οx內(nèi)酯對K562腫瘤細胞顯示的超強抑制作用，迄今尚未見過報道，其作用強度是單體內(nèi)酯的約1012倍，可認為是天然產(chǎn)物中對K562腫瘤細胞作用最強的化學成分。因此，將可用于新的抗癌藥物的研制，有助于海洋藥物資源的開發(fā)利用。
實施例1總合草苔蟲70kg(經(jīng)風干)，以5倍量95％乙醇冷浸3次，每次冷浸1周，合并醇提取液，減壓回收乙醇，得醇浸膏，加入10升90％甲醇水液使混懸，用石油醚萃取5次，每次200ml，醇液加計算量的水，使成50％乙醇液，以醋酸乙酯萃取5次，每次200ml，得醋酸乙酯萃取液，減壓回收，得浸膏240g。取60g浸膏進行硅膠柱層析，以二氯甲烷∶甲醇梯度洗脫(1∶0→1∶9)，收集含草苔蟲內(nèi)酯流份，得浸膏9.8g，浸膏再經(jīng)Saphadex LH-20凝膠柱層析(3.8×100cm)，二氯甲烷∶甲醇(1∶1)洗脫，流速60～80ml/h，收集到總草苔蟲內(nèi)酯2.35g。再經(jīng)ODS反相硅膠快速柱層析，以50％→80％甲醇梯度洗脫，收集到總草苔蟲內(nèi)酯1.2g，為淺黃色粉末，得率1.7/10萬。
實施例2總合草蟲13kg(經(jīng)風干)，以95％乙醇提取3次，每次1周，回收乙醇，得醇浸膏815g，混懸于90％甲醇水液，以石油醚萃取5次，每次300ml，甲醇液加水至34％甲醇水液，以醋酸乙酯萃取5次，每次800ml，萃取液經(jīng)活性炭和氧化鋁脫色，回收溶劑，得浸膏6g，硅膠柱層析，以二氯甲烷→二氯甲烷∶甲醇(9∶1)梯度洗脫，收集草苔蟲內(nèi)酯流份，重復一次硅膠柱層析，以石油醚∶醋酸乙酯(3∶1→1∶1)梯度洗脫，得總草苔蟲內(nèi)酯0.3g。再經(jīng)Saphadex LH-20凝膠柱層析，二氯甲烷∶甲醇(1∶1)洗脫，收集到總草苔蟲內(nèi)酯180mg，得率1.4/10萬。
權(quán)利要求
1.一種總草苔蟲內(nèi)酯的提取分離方法，以中國南部海域生長的總合草苔蟲為原料，經(jīng)溶劑提取，配合多種層析方法進行分離，其特征在于將風干的草苔蟲用95％乙醇在室溫下浸漬提取或加熱回流提取，乙醇提取液減壓濃縮至浸膏狀，加入3～5倍量的90％甲醇混懸，混懸液先以石油醚萃取數(shù)次脫酯，經(jīng)萃取后的混懸液加入計算量的蒸餾水，使成40～60％甲醇混懸液，以醋酸乙酯萃取，得醋酸乙酯萃取液，為活性有效部位，該有效部位先經(jīng)硅膠柱層析，以甲醇∶二氯甲烷梯度洗脫(0～10％)，用薄層檢測進行跟蹤，用收集含有草苔蟲內(nèi)酯的流份，再經(jīng)一次硅膠柱層析，用石油醚∶丙酮(5∶1→1∶1)或用石油醚∶乙酸乙酯(3∶1→1∶1)洗脫，然后經(jīng)Sephadex LH-20柱層析，以正己烷∶二氯甲烷∶甲醇(4∶5∶1)或用二氯甲烷∶甲醇(1∶1)為洗脫劑，進行洗脫，收集含草苔蟲內(nèi)酯流份，最后經(jīng)ODS反相硅膠快速柱層析，以50％-100％甲醇梯度洗脫，收集含草苔蟲內(nèi)酯流份，減壓濃縮，得淺黃色粉末，即總草苔蟲內(nèi)酯，第二次硅膠柱層析和ODS反相柱層析可視具體情況增減次數(shù)。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的總草苔蟲內(nèi)酯的提取分離方法，其特征在于提取的總草苔蟲內(nèi)酯包含如下9個組份草苔蟲內(nèi)酯11、草苔蟲內(nèi)酯6、草苔蟲內(nèi)酯5、草苔蟲內(nèi)酯18、草苔蟲內(nèi)酯19、草苔蟲內(nèi)酯8、草苔蟲內(nèi)酯10、草苔蟲內(nèi)酯4和草苔蟲內(nèi)酯16。
全文摘要
本發(fā)明應用乙醇提取法和醋酸乙酯萃取法,配合多種層板分離技術從中國南海產(chǎn)的總合草苔蟲中提取分離出總草苔蟲內(nèi)酯,應用高效液相層析法進行分析,確定了所含的9種草苔蟲內(nèi)酯成分。體外抗癌活性試驗,證明總草苔蟲內(nèi)酯對K562人紅白血病細胞具有超強抑制活性,IC
文檔編號C07D493/22GK1224721SQ9812198
公開日1999年8月4日 申請日期1998年11月11日 優(yōu)先權(quán)日1998年11月11日
發(fā)明者易楊華, 姚新生, 林厚文 申請人:中國人民解放軍第二軍醫(yī)大學, 沈陽藥科大學