專利名稱：紅豆杉全株無毒提取紫杉醇口服抗癌制劑及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明是涉及中藥技術(shù)領(lǐng)域中，利用人工栽培的東北紅豆杉全株進(jìn)行乙醇浸泡、 無毒提取紫杉醇及其口服抗癌制劑的制備方法。
背景技術(shù)：
紅豆杉提取紫杉醇的生產(chǎn)工藝，據(jù)目前國內(nèi)外有關(guān)報(bào)道和相關(guān)文獻(xiàn)中介紹的有使用CO2萃取，和超聲波萃取等多種多樣的提取工藝方式。C02萃取，超聲波萃取雖工藝先進(jìn)， 得取率高，但紫杉醇以及經(jīng)某些化學(xué)溶劑處理后的殘留仍有等量存在，提取后的原料用作注射制劑，雖然患者對其毒性能夠耐受，但必定又給患者造成二次傷害，如果針對晚后期或聯(lián)合化療失敗的癌患來講，就會加速其死亡的速率。研究實(shí)驗(yàn)表明，無毒提取的紫杉醇比有毒的紫杉醇更好，生理活性仍然較強(qiáng)，因無毒提取保留了諸多的抑癌活性物質(zhì)，尤其是豆杉色素中小分子化合物的存留，這時緩解癌痛，抑制癌細(xì)胞生長極為重要。本發(fā)明是采用改進(jìn)型的16步法超濾膜分離提取法提取粗品紫杉醇，不使用化學(xué)溶劑，無化學(xué)殘留，其安全性、得取率都很高。目前這種16步法無毒提取工藝在國內(nèi)還不多見。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目地是向藥企提供紅豆杉全株無毒提取紫杉醇粗品原料，為制做和確保口服抗癌制劑紫杉醇藥酒，紫杉醇口服液的安全性，提供科學(xué)的技術(shù)路線支撐。原料提取與口服制劑的制備方法1、紫杉醇原料的無毒提取工藝去雜，O3水清洗一切片一烘干一粉碎一納米超微破壁一乙醇浸泡剝離一初濾一脫毒處理一低壓大孔超濾一高壓小孔超濾一層析一真空滲透濃縮一回收乙醇一二次脫毒一真空冷凍干燥一結(jié)晶體粉碎。2、工藝步驟說明(1)去雜、清洗將紅豆杉全株干品表面附著的泥土及其他雜質(zhì)清除掉，再放入O3 水清洗池中清洗，通過O3水的氧化作用，可有效的將紅豆杉全株表面的病菌、霉毒以及化肥農(nóng)藥的殘留清除掉；(2)將清洗后的紅豆杉全株浙干水分后，切成薄片；(3)烘干將紅豆杉薄片送入熱風(fēng)循環(huán)干燥機(jī)內(nèi)烘干3小時；(4)烘干后的紅豆杉碎片在經(jīng)不銹鋼粉碎機(jī)粉碎；(5)超微破壁納米超微破壁的目地是，由于紫杉醇烷二萜類屬小分子化合物，緊帖在胞核內(nèi)和胞核外，加上細(xì)胞膠質(zhì)和黏結(jié)附著力強(qiáng)原故，即是乙醇浸泡后膨脹開裂，但仍有部分烷二萜類化合物還無法游離出來，采用超微納米級破壁機(jī)粉碎300目，甚至更小的微粒，可有效的獲取二萜及其它化合物；(6)乙醇浸泡剝離由于紫杉醇烷二萜類不溶于水，易溶于乙醇的特性，采用95%醫(yī)用乙醇與紅豆杉按比例浸泡，間接加熱浸泡M小時后，在將液溫間接加熱至二萜類化合物生理活性尚處穩(wěn)定的界度內(nèi)，快速攪拌20分鐘，促使烷二萜類化合物在適宜溫度下的流相沖擊中剝離出來；(7)初濾將攪拌剝離后的溶液用500目細(xì)度的濾網(wǎng)進(jìn)行過濾，濾渣再進(jìn)行二次乙
醇浸泡；(8)脫毒處理將初濾后的溶液間接加熱至適宜溫度時液溫逐漸升高，有毒的輕質(zhì)揮發(fā)油會逐步上浮到乙醇溶液表面，并隨溫升高而向中心聚積，這時用吸油紙吸附出來， 也可用不銹鋼湯勺取出，日后集中統(tǒng)一提取揮發(fā)油；(9)低壓大孔超濾采用超濾膜分離機(jī)，設(shè)定粒度為0. Olum，而紫杉醇烷二萜類化合物的粒度為0. 01-0. 002um。所以，首先將脫毒的乙醇溶液加壓通過低壓大孔0. Olum超濾截留，截留物為粗纖維，微塵、膠質(zhì)等無利用價值的大分子物質(zhì)；(10)高壓小孔超濾將低壓大孔透過液再經(jīng)高壓小孔0. OOlum的截留，即獲得紫杉醇烷二萜類和其它化合物的大小分子濃縮液；(11)層析將高壓小孔超濾透過液，經(jīng)硅膠層析柱真空態(tài)滲透吸附的洗脫液與高壓小孔超濾截留的大小分子濃縮液合并；(12)真空滲透濃縮將合并的濃縮液進(jìn)行3小時中溫真空滲透濃縮，即獲得大小分子合并后的膏體狀。(13)回收乙醇將真空滲透的小分子乙醇液與層析透過的小分子乙醇液合并，用蒸餾器蒸餾回收再用；(14) 二次脫毒將真空滲透濃縮的膏狀倒入一薄壁的不銹鋼盤內(nèi)，送入恒溫干燥箱內(nèi)密閉吸空干燥6小時，由于濃縮的膏體內(nèi)還存有部分輕質(zhì)豆杉精油和乙醇，待膏溫逐漸上升時，豆杉精油會隨乙醇一同升華蒸發(fā)掉，6小時后，可呈現(xiàn)無乙醇的結(jié)晶體；(15)低溫真空干燥將基本干燥的無乙醇結(jié)晶體打碎，放入另一薄壁的的不銹鋼盤內(nèi)，送入真空冷凍干燥機(jī)內(nèi)，低溫38度以上真空狀態(tài)下，冷凍干燥M小時，即成為無毒提取的紫杉醇結(jié)晶體；(16)結(jié)晶體粉碎將干燥后的結(jié)晶體通過不銹鋼高速粉碎機(jī)快速粉碎為80目，可得紫杉醇粗品，顏色為淺紅色不規(guī)則結(jié)晶粉末，經(jīng)測定紫杉醇含量為30%。本發(fā)明利用其超濾提取、濃縮作用，大大提高了產(chǎn)品得率。也可利用不同分子量截留值的超濾膜來實(shí)現(xiàn)紫杉醇的進(jìn)一步分級純化，也可將紫杉醇分成幾個相對單一的分子量級別，制備均一的精品紫杉醇。超濾法在加工前進(jìn)行脫毒和加工后的二次脫毒處理，使得紫杉醇毒性降低98%以上，有效活性不破壞，且操作簡單，只需控制操作壓力，流速和濾液濃度即可，這對于分子量大且分布范圍較寬，溶液黏度大且又不穩(wěn)定的紫杉醇烷二萜類來說， 無疑是一種極具發(fā)展?jié)摿Φ奶崛》蛛x手段。3、粗品紫杉醇的物理狀態(tài)與理化性質(zhì)粗品紫杉醇中含有蛋白質(zhì)、氨基酸、礦物質(zhì)、生物素以及紫杉醇烷二萜類、紫杉堿、 紫杉素、紫杉多糖、紫杉紅色素、紫杉單寧、紫杉多酚、紫杉腺苷類等化合物，其粗品的黏性較大，顏色為淺紅色結(jié)晶粉末，味微苦，微澀，有股松杉香氣味。紫杉醇粗品易吸濕，一般常溫15度以上時黏性增大，逐步形成粘稠狀的流體，溫度下降至5度以下時，還原成結(jié)晶塊， 經(jīng)檢測其生理活性不變，但微生物增多，采用零度以下的低溫冷藏或冷凍時，其物理狀態(tài)與理化指標(biāo)較為穩(wěn)定。4、毒理試驗(yàn)(1)急毒LD50試驗(yàn)分三個實(shí)驗(yàn)組，第1組試驗(yàn)原料由上海某藥企提供的注射用99%含量的精品紫杉醇，顏色為白色不規(guī)則結(jié)晶粉末，用聚乙二醇400烯釋后，調(diào)配成 100mg/ml的生藥；第2組試驗(yàn)原料由黑龍江省某紅豆杉基地提取的自制乙醇提取紫杉醇粗品，含量在1 %。顏色為褐紅色結(jié)晶顆粒，用聚乙二醇400烯釋后，調(diào)配成2g的生藥；第3組試驗(yàn)原料屬本發(fā)明無毒提取的紫杉醇粗品，含量為30%，顏色為淺紅色結(jié)晶粉末，用聚乙二醇400烯釋后，調(diào)配成2g/ml的生藥。實(shí)驗(yàn)1組、2組、3組的受試鼠采用上海ICR種小鼠， 每組各10只，雌雄各半，全部停食10小時后，一次性灌喂給藥，觀察3天，給藥后第1受試組在5小時內(nèi)先后死亡2只，9小時內(nèi)又死亡1只，剩余7只鼠緩慢復(fù)蘇存活；給藥后的第 2受試組在5小時內(nèi)死亡1只，其它9只出現(xiàn)異常，但6小時后恢復(fù)常態(tài)，給藥后的第3受試組無一只鼠出現(xiàn)異常，無一只死亡。測試結(jié)果表明第1組，利用國標(biāo)提取工藝的精品紫杉醇，受試鼠死亡3只，毒性較大；第2組是黑龍江省某紅豆杉基地的粗品紫杉醇，受試鼠死亡 1只，具有一定的毒性；第3組是本發(fā)明無毒提取的紫杉醇粗品，受試鼠無一只死亡。(2)最大耐受量測試用ICR種小鼠40只/kg，雌雄各半，停食10小時后一次性灌喂給藥2g/ml，無毒提取的紫杉醇，含量30%，一天內(nèi)給藥2次，總劑量為160g/kg生藥，此劑量相當(dāng)于成人按 60kg體重計(jì)算，是口服劑量0. 034g的1200倍。小鼠給藥后的3小時內(nèi)僅有2只出現(xiàn)輕微異常，4小時后恢復(fù)常態(tài)，3天內(nèi)無一只死亡。經(jīng)常規(guī)飼養(yǎng)觀察20天，除出現(xiàn)輕微異常的2 只小鼠在給藥后的第9天內(nèi)體重略輕于相應(yīng)時間對照組P < 0. 03外，其余未發(fā)現(xiàn)異常。因此，小鼠的最大耐受量為成人臨床擬口服劑量的1200倍，測試結(jié)果表明，毒性甚微。5、抗癌試驗(yàn)(1)將本發(fā)明無毒提取的紫杉醇粗品，烯釋配比成2g/ml的生藥，紫杉醇含量為 30%，注入培養(yǎng)活躍的46歲女性乳腺癌細(xì)胞株培養(yǎng)器內(nèi)，恒溫培養(yǎng)10小時后顯微觀察發(fā)現(xiàn)，乳腺癌細(xì)胞株大部分被抑制的一動不動。(2)將乳腺癌細(xì)胞32株用蒸餾水混溶后，分別給10只3齡的雌性鼠胸外皮內(nèi)注射，使其感染，每只鼠分別注射約0. 3ml，但0. 3ml中乳腺癌細(xì)胞株數(shù)量不詳。觀察3天發(fā)現(xiàn)， 10只鼠全部出現(xiàn)異常，確定已全部感染，待第九天時有8只鼠乳腺隆起突出，活動次數(shù)和進(jìn)食量相對減少，各別鼠有時出現(xiàn)尖叫聲。第10天時每天灌胃2次，日劑量3. ^ig紫杉醇，連續(xù)給藥2個月，給藥后的第6天時，食欲，活動次數(shù)有所增加，尖叫聲基本消失，第30天已基本恢復(fù)，腫塊變小，大部分乙基本消失，2個月后，隆起的乳腺瘤塊除有1只略有變小外，其余7只已全部消失。實(shí)驗(yàn)證明，無毒紫杉醇粗品針對乳腺癌具有極為顯著的治療效果，而且鎮(zhèn)痛作用較好，無任何毒副作用表現(xiàn)。(3)通過多名患有皮膚癌、肺癌、淋巴癌、肝癌(都在放化療之中)患者自愿服用紫杉醇口服液，每天服用2次，每次IOml/支，內(nèi)含紫杉醇粗品Ig/支，連服3個月，輔助抑癌效果特別明顯。尤其是一位肝癌患者，51歲，男性，初檢瘤塊0.98-1. 36，AFP為6902，服用口服液1個月，AFP降至1150，2個月降至80，服用3個月檢驗(yàn)彩超造型殘留病灶無活動跡象。實(shí)驗(yàn)表明，無毒提取的紫杉醇口服抗癌制劑作用極其顯著，而且鎮(zhèn)痛作用比較好。(4)通過幾十位亞健康男女自愿服用紫杉醇口服液后，感覺體力充沛，精氣神提高，有活力，睡眠好，不易感冒，這與無毒紫杉醇具有溶血抗栓，抗病毒、抗炎、抗癌和增強(qiáng)免疫力作用有關(guān)，這就為開發(fā)紫杉醇藥用原料與口服制劑提供了一定的理論性依據(jù)。6、紫杉醇口服抗癌制劑的制備方法(1)紫杉醇藥酒將38度的燕麥酒50kg，放入一大容量不銹鋼容器內(nèi)，間接加熱 40度，在放入5kg紫杉醇粗品，充分?jǐn)嚢?0分鐘，待其全部溶解后，用0. Ium的濾膜過濾，計(jì)量灌裝，每瓶250ml，紫杉醇藥酒用于治療用，日服2次，每次10ml，內(nèi)含紫杉醇粗品lg，預(yù)防用，每天1次，每次10ml。由于紫杉醇不溶于水而溶于乙醇，所以在優(yōu)質(zhì)的酒中加入紫杉醇溶解快，不沉淀， 酒的顏色呈粉紅色，沒有懸浮物，半透明狀，口感好，無異味，藥用物質(zhì)活性強(qiáng)。燕麥酒與其它糧食釀制的酒不同點(diǎn)是燕麥中含有豐富的蛋白質(zhì)、礦物質(zhì)、脂肪、 碳水化合物，更主要的是含有對人體極為有益的亞油酸，對中老年人降脂，降糖，降低膽固醇有較好的益處，營養(yǎng)物質(zhì)經(jīng)酶解、蒸餾轉(zhuǎn)化為小分子化合物，存在于酒中，再與紫杉醇組合，酒為藥弓I，藥借酒勢，活性物質(zhì)快速直達(dá)病灶而發(fā)揮作用。(2)紫杉醇口服液將7500ml蒸餾水放入一耐高溫的玻璃容器內(nèi)，間接加熱40 度，放入冰糖500g，VC50片攪拌溶化后加入聚乙二醇45ml攪勻，再加入紫杉醇粗品^g，充分?jǐn)嚢?0分鐘后，待其全部烯釋成粉紅色微乳狀時，倒入盛有40kg蜂膠的容器內(nèi)，攪拌20 分鐘，將其全部混溶后，計(jì)量灌裝，每支10ml，每支口服液內(nèi)含紫杉醇粗品lg，每盒10支，然后用UST瞬間殺菌機(jī)殺菌處理，即成為紫杉醇口服液。治療用，每天口服二次，每次1支，預(yù)防用，每天口服1次，每次1支。紫杉醇口服液利用蜂膠作為基質(zhì)，微乳性能好，營養(yǎng)豐富，添加VC的作用是減少溶液過氧化，保存期長，而且口感好，易吸收，作用快。紫杉醇是近10年來發(fā)現(xiàn)具有極強(qiáng)抗癌活性的植物提取物，它不同于其它植物藥物和化療藥物，抗癌作用極其獨(dú)特，其主要作用機(jī)理為紫杉醇與細(xì)胞受體后，釋放出的TNF-a抑制因子，通過腫瘤新生微毛細(xì)血管和胞膜進(jìn)入細(xì)胞核內(nèi)，促使腫瘤微管聚合，而且不與未聚合的微管蛋白二聚體反應(yīng)。抑制因子 TNF-a會在癌細(xì)胞內(nèi)積累大量的微管，也叫蛋白基因抑制因子。這些微管的積累干擾和破壞了癌細(xì)胞基因免疫及修復(fù)應(yīng)答功能，特別是使癌細(xì)胞分裂停止于有絲分裂期G2/m內(nèi)，致使快速分裂的腫瘤細(xì)胞在有絲分裂期階段被牢牢固定，阻止了癌細(xì)胞飛快生長與復(fù)制，并通過抵制微管蛋白與二聚體動態(tài)平衡來誘殺癌細(xì)胞，致使腫瘤細(xì)胞萎縮、凋亡。紫杉醇的功能性作用是任何植物抗癌藥物和生物堿中抑癌活性最強(qiáng)。最有效的一種抑癌藥物，尤其是無毒提取的紫杉醇，在確保了患者服用后安全性的同時，也增強(qiáng)了抑癌療效。
具體實(shí)施例方式紅豆杉全株無毒提取紫杉醇口服抗癌制劑及其制備方法，其主要工藝是1、提取工藝(1)去雜，O3水清洗，將IOOkg紅豆杉全株干品表面附著的泥土及其它雜質(zhì)清除掉，放入O3水清洗池中清洗。(2)切片，將清洗后的IOOkg紅豆杉全株取出浙干水分后，切成2mm厚的薄片；
(3)烘干，將紅豆杉薄片放入不銹鋼盤中，送入50度的熱風(fēng)循環(huán)干燥機(jī)內(nèi)烘干3小時，待含水分在5%以下時，取出；(4)粉碎，烘干后的紅豆杉碎片再經(jīng)不銹鋼粉碎機(jī)粉碎，粒度為Imm以下；(5)超微破壁，將粉碎后的IOOkg紅豆杉粉，在經(jīng)納米超微破壁機(jī)超微粉碎300 目；(6)乙醇浸泡剝離，采用95%的醫(yī)用乙醇500kg，紅豆杉全株超微粉IOOkg放入能夠密封的不銹鋼容器內(nèi)，間接加熱38度，恒溫浸泡M小時后，在加溫60度同時，連續(xù)攪拌剝離20分鐘后，減溫并停止攪拌。(7)初濾，將攪拌剝離后的溶液用500目細(xì)度的濾膜進(jìn)行過濾，濾渣在二次乙醇浸泡，過濾，兩次的濾液合并。(8)脫毒處理，將初濾的合并液放入一不銹鋼容器內(nèi)，間接加熱50-60度，隨著液溫的逐漸升高，有毒的輕質(zhì)豆杉揮發(fā)精油會逐步上浮到乙醇液表面，向中心聚積，這時用不銹鋼湯勺將其取出；(9)低壓大孔超濾，采用超濾膜分離機(jī)，設(shè)定超濾粒度為0. Olum，將脫毒后的乙醇溶液加壓，通過低壓大孔0. Olum超濾截留，截留物為粗纖維，微塵、膠質(zhì)等無利用價值的大分子物質(zhì)。(10)高壓小孔超濾，將低壓大孔透過液再經(jīng)高壓小孔0. OOlum的濾膜超濾截留， 截留液為烷二萜類等化合物大分子液，透過液為乙醇及小分子化合物。(11)層析，將高壓小孔透過液，經(jīng)硅膠柱層析真空態(tài)滲透吸附，然后將洗脫液與高壓小孔的截留液合并。(12)真空滲透濃縮，將合并液通過濃縮機(jī)進(jìn)行3小時的40度中溫真空態(tài)滲透濃縮，得大分子合并后的膏體狀。(13)回收乙醇，將真空滲透的小分子乙醇液與層析透過的小分子乙醇液合并，用蒸餾器蒸餾回收再利用。(14) 二次脫毒，將真空滲透濃縮的膏體倒入一薄壁的不銹鋼盤內(nèi)，送入60度的恒溫干燥箱內(nèi)密封，用真空泵間歇式吸空干燥6小時，將其膏體狀內(nèi)的部分乙醇和揮發(fā)油隨溫升高而揮發(fā)掉。(15)低溫真空干燥，將基本干燥的無乙醇半結(jié)晶塊弄碎，放入一薄壁的不銹鋼盤內(nèi)，送入真空冷凍干燥機(jī)內(nèi)，在負(fù)38度以上的真空狀態(tài)下，冷凍干燥8小時后，即成為無毒提取的紫杉醇結(jié)晶體。(16)結(jié)晶體粉碎，將干燥后的結(jié)晶體通過不銹鋼高速粉碎機(jī)快速粉碎80目，可得紫杉醇粗品。2、紫杉醇藥酒的制備方法將38度的燕麥酒50kg，放入一大容量不銹鋼的容器內(nèi)，間接加熱40度，再放入 5kg紫杉醇粗品，充分?jǐn)嚢?0分鐘，待其全部溶解后，用0. Ium的濾膜過濾，計(jì)量灌裝，每瓶 250ml ο3、紫杉醇口服液的制備方法將7500ml蒸餾水放入一耐高溫的玻璃容器內(nèi)，間接加熱40度，放入冰糖500g、維生素C50片，攪拌溶化后在加入聚乙二醇45ml，充分?jǐn)嚢?0分鐘后，待其全部烯釋成粉紅色微乳狀時，倒入盛有40kg蜂膠的容器內(nèi)，攪拌20分鐘，將其全部混溶后，計(jì)量灌裝，每支 10ml，每支口服液含有紫杉醇粗品lg。
權(quán)利要求
1.將初濾的合并液放入一不銹鋼容器內(nèi)，間接加熱50-60度，隨著液溫的逐漸升高，有毒的輕質(zhì)豆杉揮發(fā)精油會逐步上浮到乙醇表面，并向中心聚積，這時用不銹鋼湯勺將其取出ο
2.將真空滲透濃縮的膏體倒入一薄壁的不銹鋼盤內(nèi)，送入60度的恒溫干燥箱內(nèi)密封， 用真空泵間歇式吸空干燥6小時后，將其膏體內(nèi)的部分乙醇和揮發(fā)精油隨溫升高而揮發(fā)掉。
全文摘要
本發(fā)明提供了紅豆杉全株無毒提取紫杉醇口服抗癌制劑及其制備方法，是由東北紅豆杉為主要提取原料，采用乙醇浸泡16步法無毒提取工藝，獲得30％含量的紫杉醇粗品，作為紫杉醇藥酒，紫杉醇口服液的主要原料。藥效研究表明，本發(fā)明制備口服抗癌制劑針對二十多種不同特異性的晚期及聯(lián)合化療失敗的晚后期癌患具有及其顯著的治療效果，而且鎮(zhèn)痛作用比較好，無毒。
文檔編號A61K36/13GK102552338SQ201210030328
公開日2012年7月11日 申請日期2012年2月13日 優(yōu)先權(quán)日2012年2月13日
發(fā)明者林樹芳 申請人:林樹芳