專利名稱：拉達(dá)卡鏈輪絲菌的轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶基因及其編碼的轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種編碼轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶的新DNA分子及其編碼的轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶。
轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶在細(xì)胞外和細(xì)胞內(nèi)均有發(fā)現(xiàn)。從許多動(dòng)物和一些植物物種中已鑒別和鑒定了多種轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶。不幸的是，衍生自動(dòng)物如豚鼠的轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶在產(chǎn)業(yè)上無法應(yīng)用，因?yàn)殡y于以低成本獲得大量的這種動(dòng)物來源的轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶。目前僅揭示了很少幾種微生物轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶，即來自菌種茂原鏈輪絲菌(Streptoverticilliummobaraense)、肉桂鏈輪絲菌(Streptoverticillium cinnamoneum)和灰肉色鏈輪絲菌(Streptoverticillium griseocarneum)(見美國專利5,156,956)以及來自預(yù)期為淡紫灰鏈霉菌(Streptomyces lavendulae)的菌種(見美國專利5,252,469)的轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶。根據(jù)Wu等，在所篩選的菌株中，拉達(dá)卡鏈輪絲菌(Streptoverticillium ladakanum)的轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶具有最高的活性(Wu等，1996，Chinese Agric.Chem.Soc.34(2)228-40)。
編碼轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶的基因已從鏈輪絲菌菌種S-8112(Washizu等，1994，Biosci.Biotechnol.Biochem.58(1)82-7)，肉桂鏈輪絲菌(Pasternack等，1998，Eur.J.Biochem.257(3)570-6)，利迪鏈霉菌(Streptomyces lydicus)(WO9606931)和枯草芽孢桿菌(Kobayashi等，1998，J.Gen.Appl.Microbiol.4485-91)中克隆。
另外，目前基因工程技術(shù)已使得獲得大量酶相對(duì)容易，這可通過分離編碼酶的基因，確定酶基因的堿基序列，產(chǎn)生含有編碼酶的基因的重組DNA，將重組DNA摻入微生物或動(dòng)物或植物細(xì)胞，以及培養(yǎng)所獲得的轉(zhuǎn)化子而實(shí)現(xiàn)。
本發(fā)明的另一目的是提供包含本發(fā)明的DNA分子的表達(dá)載體。
本發(fā)明的再一目的是提供包含本發(fā)明的表達(dá)載體的宿主細(xì)胞。
本發(fā)明的又一目的是提供包含由本發(fā)明的DNA分子編碼的氨基酸序列的多肽。


圖1示出茂原鏈輪絲菌CCRC 12165的轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶基因的部分片段(644bp)。
圖2示出KpnI片段的3241個(gè)核苷酸序列以及位于KpnI片段的第二個(gè)開放讀框的第700-1900位核苷酸附近的基因。
圖3示出質(zhì)粒pAE051和pAE052的限制圖譜。
圖4示出質(zhì)粒pAE051在淺青紫鏈霉菌(S.lividans)JT46中的表達(dá)活性。
本文所用術(shù)語“氨基酸序列”是指天然存在的蛋白質(zhì)分子的氨基酸序列，“氨基酸序列”及類似術(shù)語如“多肽”或“蛋白質(zhì)”并非將氨基酸序列限制為與所引述的蛋白質(zhì)分子相關(guān)的完整氨基酸序列。氨基酸序列包括寡肽、肽、多肽或蛋白質(zhì)序列，及其片段或部分，以及天然存在或合成的分子。
本文所用術(shù)語“缺失”是指氨基酸或核苷酸的變化，其中一或多個(gè)氨基酸或核苷酸殘基被缺失。
本文所用術(shù)語“插入”或“添加”是指導(dǎo)致與天然存在的分子相比添加一或多個(gè)氨基酸或核苷酸殘基的氨基酸或核苷酸序列的變化。
本文所用術(shù)語“載體”是指能轉(zhuǎn)運(yùn)與其連接的另一核酸的核酸分子。一種優(yōu)選的載體是附加體，即能在染色體外復(fù)制的核酸。優(yōu)選的載體是能夠自動(dòng)復(fù)制和/或表達(dá)與其相連的核酸的載體。能指導(dǎo)與其可操縱連接的基因的表達(dá)的載體在本文中稱作“表達(dá)載體”。通常，重組DNA技術(shù)中實(shí)用的表達(dá)載體通常是“質(zhì)?！毙问?，其通常是指環(huán)狀雙鏈DNA環(huán)，其在載體形式中不與染色體結(jié)合。
本文所用術(shù)語“宿主細(xì)胞”是指可被載體如質(zhì)粒感染的宿主的細(xì)胞。適于本發(fā)明的宿主包括本領(lǐng)域通常和常規(guī)使用的宿主。核酸本發(fā)明的一個(gè)目的是提供分離的和純化的DNA分子，其包含編碼轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶的序列，其中所述核酸在高度嚴(yán)格條件下與SEQ IDNO1所示序列或其互補(bǔ)序列雜交。更優(yōu)選地，所述DNA分子編碼具有SEQ ID NO2所示氨基酸序列的轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶。最優(yōu)選地，所示DNA分子由SEQ ID NO1所示的完整核苷酸序列代表。
具有序列相似性的核酸由在高度嚴(yán)格條件下的雜交而檢測。高度嚴(yán)格雜交條件是指在例如含有0.25M Na2HPO4(pH7.4)，7％十二烷基磺酸鈉(SDS)，1％牛血清白蛋白(BSA)，1.0mM乙二胺四乙酸(EDTA，pH8)的緩沖液中于65℃雜交，隨后用0.1％SDS和0.1倍SSC在65℃洗3次(0.1倍SSC含有0.015M氯化鈉和0.0015M檸檬酸三鈉，pH7.0)。
編碼本發(fā)明的轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶的序列可以本領(lǐng)域已知的各種方式突變以產(chǎn)生在啟動(dòng)子強(qiáng)度、編碼的蛋白質(zhì)的序列等方面的定向變化。這種突變的DNA序列或產(chǎn)物與本文提供的序列基本相似，即它們將有至少一個(gè)核苷酸或氨基酸的不同，并可有至少兩個(gè)但不超過約十個(gè)核苷酸或氨基酸的不同。所述變化可以是取代、插入或缺失。
目前有若干不同的方法來分離本發(fā)明的DNA。這些方法包括，例如，純化酶蛋白，隨后將其直接進(jìn)行氨基酸微測序或在限制裂解后進(jìn)行氨基酸微測序。所獲得的部分氨基酸序列可用于設(shè)計(jì)簡并寡核苷酸探針或引物以用于經(jīng)聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)產(chǎn)生獨(dú)有的非簡并核苷酸序列，即可隨后用作探針篩選DNA文庫的序列。也可使用抗純化的蛋白質(zhì)的抗體從DNA表達(dá)文庫中分離DNA克隆?；蛘?，可使用相關(guān)酶的DNA分子的序列作為克隆策略的起點(diǎn)。這一方法通常稱為“同源性克隆”。使用來自不同物種的序列信息的另一種方式是在來自不同物種的相關(guān)DNA分子中縮小高序列同源性的區(qū)域，并進(jìn)行聚合酶鏈反應(yīng)測序擴(kuò)增方法(PCR)以獲得“物種特異性”非簡并核苷酸序列。這種序列隨后可用于DNA文庫篩選或甚至用于直接基于PCR的DNA克隆。
使用本領(lǐng)域熟知的生物化學(xué)程序，可用寡核苷酸探針在各種樣品中檢測和擴(kuò)增本發(fā)明的DNA分子。例如，可使用應(yīng)用標(biāo)記探針的Southern或Northern印跡雜交技術(shù)?；蛘?，可使用PCR技術(shù)，并且擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物的核酸測序可用于檢測DNA中的突變。表達(dá)載體和宿主系統(tǒng)本發(fā)明的另一目的是提供含有SEQ ID NO1所示DNA分子的表達(dá)載體。為了表達(dá)生物活性的轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶，編碼轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶的核酸序列可被插入合適的表達(dá)載體即含有轉(zhuǎn)錄和翻譯所插入的編碼序列所必需的元件的載體中。根據(jù)本發(fā)明，可使用本領(lǐng)域熟知的方法構(gòu)建含有圖1所示DNA分子以及合適的轉(zhuǎn)錄和翻譯控制元件的表達(dá)載體。這些方法包括體外重組DNA技術(shù)，合成技術(shù)和體內(nèi)基因重組。
本發(fā)明的另一目的是提供含有表達(dá)載體的宿主細(xì)胞，所述表達(dá)載體含有SEQ ID NO1所示的DNA分子。根據(jù)本發(fā)明，可使用各種宿主系統(tǒng)以含有和表達(dá)編碼轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶的序列，這些宿主系統(tǒng)包括但不限于用重組噬菌體、質(zhì)?；蛘沉NA表達(dá)載體轉(zhuǎn)化的微生物，如細(xì)菌；用酵母表達(dá)載體轉(zhuǎn)化的載體；用病毒表達(dá)載體或細(xì)菌表達(dá)載體轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞系統(tǒng)；或者動(dòng)物細(xì)胞系統(tǒng)。優(yōu)選地，用載體轉(zhuǎn)化淺青紫鏈霉菌(Streptomyces lividans)以表達(dá)轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶。多肽本發(fā)明的另一目的是提供一種多肽，其包含由SEQ ID NO1所示的DNA分子編碼的氨基酸序列。優(yōu)選地，所述多肽包含SEQ IDNO2所示的氨基酸序列。
本發(fā)明的多肽可以大量提供。通過采用表達(dá)宿主，可根據(jù)常規(guī)方式分離和純化蛋白質(zhì)?？芍苽浔磉_(dá)宿主的裂解物，并用HPLC、排阻層析、凝膠電泳、親和層析或其它純化技術(shù)純化裂解物。純化的蛋白質(zhì)的純度通常至少為80％，優(yōu)選至少90％，并可達(dá)100％。純化是指無其它蛋白質(zhì)和細(xì)胞碎片。用途本發(fā)明的DNA分子可用于編碼轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶。大量表達(dá)DNA分子以大量生產(chǎn)轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶。得到的轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶具有各種工業(yè)用途，包括膠凝蛋白質(zhì)，改善面粉的烘烤品質(zhì)，從蛋白質(zhì)、脂肪和水生產(chǎn)糊狀食品或食品成分，從濃縮乳中生產(chǎn)干酪，粘合碎肉或魚制品，改善食品蛋白的口味和組織，在皮革加工中固定酪蛋白，擦鞋等。
下述實(shí)施例是舉例性而非限制性。實(shí)施例1 拉達(dá)卡鏈輪絲菌的轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶基因A.拉達(dá)卡鏈輪絲菌的轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶基因的克隆(1)PCR擴(kuò)增和純化拉達(dá)卡鏈輪絲菌的轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶基因片段根據(jù)兩個(gè)氨基酸片段FDEEKGF和KVKQGWP設(shè)計(jì)簡并引物，這兩個(gè)氨基酸片段是由Washizu等在1994年克隆的鏈輪絲菌菌種S-8112的轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶氨基酸序列(Washizu K.等，Biosci.Biotechnol.Biochem.58(1)82-7)中簡并性最低的區(qū)域。兩個(gè)簡并引物為5’-aaaaacctgaaaccctt(ct)ga(ct)ga(ag)ga(ag)aa(ag)gg(gact)tt-3’，和5’-cttatcaacggatacggcca(gatc)cc(tc)tg(tc)tt(gact)ac(tc)tt-3’。
兩個(gè)巢式引物為5’-aaaaacctgaaaccc-3’，和5’cttatcaacggatac-3’。
通過巢式PCR擴(kuò)增茂原鏈輪絲菌CCRC 12165的轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶的部分片段，結(jié)果顯示約650bp的一條DNA帶，其相應(yīng)于PCR產(chǎn)物的計(jì)算長度(644bp)。所得DNA序列示于圖1(SEQ ID NO3)。茂原鏈輪絲菌CCRC12165見臺(tái)灣新竹食品工業(yè)發(fā)展研究所(FIRDI)培養(yǎng)物寄存和研究中心的目錄。(2)用茂原鏈輪絲菌的部分轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶基因片段作為探針探查拉達(dá)卡鏈輪絲菌的完整轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶基因用上述644bp DNA作為探針進(jìn)行Southern印跡實(shí)驗(yàn)。在拉達(dá)卡鏈輪絲菌基因組的下列限制酶切片段中檢測到信號(hào)8.4kb BamHIDNA，6kb BclI DNA，9kb NcoI DNA和7.5kb PstI DNA。拉達(dá)卡鏈輪絲菌見臺(tái)灣新竹食品工業(yè)發(fā)展研究所(FIRDI)培養(yǎng)物寄存和研究中心的目錄(登錄號(hào)CCRC12422)。
為了純化所述包含轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶基因的DNA片段，將拉達(dá)卡鏈輪絲菌基因組DNA用NcoI酶切并進(jìn)行電泳分離。將純化的9kbDNA插入用NcoI酶切的pMTL23載體中并轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α而形成DNA文庫。再次使用上述644bp DNA作為探針進(jìn)行菌落雜交實(shí)驗(yàn)，并選擇包含拉達(dá)卡鏈輪絲菌的轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶基因的重組載體。由于所述NcoI片段太大而不能測序，克隆一包含轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶基因的3.2kb KpnI片段并插入pMT23載體上的KpnI酶切位點(diǎn)(形成pAE021)，隨后進(jìn)行測序。KpnI片段的3241個(gè)核苷酸序列示于圖2。用GCG提供的密碼優(yōu)選軟件分析所述序列，預(yù)計(jì)基因位于KpnI片段序列的約700-1900位核苷酸處(圖2)。所述基因是拉達(dá)卡鏈輪絲菌的轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶基因。從上述核苷酸序列推導(dǎo)的氨基酸序列也示于圖2，其由410個(gè)氨基酸組成，其分子量為45780.2道爾頓。預(yù)計(jì)拉達(dá)卡鏈輪絲菌的成熟轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶起自第80位氨基酸并由331個(gè)氨基酸組成(圖2的下劃線區(qū))，其分子量為37922.3道爾頓，等電點(diǎn)為7.07。B.在淺青紫鏈霉菌中表達(dá)拉達(dá)卡鏈輪絲菌的轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶基因用BglI和BamHI酶切pAE021，純化所得到的包含轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶基因的3.2kb DNA片段并將其插入pIJ702上的BglII酶切位點(diǎn)中，得到pAE051和pAE052(圖3A和B)。在淺青紫鏈霉菌JT46中表達(dá)pAE052并每24小時(shí)測量上清中的轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶活性。在72小時(shí)，轉(zhuǎn)化的克隆具有1.46U/ml的最大轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶活性(圖4)。對(duì)胞外培養(yǎng)基進(jìn)行的拉達(dá)卡鏈輪絲菌轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶特異性抗體分析檢測到成熟的和未修飾或部分修飾的轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶，其分子量在45.8kD和38kD之間分布。上述結(jié)果表明淺青紫鏈霉菌JT46大量表達(dá)轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶。
序列表<110> 食品工業(yè)發(fā)展研究所<120> 拉達(dá)卡鏈輪絲菌的轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶基因及其編碼的轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶<130> TKLEE885<160> 3<170> PatentIn version 3.1<210> 1<211> 1233<212> DNA<213> 拉達(dá)卡鏈輪絲菌<220><221> CDS<222> (1)..(1230)<223><400> 1atg tcc caa cgc ggg aga act ctc gtc ttc gcc gct ctc ggt gcg gtc48Met Ser Gln Arg Gly Arg Thr Leu Val Phe Ala Ala Leu Gly Ala Val1 5 10 15atg tgc acc acc gcg tta atg ccg tcc gca ggc gcg gcc acc ggc agt96Met Cys Thr Thr Ala Leu Met Pro Ser Ala Gly Ala Ala Thr Gly Ser20 25 30ggc agt ggc agc ggc acc ggg gaa gag aag agg tcc tac gcc gaa acg144Gly Ser Gly Ser Gly Thr Gly Glu Glu Lys Arg Ser Tyr Ala Glu Thr35 40 45cac cgc ctg acg gcg gat gac gtc gac gac atc aac gcg ctg aac gaa192His Arg Leu Thr Ala Asp Asp Val Asp Asp Ile Asn Ala Leu Asn Glu50 55 60agc gct ccg gcc gct tcg agc gcc ggt ccg tcc ttc cgg gcc ccc gac240Ser Ala Pro Ala Ala Ser Ser Ala Gly Pro Ser Phe Arg Ala Pro Asp65 70 75 80tcc gac gag cgg gtg act cct ccc gcc gag ccg ctc gac cgg atg ccc288Ser Asp Glu Arg Val Thr Pro Pro Ala 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1.一種分離和純化的DNA分子，其包含編碼轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶的序列，其中所述核酸在高度嚴(yán)格條件下與SEQ ID NO1所示序列或其互補(bǔ)序列雜交。
2.權(quán)利要求1的分離和純化的DNA分子，其中所述DNA分子編碼具有SEQ ID NO2所示氨基酸序列的轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶。
3.權(quán)利要求1的分離和純化的DNA分子，其中所述DNA分子包含SEQ ID NO1所示序列。
4.包含權(quán)利要求1的DNA分子的表達(dá)載體。
5.權(quán)利要求4的表達(dá)載體，其包含權(quán)利要求2所述的DNA分子。
6.權(quán)利要求4的表達(dá)載體，其包含權(quán)利要求3所述的DNA分子。
7.包含權(quán)利要求4的載體的宿主細(xì)胞。
8.權(quán)利要求7的宿主細(xì)胞，其包含權(quán)利要求5的載體。
9.權(quán)利要求7的宿主細(xì)胞，其包含權(quán)利要求6的載體。
10.權(quán)利要求7的宿主細(xì)胞，其是淺青紫鏈霉菌。
11.一種多肽，其包含由SEQ ID NO1所示的DNA分子編碼的氨基酸序列。
12.權(quán)利要求11的多肽，其包含SEQ ID NO2所示的氨基酸序列。
13.權(quán)利要求11的多肽，其用于膠凝蛋白質(zhì)，改善面粉的烘烤品質(zhì)，從蛋白質(zhì)、脂肪和水生產(chǎn)糊狀食品或食品成分，從濃縮乳中生產(chǎn)干酪，粘合碎肉或魚制品，改善食品蛋白的口味和組織，在皮革加工中固定酪蛋白，擦鞋。
全文摘要
本發(fā)明提供了編碼拉達(dá)卡鏈輪絲菌(Streptoverticilliumladakanum)的轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶的DNA分子，所編碼的轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶以及所述轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶在工業(yè)工程中的應(yīng)用。
文檔編號(hào)C12N15/63GK1427078SQ0114372
公開日2003年7月2日 申請(qǐng)日期2001年12月18日 優(yōu)先權(quán)日2001年12月18日
發(fā)明者林怡杏, 劉昌協(xié), 朱文深 申請(qǐng)人:食品工業(yè)發(fā)展研究所