一種dc細胞培養(yǎng)試劑及其培養(yǎng)方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及細胞培養(yǎng)技術(shù)領(lǐng)域，特別涉及一種DC細胞培養(yǎng)試劑及其培養(yǎng)方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 腫瘤是機體在各種致瘤因素作用下，局部組織的細胞在基因水平上失去對其生長 的正常調(diào)控導(dǎo)致異常增生與分化而形成的新生物。新生物一旦形成，不因病因消除而停止 生長，他的生長不受正常機體生理調(diào)節(jié)，而是破壞正常組織與器官，這一點在惡性腫瘤尤其 明顯。與良性腫瘤相比，惡性腫瘤生長速度快，呈浸潤性生長，易發(fā)生出血、壞死、潰瘍等，并 常有遠處轉(zhuǎn)移，造成人體消瘦、無力、貧血、食欲不振、發(fā)熱以及嚴(yán)重的臟器功能受損等，最 終造成患者死亡。
[0003] 惡性腫瘤是嚴(yán)重威脅人們生命健康的第一病害，在繼切除手術(shù)、放療、化療之后， 腫瘤免疫細胞治療是臨床用于腫瘤治療的第四大療法，它是一種新興的、具有顯著療效的 腫瘤治療模式，是一種自身免疫抗癌的新型治療方法。它是運用生物技術(shù)和生物制劑對從 病人體內(nèi)采集的免疫細胞進行體外培養(yǎng)和擴增后回輸?shù)讲∪梭w內(nèi)的方法，來激發(fā)、增強機 體自身免疫功能，從而達到治療腫瘤的目的。
[0004]樹突狀細胞（Dendriticcells,DC)是2011年諾貝爾醫(yī)學(xué)獎得到加拿大科學(xué)家拉 爾夫?斯坦曼與1973年發(fā)現(xiàn)并命名。DC細胞是機體功能最強的專職抗原遞呈細胞，它能高 效地攝取、加工處理和遞呈抗原，未成熟DC具有較強的迀移能力，成熟DC能有效激活初始 型T細胞，處于啟動、調(diào)控、并維持免疫應(yīng)答的中心環(huán)節(jié)。DC細胞是已知體內(nèi)功能最強、唯一 能活化靜息T細胞的專職抗原提呈細胞，是啟動、調(diào)控和維持免疫應(yīng)答的中心環(huán)節(jié)。通過大 量體外活化培養(yǎng)負(fù)載腫瘤抗原的DC細胞，當(dāng)細胞數(shù)量達到一定數(shù)量后回輸給病人，可誘導(dǎo) 機體產(chǎn)生強烈的抗腫瘤免疫反應(yīng)。DC細胞目前已廣泛應(yīng)用于臨床腫瘤治療，結(jié)合各類殺傷 性免疫細胞，可以發(fā)揮更加高效的腫瘤殺傷效果。
[0005] 目前已有的DC細胞培養(yǎng)最新方案是利用：GM-CSF、IL-4、IL-I和TLR共4類因 子誘導(dǎo)獲得，具體流程如下：
[0006] 1.血液分離單個細胞，貼壁獲得貼壁單個核細胞，分別添加GM-CSF、E-4的無血 清培養(yǎng)基，誘導(dǎo)培養(yǎng)5-6天；
[0007] 2.添加GM-CSF、IL-4、IL-IP和TLR的無血清培養(yǎng)24-48h，得到成熟的DC細胞。
[0008] 然而，TLR(即toll樣受體）是單個的跨膜非催化性蛋白質(zhì)，可以識別來源于微生 物的具有保守結(jié)構(gòu)的分子。當(dāng)微生物突破機體的物理屏障，如皮膚、粘膜等時，TLR可以識 別它們并激活機體產(chǎn)生免疫細胞應(yīng)答。只識別來源于微生物的入侵機體的保護，激活DC細 胞后，對人體免疫系統(tǒng)抗腫瘤方面無多大功效。而且，該培養(yǎng)方案制得的成熟DC細胞在遞 承腫瘤抗原效果中較弱，回輸人體后腫瘤殺傷效果不佳；缺乏激活聚集T細胞于外敏源的 功能，在疾病感染中達不到快速高效的抗原清除功能。因此，急需建立一套DC細胞培養(yǎng)方 案，使得獲得的成熟DC細胞能快速遞承抗原，并激活和聚集T細胞，達到高效殺傷腫瘤、病 毒微生物等抗原的目的。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0009] 有鑒于此，本發(fā)明提供了一種DC細胞培養(yǎng)試劑及其培養(yǎng)方法。該方法通過改進DC 細胞培養(yǎng)過程中細胞因子的種類和濃度，促進了DC細胞數(shù)量的增殖，并保持較好的細胞活 率，使DC細胞的抗原遞呈能力增強，具有更好的抗腫瘤效果。
[0010] 為了實現(xiàn)上述發(fā)明目的，本發(fā)明提供以下技術(shù)方案：
[0011] 本發(fā)明提供了一種DC細胞培養(yǎng)試劑，DC細胞培養(yǎng)試劑包括第一DC細胞培養(yǎng)試劑 和第二DC細胞培養(yǎng)試劑；
[0012] 第一DC細胞培養(yǎng)試劑包括GM-SCF和IL-4 ;
[0013] 第二DC細胞培養(yǎng)試劑包括GM-SCF、IL-4、TNF-a和MDC。
[0014] 本發(fā)明通過改進DC細胞培養(yǎng)過程中細胞因子的種類和濃度，促進了DC細胞數(shù)量 的增殖，并保持較好的細胞活率，使DC細胞的抗原遞呈能力增強，具有更好的抗腫瘤效果。
[0015] 作為優(yōu)選，還包括含有血衆(zhòng)的無血清培養(yǎng)基。
[0016] 作為優(yōu)選，無血清培養(yǎng)基中血衆(zhòng)的體積百分含量為5%~15%。
[0017] 在本發(fā)明提供的一些實施例中，無血清培養(yǎng)基中血漿的體積百分含量為5%。
[0018] 在本發(fā)明提供的一些實施例中，無血清培養(yǎng)基中血漿的體積百分含量為10%。
[0019] 在本發(fā)明提供的一些實施例中，無血清培養(yǎng)基中血漿的體積百分含量為15%。
[0020] 作為優(yōu)選，血楽:為自體血楽；。
[0021] 本發(fā)明還提供了一種DC細胞的培養(yǎng)方法，包括如下步驟：
[0022] 步驟1 :將單個核細胞進行細胞培養(yǎng)，獲得貼壁細胞；
[0023] 步驟2:采用第一DC細胞培養(yǎng)試劑培養(yǎng)貼壁細胞，培養(yǎng)4~6天后，采用第二DC細 胞培養(yǎng)試劑培養(yǎng)24~48h，得到DC細胞；第一DC細胞培養(yǎng)試劑為包含GM-SCF和IL-4的 培養(yǎng)基，第二DC細胞培養(yǎng)試劑為包含GM-SCF、IL-4、TNF-a和MDC的培養(yǎng)基。
[0024] 作為優(yōu)選，第一DC細胞培養(yǎng)試劑中，GM-SCF的濃度為100~1000U/mL，IL-4的濃 度為 100 ~1000U/mL。
[0025] 在本發(fā)明提供的一些實施例中，第一DC細胞培養(yǎng)試劑中，GM-SCF的濃度為100U/ mL，IL-4 的濃度為 100U/mL。
[0026] 在本發(fā)明提供的另一些實施例中，第一DC細胞培養(yǎng)試劑中，GM-SCF的濃度為 500U/mL，IL-4 的濃度為 500U/mL。
[0027] 在本發(fā)明提供的另一些實施例中，第一DC細胞培養(yǎng)試劑中，GM-SCF的濃度為 1000U/mL，IL-4 的濃度為 1000U/mL。
[0028] 作為優(yōu)選，第二DC細胞培養(yǎng)試劑中，GM-SCF的濃度為50~500U/mL，IL-4的濃度 為 50 ~500U/mL，TNF-a的濃度為 1〇〇 ~l〇〇〇U/mL，MDC的濃度為 1 ~20ng/mL。
[0029] 在本發(fā)明提供的一些實施例中，第二DC細胞培養(yǎng)試劑中，GM-SCF的濃度為50U/ mL，IL-4 的濃度為 50U/mL，TNF-a的濃度為l〇〇U/mL，MDC的濃度為Ing/mL。
[0030] 在本發(fā)明提供的另一些實施例中，第二DC細胞培養(yǎng)試劑中，GM-SCF的濃度為 200U/mL，IL-4 的濃度為 200U/mL，TNF-a的濃度為 500U/mL，MDC的濃度為 12ng/mL。
[0031] 在本發(fā)明提供的另一些實施例中，第二DC細胞培養(yǎng)試劑中，GM-SCF的濃度為 500U/mL，IL-4 的濃度為 500U/mL，TNF-a的濃度為l〇〇〇U/mL，MDC的濃度為 20ng/mL。
[0032] 作為優(yōu)選，步驟1中單個核細胞的密度為（2~8)X106/mL，細胞培養(yǎng)的時間為1~ 5h〇
[0033] 作為優(yōu)選，第一DC細胞培養(yǎng)試劑或第二DC細胞培養(yǎng)試劑中的基礎(chǔ)培養(yǎng)基為含有 血漿的無血清培養(yǎng)基，血漿的體積百分含量為5%~15%。
[0034] 作為優(yōu)選，DC細胞培養(yǎng)試劑中還包括含有血漿的無血清培養(yǎng)基。
[0035] 作為優(yōu)選，無血清培養(yǎng)基中血衆(zhòng)的體積百分含量為5%~15%。
[0036] 在本發(fā)明提供的一些實施例中，無血清培養(yǎng)基中血漿的體積百分含量為5%。
[0037] 在本發(fā)明提供的一些實施例中，無血清培養(yǎng)基中血漿的體積百分含量為10%。
[0038] 在本發(fā)明提供的一些實施例中，無血清培養(yǎng)基中血漿的體積百分含量為15%。
[0039] 作為優(yōu)選，血楽:為自體血楽；。
[0040] 在本發(fā)明提供的一些實施例中，DC-CIK細胞的培養(yǎng)方法包括如下步驟：
[0041](一）單個核細胞分離：
[0042]1.將外周血或臍帶血離心，吸取上層血漿，經(jīng)滅活后，離心，得到上清血漿；
[0043] 2.取下層血液，加入生理鹽水重懸，按稀釋后的血液：Ficoll分離液為2:1，把稀 釋后的血液緩慢加入到Ficoll分離液上層，使分層清晰；
[0044]3.離心，吸取中間白膜層，即為單個核細胞。
[0045](二）DC細胞分離培養(yǎng)
[0046] 1.獲得的單個核細胞加生理鹽水稀釋后，離心，清洗；
[0047] 2?加無血清培養(yǎng)基（含5%~15%自體血漿）重懸細胞，按（2~8)XIOfVmL接 種，靜置1~5h，獲得貼壁細胞；
[0048] 3.貼壁細胞加生理鹽水輕洗1遍，加入含5%~15%自體血漿的無血清培養(yǎng)基，同 時添加因子GM-SCF為100~1000U/mL，IL-4為100~lOOOU/mL進行培養(yǎng)；
[0049] 4?三天后補加GM-SCF為 100 ~1000U/mL，IL-4 為 100 ~1000U/mL，培養(yǎng)至 4 ~ 6天后換液，同時添加GM-SCF為50~500U/mL，IL-4為50~500U/mL、TNF-a為1〇〇~ 1000U/mL、MDC為 1 ~20ng/mL，培養(yǎng) 24 ~48h，得到DC細胞。
[0050] 本發(fā)明還提供了一種DC-CIK細胞的培養(yǎng)方法，采用本發(fā)明提供的DC細胞的培養(yǎng) 方法獲得的DC細胞制備DC-CIK細胞。
[0051] 本發(fā)明提供了一種DC細胞培養(yǎng)試劑及其培養(yǎng)方法。該DC細胞培養(yǎng)試劑包括第一 DC細胞培養(yǎng)試劑和第二DC細胞培養(yǎng)試劑；第一DC細胞培養(yǎng)試劑包括GM-SCF和IL-4;第二DC細胞培養(yǎng)試劑包括GM-SCF、IL-4、TNF-a和MDC。本發(fā)明具有如下有益效果：
[0052] 1、本發(fā)明通過改進DC細胞培養(yǎng)過程中細胞因子的種類和濃度，促進了DC細胞數(shù) 量的增殖，并保持較好的細胞活率和純度，40mL外周血通過本發(fā)明方法獲得的DC細胞第7 天時細胞數(shù)量可達2. 68XIO7~2. 79X107,活率可保持在97. 2%~98. 0%;
[0053] 2、通過本發(fā)明方法獲得的DC細胞的抗原遞呈能力增強，本發(fā)明實施例3提供的培 養(yǎng)方法得到的DC細胞的CD86+效應(yīng)細胞比例為84. 4%，具有更好的抗腫瘤效果。
【附圖說明】
[0054] 圖1示流式細胞儀檢測結(jié)果；其中，1-1示組Al中陰性對照組檢測細胞數(shù)量，1-2 示組Al中⑶86+效應(yīng)細胞含量，1-3示組B3中陰性對照組檢測細胞數(shù)量，1-4示組B3中 ⑶86+效應(yīng)細胞含量。
【具體實施方式】
[0055] 本發(fā)明公開了一種DC細胞培養(yǎng)試劑及其培養(yǎng)方法，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以借鑒本 文內(nèi)容，適當(dāng)改進工藝參數(shù)實現(xiàn)。特別需要指出的是，所有類似的替換和改動對本領(lǐng)域技術(shù) 人員來說是顯而易見的，它們都被視為包括在本發(fā)明。本發(fā)明的方法及應(yīng)用已經(jīng)通過較佳 實施例進行了描述，相關(guān)人員明顯能在不脫離本
【發(fā)明內(nèi)容】
、精神和范圍內(nèi)對本文所述的方 法和應(yīng)用進行改動或適當(dāng)變更與組合，來實現(xiàn)和應(yīng)用本發(fā)明技術(shù)。
[0056] 術(shù)語解釋：
[0057] GM-CSF:GM_CSF(人粒細胞-巨噬細胞集弱刺激因子），能刺激粒細胞及巨噬細胞 等白細胞的增殖、分化及活化作用，從而增強造血功能。它也能增強中性粒細胞，嗜曙紅細 胞及單核細胞的多種功能。它還能促使效應(yīng)細胞增強如吞噬細菌及消滅癌細胞等免疫活 動。
[0058] IL-4 :白細胞介素4,是促進B細胞增殖的因子，是T細胞自身分泌的生長因子，在 DC細胞培養(yǎng)中，可以抑制鐵壁的單個核細胞朝巨噬細胞分化。
[0059] TNF-a:腫瘤壞死因子-a(TumorNecrosisFactor，簡寫TNF)是一種能夠直接 殺傷腫瘤細胞而對正常細胞無明顯毒性的細胞因子，是迄今