專利名稱：細(xì)胞培養(yǎng)生產(chǎn)紫杉醇的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種通過細(xì)胞培養(yǎng)而生產(chǎn)紫杉醇的方法，具體講是以植物細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)為手段，通過在細(xì)胞生物反應(yīng)器內(nèi)進行的東北紅豆杉大規(guī)模細(xì)胞培養(yǎng)生產(chǎn)紫杉醇的方法。本發(fā)明屬于生物制藥領(lǐng)域。
紫杉醇(Taxol)作為治療腫瘤的有效藥物之一，其巨大的市場需求與其原料來源的匱乏，使得運用植物細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)技術(shù)分離提取藥用成份紫杉醇的產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)研究，成為近些年來新藥研究的重要課題之一。自1971年國際上首次出現(xiàn)從紅豆杉樹皮中分離出紫杉醇至今，由于其天然含量極低，紫杉醇的原料保障就成為該藥能否成功走向市場的關(guān)鍵所在。為此，除天然提取方法外，化學(xué)半合成和全合成研究亦取得進展，而運用植物組織細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)研究開發(fā)紫杉醇一直是現(xiàn)代高技術(shù)醫(yī)藥領(lǐng)域研究的核心問題。
與其它化合物不同，紫杉醇及其紫杉烷類化合物是迄今為止僅見于裸子植物紅豆杉科(Taxaceae)的紅豆杉屬(Taxus)中。紅豆杉是一種生長極其緩慢的古老木本植物，在我國屬一類保護植物，是優(yōu)良樹種之一，同時也是園林綠化及觀賞樹種。紅豆杉屬植物在世界上有11種1變種，在我國分布有4種1變種，即西藏紅豆杉(Taxus Wallichiana zucc)，云南紅豆杉(T.yunnanensis cheng et L.K.Fu)，東北紅豆杉(T.cuspidate sieb et zucc，又稱日本紫杉，Japanese yew)、紅豆杉(T.Chinensis(pilger)Reid)和南方紅豆杉(T.Chinensis uar mairei(Lem’ee et ievel)Cheng et L.K.Fu)。樹皮提取紫杉醇是唯一商業(yè)來源。從干樹皮中提取1g紫杉醇需3-6棵60齡大樹，而要提取1kg紫杉醇則要砍伐1000-2000棵樹。要滿足治療一個患者，則需要1-2g的紫杉醇?，F(xiàn)今國際市場對紫杉醇年需求量為500kg，并且這一需求正日益增加。紫杉醇市場需求量大，靠剝?nèi)淦せ蚩撤淠咎崛∫严喈?dāng)困難。即使將全部天然資源采伐，也只能滿足短期臨床需要，且會造成對森林和人類自下而上環(huán)境及生物多樣性不可彌補損失。由于天然樹皮中紫杉醇含量極低，約占干重的0.01～0.02％，因此紫杉醇的原料保障就成為該藥能否成功走向市場的最為關(guān)鍵因素。圍繞這一問題，國內(nèi)外在下述幾方面開展了研究工作化學(xué)合成或半合成，天然種植和組織與細(xì)胞培養(yǎng)等方面。
化學(xué)全合成是另一個獲得紫杉醇的途徑，但全合成需20-25步，紫杉醇化學(xué)合成方法已取得初步成果，年總產(chǎn)率僅4-5％，成本高。
此外，隨著10-脫乙酰漿果赤霉素III(BaccatinIII)和15-羥基-10-脫乙酰漿果赤霉素III的發(fā)現(xiàn)，為紫杉醇的半合成和在此基礎(chǔ)上進行改造生產(chǎn)紫杉醇類似物的研究提供了可能并取得了階段性成果。由于紫杉醇和半合成前體均需從天然植物中取得，所以天然資源(栽植)和組織培養(yǎng)等研究特別是組織細(xì)胞培養(yǎng)研究仍然處于紫杉醇資源研究的核心位置，而后者則是重中之重。
我們經(jīng)多年的時間，在分析、研究國內(nèi)外紫杉醇研究成果的基礎(chǔ)上，系統(tǒng)地研究了植物組織細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)應(yīng)用到東北紅豆杉有效藥物紫杉醇生產(chǎn)的理論、工藝及可行性，包括從材料選擇、外植體誘導(dǎo)、高頻細(xì)胞株的保存、懸浮培養(yǎng)系的建立到分離、純化等過程，完成了實驗室和中試研究，實現(xiàn)了一個培養(yǎng)周期可收獲紫杉醇80.3％mg/L的結(jié)果，使下一步產(chǎn)業(yè)化具有實際意義并為此提供了可能與保障。
本發(fā)明的目的，在于提供一種提高東北紅豆杉細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)生產(chǎn)紫杉醇的方法，該方法不僅能明顯提高東北紅豆杉細(xì)胞培養(yǎng)液中紫杉醇的含量，而且更有利于達到產(chǎn)業(yè)化水平。
本項目經(jīng)多年研究，依東北紅豆杉培養(yǎng)細(xì)胞產(chǎn)生紫杉醇的特殊機理首創(chuàng)了采用看護培養(yǎng)和細(xì)胞懸浮培養(yǎng)相結(jié)合的半連續(xù)細(xì)胞培養(yǎng)方式，同時在培養(yǎng)液中附加了有機成分，合理組配很好地控制了細(xì)胞的生長過程，縮短了緩慢生長期，延長了平穩(wěn)生長期，進而縮短了培養(yǎng)周期，降低了成本，提高紫杉醇產(chǎn)量。此外，對細(xì)胞培養(yǎng)液的預(yù)處理采用有機溶劑分段處理法進行萃取、濃縮培養(yǎng)液到最后柱層大大減少了紫杉醇的損失量。
為了實現(xiàn)本發(fā)明的目的，本發(fā)明的技術(shù)路線如下將東北紅豆杉的外植體進行離體培養(yǎng)，篩選高產(chǎn)細(xì)胞株，轉(zhuǎn)入細(xì)胞種子培養(yǎng)，爾后進行細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)。細(xì)胞培養(yǎng)液經(jīng)過分離，萃取純化等處理，得到紫杉醇晶體。
具體來說，在MB培養(yǎng)基上進行愈傷組織誘導(dǎo)和高產(chǎn)細(xì)胞株的篩選，在1/2MB培養(yǎng)基上進行細(xì)胞種子培養(yǎng)和細(xì)胞反應(yīng)器內(nèi)的大規(guī)模細(xì)胞培養(yǎng)。特別是，在MB培養(yǎng)基上附加NAA、IAA、KT條件下進行東北紅豆杉高產(chǎn)細(xì)胞株的篩選，在1/2MB培養(yǎng)基上附加NAA、IAA、KT條件下進行東北紅豆杉細(xì)胞種子培養(yǎng)和細(xì)胞反應(yīng)器的大規(guī)模培養(yǎng)。
在上述基礎(chǔ)上的東北紅豆杉愈傷組織繼代保存20天為一周期，細(xì)胞種子培養(yǎng)10天為一繼代周期，細(xì)胞反應(yīng)器培養(yǎng)20-25天為一周期。
上述所說的MB培養(yǎng)基組成為MS培養(yǎng)基大量元素+B5培養(yǎng)基微量元素；1/2MB培養(yǎng)基組成為MS培養(yǎng)基大量元素減半+B5培養(yǎng)基微量元素。
所添加的NAA、IAA、KT用量為NAA 0.5-5.0mg/L、IAA 0-3.0mg/L、KT 0-1.5mg/L。
上述的培養(yǎng)基中需添加蔗糖1.5-2.5％，并調(diào)PH值4.5-7.5。
上述的培養(yǎng)條件為8h/d光照，2000Lx光照強度，溫度24℃±1。
培養(yǎng)結(jié)束后采用`H-NMR，13C-NMR，HMQC，HMBC以及CD譜對紫杉醇平面和立體結(jié)構(gòu)進行測定。
本發(fā)明的最佳離體培養(yǎng)條件是MB培養(yǎng)基附加NAA1.Omg/L+IAA 2.5mg/L+KT1.0mg/L+2％糖本發(fā)明的最佳細(xì)胞培養(yǎng)條件是1/2MB培養(yǎng)基，其它組成同上。
本發(fā)明提出的東北紅豆杉大規(guī)模培養(yǎng)的方法是采用5L氣升式細(xì)胞反應(yīng)器(中國科學(xué)院生化中心有售)作種子罐，培養(yǎng)10-15天，培養(yǎng)條件為溫度24±1℃-28±1℃，最佳為26±1℃，光照最佳時間為8小時/天，光照強度800-1500LX，最佳為1000LX。以20L氣升式細(xì)胞反應(yīng)器作生產(chǎn)罐。培養(yǎng)條件為培養(yǎng)溫度為24℃±1，光照8h/d。光照強度2000LX，培養(yǎng)時間20-25天，每隔8-10天進行補加營養(yǎng)，每次添加1/2MB 100-500ml。
本發(fā)明的分離和純化過程如下細(xì)胞培養(yǎng)液下罐后，經(jīng)過旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)，濃縮至1/2-1/4體積，加入萃取液三氯甲烷或四氯甲烷，加入量為按1∶1體積比加入，每天搖動2-5次，于30℃以下靜置20-40小時，隔2天水洗一次脂相，去掉水相，重復(fù)5次，在30℃以下烘干，得干燥物，通過HPLC過柱，獲得紫杉醇晶體。
本發(fā)明運用植物細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)分離提取紫杉醇意義十分重大(1)解決了紫杉醇的原料來源，保護了東北紅豆杉自然資源，無任何環(huán)境污染；(2)滿足日益增長的臨床試驗和醫(yī)療用藥，為廣大患者提供大量的具顯著療效的新型抗癌藥物；(3)紫杉醇生產(chǎn)是在傳統(tǒng)的提取及化學(xué)合合成和半合成以外的一種運用植物細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)開發(fā)現(xiàn)代中藥的一次革命；(4)在生物反應(yīng)器內(nèi)生產(chǎn)、調(diào)控，從細(xì)胞培養(yǎng)液中分離產(chǎn)物，節(jié)省了場地、節(jié)約了時間、降低了生產(chǎn)成本、提高了產(chǎn)量。最終實現(xiàn)讓中國普通老百姓都能享用到運用現(xiàn)代高新技術(shù)生產(chǎn)抗癌藥物紫杉醇的目的。
與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的技術(shù)路線所達到的先進結(jié)果分析如下
實施例以MS培養(yǎng)基大量元素+B5培養(yǎng)基微量元素組成配制MB培養(yǎng)基，并按NAA 0.5-5.0mg/L、IAA 0-3.0mg/L、KT 0-1.5mg/L的添加量添加NAA、IAA、KT。在此條件下進行東北紅豆杉高產(chǎn)細(xì)胞株的篩選，將篩選出的高產(chǎn)細(xì)胞株在1/2MB培養(yǎng)基上進行細(xì)胞種子培養(yǎng)，該1/2MB培養(yǎng)基組成為MS培養(yǎng)基大量元素減半+B5培養(yǎng)基微量元素，并按NAA 0.5-5.0mg/L、IAA 0-3.0mg/L、KT 0-1.5mg/L的添加量添加NAA、IAA、KT。將培養(yǎng)的種子在細(xì)胞反應(yīng)器內(nèi)進行大規(guī)模細(xì)胞培養(yǎng)。培養(yǎng)基是1/2MB，該1/2MB培養(yǎng)基組成為MS培養(yǎng)基大量元素減半+B5培養(yǎng)基微量元素，并按NAA 0.5-5.0mg/L、IAA 0-3.0mg/L、KT 0-1.5mg/L的添加量添加NAA、IAA、KT。還需添加蔗糖1.5-2.5％，并調(diào)PH值4.5-7.5。附加NAA、IAA、KT條件下進行東北紅豆杉細(xì)胞種子培養(yǎng)和細(xì)胞反應(yīng)器的大規(guī)模培養(yǎng)。大規(guī)模培養(yǎng)的方法是采用5L氣升式細(xì)胞反應(yīng)器(中國科學(xué)院生化中心有售)作種子罐，培養(yǎng)10-15天，培養(yǎng)條件為溫度24±1℃-28±1℃，最佳為26±1℃，光照最佳時間為8小時/天，光照強度800-1500LX，最佳為1000LX。以20L氣升式細(xì)胞反應(yīng)器作生產(chǎn)罐。培養(yǎng)條件為培養(yǎng)溫度為24℃±1，光照8h/d。光照強度2000LX，培養(yǎng)時間20-25天，每隔8-10天進行補加營養(yǎng)，每次添加1/2MB 100-500ml。
細(xì)胞培養(yǎng)液下罐后，經(jīng)過旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)，濃縮至1/2-1/4體積，加入萃取液三氯甲烷或四氯甲烷，加入量為按1∶1體積比加入，每天搖動2-5次，于30℃以下靜置20-40小時，隔2天水洗一次脂相，去掉水相，重復(fù)5次，在30℃以下烘干，得干燥物，通過HPLC過柱，獲得紫杉醇晶體。
權(quán)利要求
1.一種通過細(xì)胞培養(yǎng)生產(chǎn)紫杉醇的方法，其特征在于該方法包括在MB培養(yǎng)基上進行愈傷組織誘導(dǎo)和高產(chǎn)細(xì)胞株的篩選，在1/2MB培養(yǎng)基上進行細(xì)胞種子培養(yǎng)和細(xì)胞反應(yīng)器內(nèi)的大規(guī)模細(xì)胞培養(yǎng)，其中在MB培養(yǎng)基和1/2MB培養(yǎng)基上添加NAA、IAA、KT。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其特征在于其中的東北紅豆杉愈傷組織繼代保存20天為一周期，細(xì)胞種子培養(yǎng)10天為一繼代周期，細(xì)胞反應(yīng)器培養(yǎng)20-25天為一周期。
3.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其特征在于其所說的MB培養(yǎng)基組成為MS培養(yǎng)基大量元素+B5培養(yǎng)基微量元素。
4.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其特征在于所說的1/2MB培養(yǎng)基組成為MS培養(yǎng)基大量元素減半+B5培養(yǎng)基微量元素。
5.據(jù)權(quán)利要求1的方法，其特征在于所說的MB培養(yǎng)基和1/2MB培養(yǎng)基當(dāng)中還添加NAA 0.5-5.0mg/L、IAA 0-3.0mg/L、KT 0-1.5mg/L，蔗糖1.5-2.5％，并調(diào)PH值4.5-7.5。
6.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其特征在于所說的培養(yǎng)條件為8h/d光照，2000Lx光照強度，溫度24℃±1。
7.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其特征在于所說的大規(guī)模細(xì)胞培養(yǎng)采用20L氣升式細(xì)胞反應(yīng)器進行培養(yǎng)。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種運用植物細(xì)胞培養(yǎng)手段,從東北紅豆杉細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)中生產(chǎn)紫杉醇的方法。該方法是在MB培養(yǎng)基上由東北紅豆杉愈傷組織中篩選出高產(chǎn)細(xì)胞株,接種到1/2MB培養(yǎng)基上進行細(xì)胞種子培養(yǎng)和細(xì)胞反應(yīng)器大規(guī)模培養(yǎng)。在MB和1/2MB培養(yǎng)基中附加IAA、KT和NAA條件下進行細(xì)胞培養(yǎng)。然后對細(xì)胞反應(yīng)器中的細(xì)胞培養(yǎng)液進行分離純化,獲取紫杉醇含量達0.9%。純度98%。解決了紫杉醇生產(chǎn)的原料問題。易操作,生產(chǎn)成本低,不污染環(huán)境,達到了產(chǎn)業(yè)化水平。
文檔編號C12N5/04GK1367254SQ01102278
公開日2002年9月4日 申請日期2001年1月21日 優(yōu)先權(quán)日2001年1月21日
發(fā)明者賈景明, 張劍俠 申請人:沈陽泰澤植物細(xì)胞培養(yǎng)有限公司