一種生產(chǎn)紫杉二烯的系統(tǒng)和微生物及其應用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種生產(chǎn)紫杉二烯的系統(tǒng)和微生物及其應用，屬于合成生物學領(lǐng)域。生產(chǎn)紫杉二烯的系統(tǒng)包含甲羥戊酸途徑和紫杉二烯合成相關(guān)基因或其功能等同體。甲羥戊酸途徑的相關(guān)基因為來源于大腸桿菌BL21的atoB、idi和來源于釀酒酵母INVSC1的erg13、thmg1、erg12、erg8、mvd1；紫杉二烯合成的相關(guān)基因ggpps和ts基因核苷酸序列如SEQIDNO.1和2所示。生產(chǎn)紫杉二烯的微生物為含有生產(chǎn)紫杉二烯的系統(tǒng)的微生物，通過將該系統(tǒng)轉(zhuǎn)化到微生物中得到生產(chǎn)紫杉二烯的微生物。本發(fā)明構(gòu)建的微生物能穩(wěn)定產(chǎn)生紫杉二烯的培養(yǎng)物，為后續(xù)進一步利用微生物產(chǎn)生紫杉醇奠定了基礎(chǔ)，具有廣闊的應用前景。
【專利說明】—種生產(chǎn)紫杉二烯的系統(tǒng)和微生物及其應用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于合成生物學領(lǐng)域，涉及一種生產(chǎn)紫杉二烯的系統(tǒng)和微生物及其應用?！颈尘凹夹g(shù)】
[0002]1963年美國科學家首次從一種太平洋杉樹皮和木材中分離到了紫杉醇的粗提物，并發(fā)現(xiàn)其對鼠腫瘤細胞有很高活性。后來通過I1-1II期臨床研究發(fā)現(xiàn)，紫杉醇主要適用于卵巢癌和乳腺癌，對肺癌、大腸癌、黑色素瘤、頭頸部癌、淋巴瘤、腦瘤也都有一定療效，是現(xiàn)在最有潛能且商業(yè)應用最為成熟的一種抗癌藥?，F(xiàn)今獲得紫杉醇的方法主要有三種:(1)最傳統(tǒng)的從天然植物樹皮中提取，(2)從植物葉片等組織中提取中間產(chǎn)物巴卡亭III等，隨后通過化學合成生產(chǎn)紫杉醇，(3)利用植物組織培養(yǎng)后提取紫杉醇。這三種都是依賴于植物源的方式獲得產(chǎn)物，因而價格一直很高，而且隨著逐年的砍伐，可利用的紅豆杉等植物已經(jīng)越來越少，這很大程度的限制了利用該藥物去治療更多患者。
[0003]自從1993年，首次報道從太平洋紅豆杉樹木中分離到一株能獨立生物合成產(chǎn)生紫杉醇的內(nèi)生真菌以來，國內(nèi)外就有大量的文獻專注于解決紫杉醇的生物合成以及相關(guān)的紫杉烷類化合物這一問題。同時，另外一些科研工作者致力于闡明紫杉醇的合成途徑，但目前仍有至少五步反應的功能基因還未克隆出來，在這些酶中，研究者一致認為催化櫳牛兒基物牛兒基焦磷酸合成紫杉二烯的紫杉二烯合酶(Taxadiene synthase,TS)是合成紫杉二烯的第一個決定性步驟。
[0004]紫杉醇屬于異戊二烯類超家族化合物，至今已報道有超過30000種被鑒定為異戊二烯類。而異戊二烯類超家族化合物都來源于相同的兩個中間產(chǎn)物:異戊烯焦磷酸(IPP, isopentenyl diphosphate)和二甲基烯丙基焦憐酸(DMAPP, dimethylallyldiphosphate)。自然界中存在兩個異戊二烯合成途徑來提供IPP和DMAPP這兩種通用的萜類化合物前體:(I)甲羥戊酸途徑(MVA途徑)，主要存在于高等真核生物(動物，植物線粒體，真菌和酵母等)和部分細菌中，(2)非甲羥戊酸途徑(DXP或MEP途徑)，主要存在于植物質(zhì)體、原生生物和大多數(shù)細菌中，而鏈霉菌、部分植物等同時含有MVA和MEP途徑。近年來，利用改造微生物內(nèi)源的MEP或MVA途徑，或者導入改造的外源MEP或MVA途徑生產(chǎn)萜類化合物引起了人們的廣泛興趣。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明的首要目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)的缺點與不足，提供一種生產(chǎn)紫杉二烯的系統(tǒng)。
[0006]本發(fā)明的另一目的在于提供一種生產(chǎn)紫杉二烯的微生物。
[0007] 本發(fā)明的另一目的在于提供上述生產(chǎn)紫杉二烯的系統(tǒng)或微生物的應用。
[0008]本發(fā)明的再一目的還在于提供一種提高生產(chǎn)紫杉二烯能力的方法。
[0009]本發(fā)明的目的通過下述技術(shù)方案實現(xiàn):
[0010]一種生產(chǎn)紫杉二烯的系統(tǒng)，包含甲羥戊酸途徑和紫杉二烯合成相關(guān)基因或其功能等同體(同功能基因)中的一種或多種。所述的甲羥戊酸途徑的相關(guān)基因包括(I)將乙酰輔酶A縮合為乙酰乙酰輔酶A的基因atoB或其功能等同體、(2)將乙酰輔酶A和乙酰乙酰輔酶A縮合為HMG-CoA的基因ergl3或其功能等同體、(3)將HMG-CoA還原為甲羥戊酸的基因thmgl或其功能等同體、(4)將甲羥戊酸磷酸化為甲羥戊酸-5-磷酸的基因ergl2或其功能等同體、(5)將甲羥戊酸-5-磷酸磷酸化為甲羥戊酸-5-焦磷酸的基因erg8或其功能等同體、(6)將甲羥戊酸-5-焦磷酸脫羧生成異戊烯焦磷酸的基因mvdl或其功能等同體和
(7)將異戊烯焦磷酸異構(gòu)為二甲基烯丙基焦磷酸的基因idi或其功能等同體；所述的紫杉二烯合成的相關(guān)基因包括(8)將異戊二烯焦磷酸和二甲基烯丙基焦磷酸縮合為櫳牛兒基櫳牛兒基焦磷酸的基因櫳牛兒基櫳牛兒基焦磷酸合酶ggpps基因或其功能等同體和(9)將櫳牛兒基櫳牛兒基焦磷酸環(huán)化為紫杉二烯的紫杉二烯合酶ts基因或其功能等同體。
[0011]優(yōu)選的，所述的甲羥戊酸途徑相關(guān)基因或其功能共同體和紫杉二烯合成相關(guān)基因或其功能共同體被設(shè)置在同一個載體或相互不同的載體上。由此，可以進一步提高采用該系統(tǒng)轉(zhuǎn)化微生物的效率。
[0012]所述的甲羥戊酸途徑的相關(guān)基因優(yōu)選為來源于大腸桿菌BL21 (DE3)的atoB(CP001509.3:2216470-2217654)、idi (CP001509.3:2863926-2864474)和來源于釀酒酵母 INVSCl 的 ergl3 (329138949:19060-20535)、 thmgl (329138949:115734-117239)、ergl2 (329138949:684467-685798)、erg8 (329138949:712316-713671)、mvdl(329138953:701895-703085)。
[0013]所述的紫杉二烯合成的相關(guān)基因優(yōu)選為來源于Taxus canadensis (加拿大紅豆杉)經(jīng)過密碼子優(yōu)化的櫳牛兒 基櫳牛兒基焦磷酸合酶ggpps基因(序列如SEQ ID N0.1所示)和來源于Taxus brevifolia (短葉紅豆杉)經(jīng)過密碼子優(yōu)化的紫杉二烯合酶ts基因(序列如 SEQ ID N0.2 所示)。
[0014]一種生產(chǎn)紫杉二烯的微生物為含有上述生產(chǎn)紫杉二烯的系統(tǒng)的微生物。通過將生產(chǎn)紫杉二烯的系統(tǒng)轉(zhuǎn)化到微生物中得到生產(chǎn)紫杉二烯的微生物，通過表達該微生物的基因組中所包含的外源基因，可以使該微生物過表達甲羥戊酸途徑或櫳牛兒基櫳牛兒基焦磷酸合酶或紫杉二烯合酶的至少一種。
[0015]優(yōu)選的，所述的生產(chǎn)紫杉二烯的微生物為將甲羥戊酸途徑相關(guān)基因或其功能共同體和紫杉二烯合成相關(guān)基因或其功能共同體中的一種或多種整合到微生物基因組中。
[0016]所述的微生物為選自真核微生物、原核微生物和病毒的至少一種。
[0017]優(yōu)選的，所述的微生物為選自細菌、真菌、放線菌、螺旋體、支原體、衣原體、立克次體、病毒和酵母的至少一種。
[0018]優(yōu)選的，所述的微生物為絲狀真菌。
[0019]優(yōu)選的，所述的微生物為酵母。
[0020]優(yōu)選的，所述微生物為大腸桿菌。
[0021]優(yōu)選的，所述微生物為芽孢桿菌。
[0022]優(yōu)選的，所述微生物為鏈霉菌。
[0023]優(yōu)選的，所述微生物不含內(nèi)源的甲羥戊酸途徑。
[0024]更優(yōu)選的，所述微生物含有內(nèi)源的甲羥戊酸途徑。
[0025]優(yōu)選的，所述的生產(chǎn)紫杉二烯的微生物為含有質(zhì)粒pMHl、質(zhì)粒pFZ81和質(zhì)粒pXC02的大腸桿菌；所述的質(zhì)粒pMHl啟動子為Iac啟動子，復制子為pl5A復制子,包含atoB、ergl3和thmgl基因，pMHl的序列(不含骨架載體序列)如SEQ ID N0.3所示；所述的質(zhì)粒pFZ81啟動子為Iac啟動子，復制子為pBBRlMCS復制子,包含ergl2、erg8、mvdl和idi基因，PFZ81的序列(不含骨架載體序列)如SEQ ID N0.4所示；所述的質(zhì)粒pXC02啟動子為T7強啟動子，復制子為PSClOl低拷貝復制子，包含ggpps和ts基因，pXC02的序列(不含骨架載體序列)如SEQ ID N0.5所示。
[0026]更優(yōu)選的，所述的生產(chǎn)紫杉二烯的微生物為含有質(zhì)粒pMHl、質(zhì)粒pFZ81和質(zhì)粒PFZ131的大腸桿菌；所述的質(zhì)粒PFZ131包含與pXC02相同的ggpps和ts基因，啟動子為T7強啟動子，只是復制子為PBBR322高拷貝復制子。
[0027]上述生產(chǎn)紫杉二烯的系統(tǒng)或微生物在生產(chǎn)紫杉二烯中的應用。
[0028]—種提聞生廣紫杉二稀能力的方法為增加上述系統(tǒng)中任一基因或其功能等同體的表達。
[0029]合成生物學與代謝工程等的發(fā)展使得在目標微生物中表達外源基因成為可能，通過選擇合適的表達元件能很好的完成外源基因在選定微生物中的表達與功能重建。本發(fā)明以大腸桿菌這一不含甲羥戊酸途徑的微生物為例，通過導入甲羥戊酸途徑相關(guān)基因或功能共同體、櫳牛兒基櫳牛兒基焦磷酸合酶與紫杉二烯合酶成功的在大腸桿菌體內(nèi)合成了紫杉二烯。這表明即使微生物不含甲羥戊酸途徑亦可利用外源導入的甲羥戊酸途徑來用于合成紫杉二烯等萜類化合物， 這類微生物可以是大腸桿菌，芽孢桿菌等含有MEP途徑的微生物。相對于不含甲羥戊酸途徑的微生物，對酵母，絲狀真菌和鏈霉菌等含有內(nèi)源甲羥戊酸途徑的微生物進行甲羥戊酸途徑的改造則更為便捷，可通過表達部分或者全部相關(guān)基因亦或是全部外源的相關(guān)基因以達到改造甲羥戊酸途徑的目的，因此本發(fā)明所建立的甲羥戊酸途徑改造與對櫳牛兒基櫳牛兒基焦磷酸合酶及紫杉二烯合酶的改造完全可以通過選用合適的表達元件在其他微生物中進行重現(xiàn)。目前還無法利用常用微生物直接生產(chǎn)紫杉醇，而利用微生物生產(chǎn)紫杉二烯這一重要的紫杉醇合成中間產(chǎn)物能為今后微生物生產(chǎn)紫杉醇提供一定的指導。
[0030]本發(fā)明相對于現(xiàn)有技術(shù)具有如下的優(yōu)點及效果:本發(fā)明利用外源的甲羥戊酸途徑獲得了穩(wěn)定生產(chǎn)紫杉二烯的大腸桿菌。本發(fā)明構(gòu)建的微生物能穩(wěn)定產(chǎn)生紫杉二烯的培養(yǎng)物，為后續(xù)進一步利用微生物生產(chǎn)紫杉醇奠定了基礎(chǔ)，具有廣闊的應用前景。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0031]圖1是甲羥戊酸途徑示意圖。
[0032]圖2是紫杉二烯合成途徑示意圖。
[0033]圖3是質(zhì)粒pMHl示意圖。
[0034]圖4是質(zhì)粒pFZ81示意圖。
[0035]圖5是質(zhì)粒PFZ131示意圖。
[0036]圖6是質(zhì)粒pXC02示意圖。
[0037]圖7是T2菌株搖瓶發(fā)酵產(chǎn)物GC-MS分析結(jié)果圖。
[0038]圖8是T2與T4菌株生產(chǎn)紫杉二烯的GC-MS分析結(jié)果比較。
[0039]圖9是紫杉二烯定量標準曲線；其中，A是紫杉二烯的標準曲線，Υ=-31766.7+5576.48*X，R Λ 2=0.9911，W:Equal ;B 是內(nèi)標物的標準曲線，Y=-11808.6+11273.7*X, R Λ 2=0.9977, W:Equal。
[0040]圖10是T4菌株紫杉二烯發(fā)酵結(jié)果。
【具體實施方式】
[0041]下面結(jié)合實施例及附圖對本發(fā)明做進一步詳細的描述，但不應理解為對本發(fā)明的限制。若未特別指明，實施例中所用的技術(shù)手段為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的常規(guī)手段。
[0042]通過從大腸桿菌和釀酒酵母基因組DNA中擴增相應基因構(gòu)建了用于大腸桿菌表達的甲羥戊酸途徑和紫杉二烯合成途徑，并實現(xiàn)了重組大腸桿菌Τ2和Τ4穩(wěn)定生產(chǎn)紫杉二烯，相關(guān)反應途徑見圖1和圖2。
[0043]實施例中所用到的引物如表1所示:
[0044]表1引物列表
[0045]·
【權(quán)利要求】
1.一種生產(chǎn)紫杉二烯的系統(tǒng)，其特征在于:包含甲羥戊酸途徑和紫杉二烯合成相關(guān)基因或其功能等同體中的一種或多種。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的生產(chǎn)紫杉二烯的系統(tǒng):其特征在于:所述的甲羥戊酸途徑相關(guān)基因或其功能共同體和紫杉二烯合成相關(guān)基因或其功能共同體被設(shè)置在同一個載體或相互不同的載體上。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的生產(chǎn)紫杉二烯的系統(tǒng)，其特征在于:所述的紫杉二烯合成的相關(guān)基因為經(jīng)過密碼子優(yōu)化的辟》^和ts基因，核苷酸序列分別如SEQ ID N0.1和2所示。
4.一種生產(chǎn)紫杉二烯的微生物,其特征在于:為包含權(quán)利要求1-3任一項所述的系統(tǒng)的微生物，所述的微生物為選自真核微生物、原核微生物和病毒的至少一種。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的微生物，其特征在于:所述的微生物為絲狀真菌、酵母、鏈霉菌、芽孢桿菌或大腸桿菌。
6.根據(jù)權(quán)利要求4所述的微生物，其特征在于:所述的微生物為基因組DNA中整合了權(quán)利要求1-3任一項所述的系統(tǒng)的核酸序列一種或多種。
7.根據(jù)權(quán)利要求4所述的微生物，其特征在于:所述的微生物為含有質(zhì)粒pMHl、質(zhì)粒PFZ81和質(zhì)粒pXC02的大腸桿菌；所述的質(zhì)粒pMHl啟動子為Iac啟動子，復制子為pl5A復制子，包含aioS、ergl3和thmgl基因；所述的質(zhì)粒pFZ81啟動子為Iac啟動子，復制子為pBBRlMCS復制子，包含ergl2、erg8、mvdl和idi基因；所述的質(zhì)粒pXC02啟動子為T7強啟動子，復制子為PSClOl低拷貝復制子，包含辟pas和ts基因；或為含有質(zhì)粒pMHl、質(zhì)粒pFZ81和質(zhì)粒pFZ131的大腸桿菌；所述的質(zhì)粒pFZ131啟動子為T7強啟動子，復制子為pBBR322高拷貝復制子,包含ggpps和ts基因。
8.權(quán)利要求4-7任一項所述的微生物的制備方法，其特征在于包含如下步驟:將權(quán)利要求1-3任一項所述的系統(tǒng)轉(zhuǎn)化微生物中。
9.權(quán)利要求1-3任一項所述的系統(tǒng)或權(quán)利要求4-7一項所述的微生物在生產(chǎn)紫杉二烯中的應用。
10.一種提高生產(chǎn)紫杉二烯能力的方法，其特征在于:增加權(quán)利要求1-3任一項所述的系統(tǒng)中的任一基因或其功能等同體的表達。
【文檔編號】C12N15/11GK103571835SQ201310595448
【公開日】2014年2月12日 申請日期:2013年11月22日 優(yōu)先權(quán)日:2013年11月22日
【發(fā)明者】劉天罡, 朱發(fā)銀, 曹小迎, 張宇琛, 卞光凱, 鄧子新 申請人:武漢大學