專利名稱：通過分批或半連續(xù)培養(yǎng)大量生產(chǎn)紫杉醇的方法
本申請是申請日為1996年4月27日的中國專利申請96190419.4(PCT/KR96/00060)的分案申請。
另一方面，已采用全化學合成、半合成和提取方法制備紫杉醇。
然而，全化學合成法尚未實際應用，因為其需要非常昂貴的化學試劑并且收率也不是很高，這一點可從紫杉醇的復雜化學結構預料到。
采用前體如10-脫乙?；鶟{果赤霉素III的半合成方法已被證明存在一些缺點，因為其需要復雜而繁多的從紫杉屬植物中分離和純化紫杉醇前體并將前體轉化成紫杉醇的步驟。
考慮到這些方面，現(xiàn)有技術中主要采用經(jīng)濟的提取方法，通過該方法可直接從紫杉屬植物中分離紫杉醇。然而，所述方法已證明也存在令人不滿意之處，即其需要大量的紫杉樹來純化紫杉醇，由此最終導致嚴重的環(huán)境破壞。
因此，用全化學合成、半合成和提取方法提供用于世界范圍的化學治療學用途的紫杉醇得不到保證，仍非常有必要開發(fā)生產(chǎn)紫杉醇的其它方法。
作為一種很有潛力的解決所述問題的方法，細胞培養(yǎng)生產(chǎn)紫杉醇的方法已在現(xiàn)有技術中有提議。
不同于現(xiàn)有技術，基于細胞培養(yǎng)的生產(chǎn)紫杉醇的方法具有如下優(yōu)點首先，可以以穩(wěn)定的方式生產(chǎn)紫杉醇，而不受枯萎病和害蟲等導致供給的紫杉屬植物不穩(wěn)定的影響；第二，細胞培養(yǎng)物可在大的生物反應器中繁殖，由此通過控制培養(yǎng)條件可以大量生產(chǎn)紫杉醇；第三，與其它現(xiàn)有技術方法相比，細胞培養(yǎng)物能生產(chǎn)光譜較簡單的化合物，大大地簡化了分離和純化過程；第四，細胞培養(yǎng)法可以比其它方法更好地迅速適應需求量的快速變化；第五，細胞培養(yǎng)法可以生產(chǎn)紫杉醇以及能轉化為紫杉醇的紫杉烷前體如漿果赤霉素。
現(xiàn)有技術中已描述了利用培養(yǎng)的植物細胞生產(chǎn)紫杉醇的方法USP5,019,504公開了一種利用短葉紫杉的培養(yǎng)細胞生產(chǎn)紫杉醇及其衍生物的方法，然而，其中所述的紫杉醇產(chǎn)量為1-3mg/L，不足以工業(yè)應用。另外，通過該細胞培養(yǎng)物生產(chǎn)紫杉醇不穩(wěn)定，甚至即使通過選擇可獲得高產(chǎn)率的初級細胞，通過次級培養(yǎng)也很難保持其含量(見E.R.M.Wickremesine等，細胞和組織培養(yǎng)世界會議(1992))。
USP5,015,744教導了一種從漿果赤霉素III(一種生物合成紫杉醇的前體)進行半合成的方法，通過使用植物組織培養(yǎng)物，可以生產(chǎn)用于半合成方法的原料如漿果赤霉素III，因此，該植物組織培養(yǎng)物也可用于通過上述半合成方法生產(chǎn)紫杉醇。
WQ 93/17121提供了一種通過紫杉屬植物的細胞培養(yǎng)同時改變培養(yǎng)基的組成、生長速率和生產(chǎn)速率等而生產(chǎn)紫杉醇的方法，在應用中國紫杉(Taxuschinensis)的情況下，在生物量每2.5天加倍的18天的培養(yǎng)物中可獲得24.1mg/L的紫杉醇。
所有這些專利描述的均是通過采用分批培養(yǎng)大量生產(chǎn)紫杉醇的方法，在所述的專利中沒有教導也沒有預期生產(chǎn)紫杉醇的細胞系的半連續(xù)培養(yǎng)。
在這種情況下，USP5,407,816描述了將中國紫杉細胞接種到營養(yǎng)培養(yǎng)基中形成懸液，然后培養(yǎng)該懸液以形成懸浮培養(yǎng)物，該懸浮培養(yǎng)物又在其它營養(yǎng)培養(yǎng)基中次級培養(yǎng)以形成生產(chǎn)培養(yǎng)物，該生產(chǎn)培養(yǎng)物最終以153mg/L的收率生產(chǎn)出紫杉醇和紫杉烷。所述的方法顯著提高了紫杉醇的產(chǎn)率，但是已證明該方法仍有不令人滿意之處，即其需要許多組成非常復雜的營養(yǎng)培養(yǎng)基，并且高產(chǎn)率僅在相當受限的生長條件下才能達到。
因此，仍需要開發(fā)一種實用簡便的生產(chǎn)紫杉醇的方法，該方法應能滿足高產(chǎn)率的要求，而這一點是決定該方法能否適于工業(yè)應用的主要因素。
本發(fā)明的一個主要目的在于提供一種通過半連續(xù)培養(yǎng)大量生產(chǎn)紫杉醇的方法。
本發(fā)明的另一個目的在于提供一個從中國紫杉分離出的新的生產(chǎn)紫杉醇的細胞系。
圖2示出檸檬酸銨對紫杉醇產(chǎn)率的影響的圖表。
圖3示出麥芽糖對紫杉醇產(chǎn)率的影響的圖表。
圖4示出在SYG-1半連續(xù)培養(yǎng)中的紫杉醇產(chǎn)率與培養(yǎng)循環(huán)的關系。
隨后，本發(fā)明人優(yōu)化了本發(fā)明的細胞系的生長條件，并確定SYG-1細胞在B5培養(yǎng)基上生長良好，更優(yōu)選是補加20μM NAA(萘氧基乙酸)、0.4μM BAP(6-芐基氨基嘌呤)、1g/L酪素水解物和30g/L蔗糖的B5培養(yǎng)基，培養(yǎng)條件為溫度24℃，搖瓶速度為150rpm。另外，還檢測了AgNO3、檸檬酸銨和麥芽糖對紫杉醇產(chǎn)率的影響，本發(fā)明人總結出添加這些物質(zhì)能顯著提高紫杉醇的產(chǎn)率。
根據(jù)本發(fā)明，通過采用SYG-1的半連續(xù)培養(yǎng)可以高收率制備紫杉醇，該方法包括(i)將紫杉屬植物細胞接種到含1-10％(重量/體積)糖的培養(yǎng)基中并保溫培養(yǎng)；以及，(ii)將1/10-1/2體積的步驟(i)得到的培養(yǎng)物轉移到新鮮培養(yǎng)基中并重復步驟(i)，向剩余的培養(yǎng)物中加入1-10％(重量/體積)糖并培養(yǎng)至紫杉醇最大產(chǎn)量時間。
在開始培養(yǎng)時可以將AgNO3以1-15μM、優(yōu)選5-10μM的濃度加入到紫杉屬植物細胞培養(yǎng)物中并培養(yǎng)10-20天，更優(yōu)選10-15天。另外，可以在培養(yǎng)后5-30天、更優(yōu)選5-10天將檸檬酸銨和麥芽糖分別以1-15mM、更優(yōu)選1-10mM和1-10％(重量/體積)、更優(yōu)選1-5％(重量/體積)的濃度加入到培養(yǎng)物中。
培養(yǎng)5-30天后，將1/10-1/2體積的總培養(yǎng)物轉移到含新鮮培養(yǎng)基的培養(yǎng)瓶中開始循環(huán)培養(yǎng)，該新鮮培養(yǎng)基的成分與培養(yǎng)開始時采用的培養(yǎng)基成分相同。然后，向相當于總培養(yǎng)物的9/10-1/2體積的剩余的培養(yǎng)物中加入1-10％(重量/體積)、更優(yōu)選1-5％(重量/體積)麥芽糖，培養(yǎng)30-60天，此時紫杉醇產(chǎn)量達到最高，培養(yǎng)溫度為24℃、搖瓶速度為150rpm，并在暗處培養(yǎng)。
本發(fā)明方法中所用的紫杉屬植物包括短葉紫杉，加拿大紫杉(Taxuscanadensis)、東北紫杉(Taxus cuscidata)、歐洲紫杉(Taxus baccata)、Taxusglobosa、佛羅里達紫杉(Taxus floridana)、喜馬拉雅紫杉(Taxus wallichiana)、Taxus media和中國紫杉，然而，最優(yōu)選采用的是本發(fā)明人新開發(fā)的中國紫杉SYG-1。
根據(jù)本發(fā)明，當采用中國紫杉SYG-1半連續(xù)培養(yǎng)并添加提高紫杉醇產(chǎn)率的AgNO3、檸檬酸銨和麥芽糖時，在培養(yǎng)42-49天后觀察到紫杉醇的產(chǎn)率達到300mg/L的水平。紫杉醇的定量分析在下表1所述的具體條件下，用高效液相色譜定量分析根據(jù)本發(fā)明的方法從中國紫杉SYG-1培養(yǎng)物中生產(chǎn)的紫杉醇。
表1紫杉醇定量分析的條件
在下述實施例中將對本發(fā)明進行進一步描述，實施例不應看作是對本通過將愈傷組織分別轉移到現(xiàn)有技術中公知的幾種培養(yǎng)基中，例如MS(見Murashige，T.和F.Skoog，F(xiàn).，植物生理學，5473(1962))，SH(見Schenk和Hilderbrandt，加拿大植物學雜志，50199-204(1972))，WPM(見Lloyd和Mccown，Int.Plant Prop.Soc.Proc.，30421-427(1981))和B5培養(yǎng)基(見上述)，并肉眼觀察愈傷組織的生長模式而選擇愈傷組織的生長培養(yǎng)基。從上述結果可以確定愈傷組織在含20μM NAA、0.4μM BAP和2g/L酪素水解物的B5培養(yǎng)基上生長良好。
隨后，對如此誘導的細胞系進行形態(tài)學、生理學和生長條件的研究，并與現(xiàn)有技術中公知的細胞系進行比較，結果示于表2和表3。如表2和表3所示，可以確定本發(fā)明開發(fā)的細胞系在紫杉醇產(chǎn)率和紫杉醇分泌模式等方面明顯區(qū)別于現(xiàn)有技術中的細胞系。因此，該細胞系被命名為中國紫杉SYG-1，并在1996年3月14日保藏于國際保藏機構(IDA)韓國典型培養(yǎng)物保藏中心(KCTC)，入藏號為KCTC 0232BP。表2 中國紫杉SYG-1的形態(tài)學和生長條件
表3本發(fā)明的細胞系與現(xiàn)有技術的細胞系的特征比較
實施例2 SYG-1的懸浮培養(yǎng)為選擇用于SYG-1懸浮培養(yǎng)的最優(yōu)選的培養(yǎng)基，將細胞系分別轉移到MS、SH、WPM和B5培養(yǎng)基中，與實施例1類似觀察生長模式，其結果是，與愈傷組織類似，SYG-1細胞在含20μM NAA、0.4μM BAP和2g/L酪素水解物的B5培養(yǎng)基上生長良好。另外，還確定了SYG-1細胞在24℃的培養(yǎng)溫度和150rpm的搖瓶速度下生長良好。
在固化培養(yǎng)基的情況下每4周進行愈傷組織的系列培養(yǎng)，同時借助于鑷子將部分轉移將一片愈傷組織保留在固體培養(yǎng)基平板上。隨后將保留在固體培養(yǎng)基上的愈傷組織接種到少量B5培養(yǎng)基中，并且隨著細胞生長至增加培養(yǎng)物的總體積，向其中補加少量培養(yǎng)基。而后以1/5(體積/體積)的比率將生長良好的細胞系在裝于500ml Erlenmeyer培養(yǎng)瓶中的改良的B5培養(yǎng)基中稀釋，并每2周接種到懸浮培養(yǎng)基中。實施例3 AgNO3對紫杉醇產(chǎn)率的影響業(yè)已熟知AgNO3是作用于植物細胞生長和二級代謝物產(chǎn)生的植物激素乙烯的拮抗劑，因此，本發(fā)明測試了AgNO3對SYG-1懸浮培養(yǎng)中紫杉醇的生產(chǎn)的影響。
向-250ml錐形培養(yǎng)瓶中加入75ml含10μM AgNO3的B5培養(yǎng)基，將25ml 14天的細胞培養(yǎng)物接種到此培養(yǎng)基中并以實施例2所述類似的方式培養(yǎng)，然后，將紫杉醇的產(chǎn)率與不含AgNO3的對照進行對比(見

圖1)。如圖1所示，可以很清楚地確定，當向培養(yǎng)基中加入AgNO3時紫杉醇的產(chǎn)率98.95mg/L(-●-)是對照(-○-)的4.7倍。實施例4 檸檬酸銨對紫杉醇產(chǎn)率的影響在加入檸檬酸銨后監(jiān)測SYG-1懸浮培養(yǎng)物中的紫杉醇產(chǎn)率。向一250ml Erlenmeyer培養(yǎng)瓶中加入75ml B5培養(yǎng)基，將25ml 14天的細胞培養(yǎng)物接種到此培養(yǎng)基中并以實施例2所述相同的生長條件培養(yǎng)，然后，在培養(yǎng)9天后向培養(yǎng)物中加入5mM檸檬酸銨，將紫杉醇的產(chǎn)率與未加檸檬酸銨的對照進行對比(見圖2)。如圖2所示，可以確定，當向培養(yǎng)基中加入檸檬酸銨時紫杉醇的產(chǎn)率約為103.6mg/L(-●-)，其是對照(-○-)的4.9倍。實施例5 麥芽糖對紫杉醇產(chǎn)率的影響已熟知在植物細胞培養(yǎng)物中提高糖的濃度能導致二級代謝物的增加，例如，據(jù)報道在野胡蘿卜(Daucus carota)的愈傷組織培養(yǎng)物中加入3％(重量/體積)蔗糖和5％(重量/體積)甘露醇提高了單花青苷(antocyanin)的產(chǎn)率(見Knobloch，K.-H.等，Zeiteshrift fur Natruforschung，35c55-556(1981))；在葡萄(Vitis vinifera)的懸浮培養(yǎng)物中加入88mM蔗糖和165mM甘露醇提高了單花青苷的產(chǎn)率(見Rajendran，L.等，Biotechnology Letters，14(8)707-712(1992))。另一方面，還報道了當糖的加入量超過一定濃度時生長和二級代謝物的產(chǎn)量均下降，這可能是由于滲透應力造成(見DO，C.B.和Cormier，F(xiàn).，Plant Cell Reports，9500-504(1990))。
評價麥芽糖加入到SYG-1中的效果。
向一250ml錐形培養(yǎng)瓶中加入75ml B5培養(yǎng)基，將25ml 14天的細胞培養(yǎng)物接種到此培養(yǎng)基中并以實施例2所述相同的生長條件培養(yǎng)，然后，分別在培養(yǎng)9天和21天后向培養(yǎng)物中加入2％(重量/體積)和3％(重量/體積)麥芽糖，將紫杉醇的產(chǎn)率與不含麥芽糖的對照進行對比(見圖3)。如圖3所示，可以確定，當向培養(yǎng)基中加入麥芽糖時紫杉醇的產(chǎn)率約為112.75mg/L(-●-)，其是對照(-○-)的5.3倍。實施例6 SYG-1的半連續(xù)培養(yǎng)基于實施例2-5得到的結果，采用SYG-1的半連續(xù)培養(yǎng)制備紫杉醇。
向一250ml錐形培養(yǎng)瓶中加入80ml B5培養(yǎng)基和20ml 14天的細胞培養(yǎng)物，在培養(yǎng)開始時加入10μM AgNO3，然后，在培養(yǎng)9天后向培養(yǎng)物中加入5mM檸檬酸銨和2％(重量/體積)麥芽糖，培養(yǎng)21天后，將相當于總培養(yǎng)物1/5體積的20ml培養(yǎng)物轉移到另一含80ml新鮮培養(yǎng)基的培養(yǎng)瓶中開始另一培養(yǎng)循環(huán)。隨后，向相當于總培養(yǎng)物4/5體積的80ml剩余培養(yǎng)物中加入3％(重量/體積)麥芽糖，并再培養(yǎng)21天，此時紫杉醇產(chǎn)量達到最大。此時，培養(yǎng)溫度設定為24℃，搖瓶速度為150rpm。定期從培養(yǎng)物中取樣以檢測微生物污染，并且如上所述采用高效液相色譜(HPLC，Waters，U.S.A.)測定培養(yǎng)物中紫杉醇的產(chǎn)量。結果是，為觀察到微生物污染并且培養(yǎng)42天后紫杉醇的產(chǎn)率為284mg/L(見圖4)，如圖4所示，紫杉醇的濃度隨著培養(yǎng)循環(huán)的重復而增加。
如上所述，本發(fā)明提供了以高產(chǎn)率通過半連續(xù)培養(yǎng)紫杉屬植物而大量生產(chǎn)紫杉醇的方法，根據(jù)本發(fā)明，當在半連續(xù)培養(yǎng)中采用中國紫杉SYG-1并添加提高紫杉醇產(chǎn)率的AgNO3、檸檬酸銨和麥芽糖時，在培養(yǎng)40-50天后觀察到紫杉醇的產(chǎn)率達到300mg/L的水平。
權利要求
1.一種大量生產(chǎn)紫杉醇的方法，包括下述步驟(i)將紫杉屬植物細胞接種到含1-15μM AgNO3的培養(yǎng)基中并培養(yǎng)；以及，(ii)從產(chǎn)生紫杉醇的培養(yǎng)物中回收紫杉醇。
2.權利要求1的大量生產(chǎn)紫杉醇的方法，其中紫杉屬植物選自由短葉紫杉、加拿大紫杉、東北紫杉、歐洲紫杉、Taxus globosa、佛羅里達紫杉、喜馬拉雅紫杉、Taxus media和中國紫杉組成的一組。
3.權利要求1的大量生產(chǎn)紫杉醇的方法，其中紫杉屬植物是中國紫杉SYG-1(KCTC 0232BP)。
4.權利要求1的大量生產(chǎn)紫杉醇的方法，其中培養(yǎng)以分批或半連續(xù)方式進行。
全文摘要
本發(fā)明涉及以高產(chǎn)率通過分批或者半連續(xù)培養(yǎng)紫杉屬植物而大量生產(chǎn)紫杉醇的方法，根據(jù)本發(fā)明，通過采用紫杉屬植物細胞的分批或半連續(xù)培養(yǎng)可以高產(chǎn)率制備紫杉醇，所述的方法包括(i)將紫杉屬植物細胞接種到含1－15μMAgNO
文檔編號C12P15/00GK1394961SQ0114487
公開日2003年2月5日 申請日期1996年4月27日 優(yōu)先權日1995年4月27日
發(fā)明者崔亨均, 湯姆·李·亞當斯, 羅伊·威廉·斯塔爾赫特, 金尚翼, 尹晶煥, 宋鳳圭, 金鎮(zhèn)鉉, 宋準錫, 洪承緒, 李賢秀 申請人:(株)三養(yǎng)吉尼克斯