一種新的二苯乙烯類化合物及其制備方法和醫(yī)藥用圖
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種新的二苯乙烯類化合物及其制備方法和醫(yī)藥用途，提供了該化合物結(jié)構(gòu)，含其的藥物組合物及其制備方法和應用。該化合物為首次報道，是一種結(jié)構(gòu)新穎的二苯乙烯類化合物，可以從大黃的干燥根及根莖中提取、分離純化得到。體外試驗證明該化合物能明顯提高ox?LDL損傷的人臍靜脈內(nèi)皮細胞的細胞活力，說明其具有抑制ox?LDL誘導的HUVEC損傷的作用。同時該化合物能顯著減少ox?LDL誘導的HUVEC凋亡，并且效果呈劑量依賴性，可以用來開發(fā)成內(nèi)皮細胞保護的藥物。
【專利說明】
一種新的二苯乙烯類化合物及其制備方法和醫(yī)藥用途
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明屬于藥物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及從大黃的干燥根及根莖中分離得到的一種具 有內(nèi)皮細胞保護作用的二苯乙烯類化合物及其制備方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 大黃(Rhubarb)為歷代醫(yī)家本草和歷版《中國藥典》收載的常用中藥，是傳統(tǒng)瀉下 類中藥的代表，來源于寥科植物掌葉大黃jOaiffatuff L.、唐古特大黃 Maxim, ex Balf.或藥用大黃他et/ff o/fici/3a_/e Baill?的干燥根及根莖。大 黃是中醫(yī)常用的瀉火藥物，現(xiàn)代醫(yī)學對大黃的功效與作用進行了藥理研究，并且分析了大 黃在治病方面的應用。大黃的主要功效有瀉火通便等，主要用來降血壓、降血脂等。在中國， 大黃主要作藥用，但在歐洲及中東，其大黃往往指另外幾個作食用的大黃屬品種，莖紅色。 氣清香，味苦而微澀，嚼之粘牙，有砂粒感。秋末莖葉枯萎或次春發(fā)芽前采挖。除去細根，刮 去外皮，切瓣或段，繩穿成串干燥或直接干燥。
[0003] 大黃具多類藥效活性成分，其中以蒽醌類、二蒽酮類、芪類、鞣質(zhì)和多糖研究最多。 大黃中具有致瀉作用的主要成分是蒽醌苷及雙蒽酮苷，其瀉下作用較相應苷元強。蒽醌苷 有:大黃酚-1-葡萄糖苷或大黃酚苷、大黃素-6-葡萄糖苷、蘆薈大黃素-8-葡萄糖苷、大黃素 甲醚葡萄糖苷、大黃酸-8-葡萄糖苷;掌葉大黃中還含有大黃素雙葡萄糖苷、蘆薈大黃素雙 葡萄糖苷、大黃酚雙葡萄糖苷。雙蒽酮苷有番瀉苷六、8、(：、04、？。大黃一直是常用大宗中藥 材，通過對近年來國內(nèi)外文獻的查閱可見，其成分研究已從傳統(tǒng)的蒽醌類、蒽酮類擴大到 二苯乙烯類、苯丁酮類及多糖類等，但少有新化合物被發(fā)現(xiàn)。
[0004] 現(xiàn)代藥理學研究表明，大黃藥理作用主要有調(diào)節(jié)胃腸功能、抗病原微生物、抗腫 瘤、保護心腦血管、抗炎、保肝及抗衰老等作用。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明的目的是提供一種從大黃的干燥根及根莖中分離得到的一種具有內(nèi)皮細 胞保護作用的二苯乙烯類化合物及其制備方法。
[0006] 本發(fā)明的上述目的是通過下面的技術(shù)方案得以實現(xiàn)的： 具有下述結(jié)構(gòu)式的化合物（I)，
[0007] 所述的化合物（I)的制備方法，包含以下操作步驟：（a)將大黃的干燥根及根莖粉 碎，用75~85%乙醇熱回流提取，合并提取液，濃縮至無醇味，依次用石油醚、乙酸乙酯和水飽 和的正丁醇萃取，分別得到石油醚萃取物、乙酸乙酯萃取物和正丁醇萃取物；（b)步驟(a)中 乙酸乙酯萃取物用大孔樹脂除雜，先用15%乙醇洗脫8個柱體積，再用75%乙醇洗脫12個柱體 積，減壓濃縮得75%乙醇洗脫物浸膏；（c)步驟(b)中75%乙醇洗脫浸膏用正相硅膠分離，依次 用體積比為80 :1、55:1、35:1、10:1和1:1的二氯甲烷-甲醇梯度洗脫得到5個組分；（(1)步驟 (c)中組分4用正相硅膠進一步分離，依次用體積比為15:1、10:1和5:1的二氯甲烷-甲醇梯 度洗脫得到3個組分；（e)步驟(d)中組分2用十八烷基硅烷鍵合的反相硅膠分離，用體積百 分濃度為75%的甲醇水溶液等度洗脫，收集8~10個柱體積洗脫液，洗脫液減壓濃縮得到純的 化合物(I)。
[0008] 進一步地，所述大孔樹脂為AB-8型大孔吸附樹脂。
[0009] 進一步地，所述用乙醇熱回流提取采用的乙醇濃度為80%。
[0010] -種藥物組合物，其中含有治療有效量的所述的化合物（I)和藥學上可接受的載 體。
[0011] 所述的化合物(I)在制備內(nèi)皮細胞保護的藥物中的應用。
[0012] 所述的藥物組合物在制備內(nèi)皮細胞保護的藥物中的應用。
[0013] 本發(fā)明化合物用作藥物時，可以直接使用，或者以藥物組合物的形式使用。
[0014] 該藥物組合物含有治療有效量的本發(fā)明化合物（I)，其余為藥物學上可接受的、對 人和動物無毒和惰性的可藥用載體和/或賦形劑。
[0015] 所述的可藥用載體或賦形劑是一種或多種選自固體、半固體和液體稀釋劑、填料 以及藥物制品輔劑。將本發(fā)明的藥物組合物以單位體重服用量的形式使用。本發(fā)明藥物可 通過口服或注射的形式施用于需要治療的患者。用于口服時，可將其制成片劑、緩釋片、控 釋片、膠囊、滴丸、微丸、混懸劑、乳劑、散劑或顆粒劑、口服液等;用于注射時，可制成滅菌的 水性或油性溶液、無菌粉針、脂質(zhì)體或乳劑等。
【具體實施方式】
[0016] 下面結(jié)合實施例進一步說明本發(fā)明的實質(zhì)性內(nèi)容，但并不以此限定本發(fā)明保護范 圍。盡管參照較佳實施例對本發(fā)明作了詳細說明，本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員應當理解，可以對 本發(fā)明的技術(shù)方案進行修改或者等同替換，而不脫離本發(fā)明技術(shù)方案的實質(zhì)和范圍。
[0017] 實施例1:化合物(I)分離制備及結(jié)構(gòu)確證 藥材和試劑來源：乙醇、石油醚、乙酸乙酯、正丁醇、二氯甲烷為分析純，購自上海凌峰 化學試劑有限公司，甲醇，分析純，購自江蘇漢邦化學試劑有限公司。
[0018] 經(jīng)鑒定該大黃為寥科植物藥用大黃油et? o/ficioaie Baill.的干燥根及根莖。
[0019] 制備方法：（a)大黃的干燥根及根莖（10kg)粉碎，用80%乙醇熱回流提?。?5LX 3 次），合并提取液，濃縮至無醇味(6L)，依次用石油醚(6L X 3次）、乙酸乙酯(6L X 3次)和水飽 和的正丁醇(6LX3次)萃取，分別得到石油醚萃取物、乙酸乙酯萃取物(355g)和正丁醇萃取 物；（b)步驟(a沖乙酸乙酯萃取物用AB-8型大孔樹脂除雜，依次用15%乙醇(8L)和75%(12L) 乙醇洗脫，收集75%乙醇洗脫液，減壓濃縮得75%乙醇洗脫物浸膏（154g);(c)步驟(b)中75% 乙醇洗脫浸膏用正相硅膠分離，依次用體積比為80:1 (8個柱體積）、55:1 (8個柱體積）、35:1 (6個柱體積）、10:1(8個柱體積)和1:1(5個柱體積）的二氯甲烷-甲醇梯度洗脫得到5個組 分；（d)步驟(c)中組分4(46g)用正相硅膠進一步分離，依次用體積比為15:1(8個柱體積）、 10:1(10個柱體積)和5:1(6個柱體積)的二氯甲烷-甲醇梯度洗脫得到3個組分；（e)步驟(d) 中組分2(27g)用十八烷基硅烷鍵合的反相硅膠分離，用體積百分濃度為75%的甲醇水溶液 等度洗脫，收集8-10個柱體積洗脫液，洗脫液減壓濃縮得到純的化合物(I)(35mg)。
[0020] 結(jié)構(gòu)確證：111^31]\^顯示[]\?1]+為111/2 361.2128，結(jié)合核磁特征可得分子式為 (：25112802，不飽和度為12。核磁共振氫譜數(shù)據(jù)5[1化口 111，00300,50(^取）：11-2(6.68,8)，11-7 (7.33，dJ=16.2Hz)，H-8(6.91，dJ=16.2Hz)，H-10(7.49，dJ=7.5Hz)，H-ll(7.35，tJ= 7.5Hz)，H-12(7.26，tJ=7.5Hz)，H-13(7.35，tJ=7.5Hz)，H-14(7.49，dJ=7.5Hz)，H-r (6.64，dJ=10.2Hz)，H-2'（5.60，dJ=10.2Hz)，H-4'（1.41，s)，H-5'（1.41，s)，H-l' '（3.37， overlap，2H)，H-2'，（5.06，tJ=7.8Hz)，H-4'，（1.83，s)，H-5' '（1.66，s)，3-0Me(3.84，s); 核磁共振碳譜數(shù)據(jù)Sc(ppm，CD30D，125MHz ) : 138 ? 2(C，1 -C)，101 ? 8(CH，2-C)，150 ? 5(C，3-C)， 109.7(C，4-C)，152.6(C，5-C)，119.9(C，6-C)，127.2(CH，7-C)，130.7(CH，8-C)，139.2(C，9-C)，127.4(CH，10-C)，128.9(CH，n-C)，128.1(CH，12-C)，128.9(CH，13-C)，127.4(CH，14-C)，117.8(CH，r-C)，129.2(CH，2'-C)，76.4(C，3'-C)，27.2(CH 3,4'-C)，27.2(CH3,5'-C)， 24.3(CH2，r'-C)，125.5(CH，2''-C)，129.6(C，3''-C)，17.5(CH 3,4''-C)，25.4(CH3,5''-C)，56 ? 8(CH3，3-0Me)。紅外波譜表明該化合物含有芳香環(huán)（1625cm-1，1585m- 1，1460cm-b基 團。1H-NMR譜存在一組無取代苯環(huán)質(zhì)子信號(g 7.49 (2H，d，J=7.5Hz )、7.35 (2H，t，J=7.5Hz ) 與7.26(111，丨，/=7.5抱），一組反式烯烴質(zhì)子信號（8 7.33(111，(1，/=16.2抱）與6.91(111，(1，/= 16.2Hz)，這表明該化合物含有反式二苯乙烯片段；一組二甲基烯丙基質(zhì)子信號<8 3.37 (211，(^643?)、5.06(111，扒/=7.8他），1.83(111，8)，1.66(111，8)，一組順式雙鍵質(zhì)子信號（8 6.64(111，(1，/=10.2抱）與5.60(111，(1，/=10.2泡），一組等價甲基質(zhì)子信號（8 1.41(611，8)，一 個芳烴質(zhì)子信號6.68(lH，s)，一個甲氧基質(zhì)子信號(g S.SeUHdhUC-NMI^DEPI^raSQC 譜中顯示有25個碳信號，包括五個甲基（一個甲氧基），一個亞甲基，十一個次甲基（五個烯 烴碳，六個芳烴碳），以及八個季碳(六個芳烴碳，一個烯烴碳）；以上功能結(jié)構(gòu)再結(jié)合不飽和 數(shù)表明該化合物為三環(huán)結(jié)構(gòu)。HMBC譜中，H-2與C-3，C-4和C-7、H-8與C-1、H-1'與C-4、H-2'與 C-4、H 2-1''與C-1和C-5以及H-2''與C-5的相關(guān)信號確認了化合物連接方式。由13C-NMR譜中 03與05的化學位移<?-3 150.5與(?-5 152.6可知(：-3、(：-5皆為連氧碳。腿8(：譜中，3-(116的11 與C-3的相關(guān)信號證明了 C-3位連有甲氧基，而11-1'、11-2'、113-4'、113-5'與(：-3'存在相關(guān)信 號，C-3'的化學位移為<?- 3, 75.4也提示C-3'為連氧碳，通過以上波譜分析推斷A環(huán)通過氧 連接與順式烯烴結(jié)構(gòu)環(huán)化形成二甲基苯并吡喃結(jié)構(gòu)。綜合氫譜、碳譜、HMBC譜和ROESY譜，以 及文獻關(guān)于相關(guān)類型核磁數(shù)據(jù)，可基本確定該化合物如下所示，立體構(gòu)型進一步通過ECD試 驗確定，理論值與實驗值基本一致。
[0022]實施例2:化合物（I)藥理作用試驗 一、材料和儀器 人臍靜脈內(nèi)皮細胞珠(HUVEC)由上海午立生物技術(shù)有限公司細胞庫提供。化合物(I)自 制，HPLC歸一化純度大于98%。1^]\〇-1640培養(yǎng)基、MTT、二甲基亞砜均購于Sigma公司。胎牛血 清購于HyCLone公司。FITC標記羊抗兔IgG、兔抗人第八因子相關(guān)抗原購于北京博奧森生物 技術(shù)有限公司。MDA含量檢測試劑盒購于南京建成生物研究所。AnnexinV-FITC凋亡檢測試 劑盒購于Centrebio公司。乙二胺四乙酸(EDTA)購于廣州威佳科技有限公司。
[0023] DK-8AD型電熱恒溫水槽(上海一恒科學儀器有限公司），ER-120A型電子分析天平 (島津公司），6219型電子pH計（上海任氏電子有限公司），高速低溫離心機（Sigma公司）， L420臺式低速自動平衡離心機(湘儀離心機儀器有限公司），SYC-2101水平搖床(其林貝爾 儀器制造有限公司），1〇〇〇此微量加樣槍X 1支、20-100yL微量加樣槍X 1支、1-20此微量加 樣槍X 1支(法國吉而森公司），⑶2(培養(yǎng)箱Heraeus公司），超凈臺（蘇凈集團安泰公司），倒 置相差顯微鏡(德國萊卡公司），酶標儀(Sigma)，F(xiàn)ACS CaLibur(流式細胞儀）。
[0024]二、試驗方法 1、臍靜脈內(nèi)皮細胞的培養(yǎng) 1.1培養(yǎng)條件 將新購入的HUVEC細胞株接種于含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基。置于37°C，5%C02 培養(yǎng)箱中，每2天更換1次培養(yǎng)基。
[0025] 1.2細胞傳代 取一瓶HUVEC在倒置相差顯微鏡下觀察細胞，如長成致密的單層，即可進行傳代;將培 養(yǎng)瓶輕輕搖動數(shù)次，懸浮起浮在細胞表面的碎片，然后連培養(yǎng)液一起倒出，吸取2~3mL PBS 液加入培養(yǎng)瓶中，輕輕振蕩后傾去，重復3次;加入lmL 0.25%胰酶，以能覆蓋瓶底為限，轉(zhuǎn)動 培養(yǎng)瓶，使?jié)駶櫿麄€細胞層，置37 °C孵育箱內(nèi)消化2~3min，待確認細胞己收縮變圓時為止； 加lmL培養(yǎng)液于培養(yǎng)瓶中終止消化，用吸管吸取培養(yǎng)液輕輕反復吹打瓶壁細胞，使之從瓶壁 脫離形成細胞懸液，注入離心管離心(800r/min，5min)后棄去上清液;加入3mL培養(yǎng)液于離 心管中，用吸管吸取培養(yǎng)液輕輕吹打數(shù)次，使細胞懸重，然后按1:3或1:4分配傳代培養(yǎng);置 于孵育箱內(nèi)37°C、5%C(Vg溫箱中培養(yǎng)，24h后換液，通常3-4天可形成單層，此時便可換維持 液供實驗用。
[0026] 1.3 HUVEC的計數(shù) 首先取待測的細胞懸液50yL滴入細胞計數(shù)板內(nèi)，按白細胞計數(shù)法，于低倍鏡下計數(shù)4角 的4個大方格內(nèi)的細胞總數(shù)，然后用以下公式計算細胞濃度:4個大方格內(nèi)的活細胞數(shù)/4 X 104=細胞數(shù)/mL 2、臍靜脈內(nèi)皮細胞的鑒定 在6孔培養(yǎng)板內(nèi)放置無菌蓋玻片lcm X lcm，將內(nèi)皮細胞懸液接種于蓋玻片上，待內(nèi)皮細 胞長至匯合狀態(tài)時，取出蓋玻片，用沖洗蓋玻片，放入100%丙酮中固定15min，用PBS沖洗 3次，每次2min，滴加3%的H 2〇2室溫孵育8min，PBS沖洗3次，每次2min，滴加兔抗人硼因子單克 隆抗體（1:100)，另一蓋玻片上不加一抗作陰性對照4°C過夜。次日，用PBS沖洗3次，每次 2min，滴加FITC標一記的羊抗兔IgG，37 °C孵育60min，用PBS沖洗3次，每次2min，熒光顯微鏡 下觀察并拍照。
[0027] 3、利用MTT比色法測定HUVEC的細胞活性 3.1利用MTT比色法觀察不同濃化合物（I)對臍靜脈內(nèi)皮細胞活性的影響 3.1.1傳代培養(yǎng) 將HUVEC按2X104/mL的密度用含10%FBS的RPMI-1640培養(yǎng)基接種于96孔板，每孔種植 200此。
[0028] 3.1.2分組加藥 傳代細胞培養(yǎng)24h后，用含10%FBS的RPMI-1640培養(yǎng)基配制藥物，將細胞隨機分為6組： 對照組（contro 1)，化合物（I)5yg/mL組，化合物（I) 1 Oyg/mL組，化合物（I)20iig/mL組，化合 物（I )40yg/mL組，化合物（I )80yg/mL組，每孔6孔。繼續(xù)培養(yǎng)48小時后，MTT法檢測細胞活性。
[0029] 3.1.3 MIT法檢測 直接向每孔加入20yL己配制好的MTT溶液，37°C孵育4h，吸凈上清，然后加入150yL DMS0。待結(jié)晶充分溶解后，利用酶標儀在波長490nm處測定0D值。
[0030] 3.2利用MTT比色法觀察不同濃度ox-LDL對臍靜脈內(nèi)皮細胞活性的影響 3.2.1傳代培養(yǎng)：同上。
[0031] 3.2.2分組加藥 細胞培養(yǎng)24h后，用含10%FBS的RPMI-1640培養(yǎng)基配制藥物，將細胞隨機分為6組:對照 組（(3〇111：1'〇1)，(《-〇)1(為自制）10辟/1111組，(《-〇)]^20邱/1111組，(《-〇)]^40邱/1111組，(《-〇)1^ 80yg/mL組，ox-LDL 160yg/mL組，每孔6孔。繼續(xù)培養(yǎng)24小時，MTT法檢測細胞活性。
[0032] 3.3利用MTT比色法觀察化合物（I)對ox-LDL誘導臍靜脈內(nèi)皮細胞損傷的干預作用 3.3.1傳代培養(yǎng)：同上。
[0033] 3.3.2分組加藥 細胞培養(yǎng)24h后，用10%FBS的RPMI-1640培養(yǎng)基配制藥物，將細胞隨機分為6組:對照組 (control)，ox-LDL 50iig/mL組，ox-LDL 50iig/mL+化合物（I)5iig/mL組，ox-LDL 50iig/mL+化 合物（I) 1 Oyg/mL組，ox-LDL 50yg/mL+化合物（I) 20yg/mL每孔6孔。繼續(xù)培養(yǎng)24小時后，MTT 法檢測細胞活性。
[0034] 4、利用流式細胞技術(shù)觀察化合物(I)對ox-LDL誘導臍靜脈內(nèi)皮細胞凋亡的干預作 4.1用傳代培養(yǎng) 將HUVEC按2X105/mL的密度用含10%FBS的RPMI-1640培養(yǎng)基接種于6孔板，每孔種植 1500此。
[0035] 4.2分組加藥 細胞培養(yǎng)24h后，以RPMI-1640無血清培養(yǎng)基血清剝奪24h，使細胞進入靜止狀態(tài)。用含 RPML-1640血清培養(yǎng)基配制藥物，將細胞隨機分為5組：對照組（control)，ox-LDL 50yg/mL 組，ox-LDL 50iig/mL+化合物（I)5yg/mL組，。x-LDL 50iig/mL+化合物（I) lOyg/mL組，。x-LDL 50iig/mL+化合物(I) 20iig/mL每孔加lmL含藥培養(yǎng)基。
[0036] 4.3操作步驟 加藥后12h取材，把細胞培養(yǎng)液吸出至離心管內(nèi)，PBS洗滌貼壁細胞一次，用胰酶細胞消 化液消化細胞。細胞消化下來后，轉(zhuǎn)移到離心管內(nèi)，PBS洗三次（1000g離心10分鐘）。加入200 此結(jié)合緩沖液，重懸細胞。加入10yL Annexinv-FITC、10yL PI染色液輕輕混勻。室溫避光孵 育15分鐘，30分鐘內(nèi)上機檢測細胞凋亡。
[0037] 5、統(tǒng)計學分析 采用SPSS13.0統(tǒng)計一軟件進行分析，結(jié)果表示為：均數(shù)士標準差(x土S)。方差齊時，兩 組比較采用LSD，如多組與對照組比較使用Dunnett檢驗，當方差不齊時，采用WeLch穩(wěn)健估 計，再采用T3方法兩兩比較。P〈0.05表示有統(tǒng)計學意義。
[0038]三、結(jié)果及結(jié)論 1、不同濃度化合物（I)對HUVEC細胞活力的影響 化合物（I)藥物在一定的濃度范圍才能發(fā)揮其藥理作用，而且不同的細胞體系對藥物 的敏感性也會有所不同。為此，首先用MTT法確定實驗用的藥物濃度范圍。結(jié)果如表1( KS對 照組#P〈0.01)顯示，不同濃度的化合物（I)對內(nèi)皮細胞的作用效應不同，低劑量的藥物濃 度(5~20yg/mL)細胞活性與對照組比較，沒有統(tǒng)計學差異。40yg/mL作用48小時后細胞活力 下降了約50%，80yg/mL作用48小時后細胞活力下降了 70%，與對照組比較有統(tǒng)計學差異(P〈 0.01)，產(chǎn)生了一定的毒副作用。因此本實驗所用的化合物（1)濃度為5、10、201^/!^，以排除 藥物自身對細胞的毒性作用。
[0039] 2、不同濃度ox-LDL對臍靜脈內(nèi)皮細胞活力的影響 由于氧化低密度脂蛋白氧化程度的差異，氧化低密度脂蛋白的細胞毒性范圍會有所不 同。因此我們先采用MTT確定ox-LDL細胞毒的范圍。結(jié)果如表2(K對照組*P〈0.05 #P〈 0.01)所示，不同濃度ox-LDL對HUVEC細胞活性影響不同。與對照組相比，10yg/mL組有促進 HUVEC細胞活性增加的趨勢，但與對照組比較沒有統(tǒng)計學差異(P>0.05) ; 20~100yg/mL各組 內(nèi)皮細胞活性隨濃度增加而減少，與對照組比較有統(tǒng)計學差異(P〈〇. 05或P〈0.01)。
[0040] 3、化合物(I)對ox-LDL誘導臍靜脈內(nèi)皮細胞損傷的干預作用 結(jié)果如表3( KS.ox-LDL group #P〈0.01)所示，ox_LDL(50iig/mL)組的細胞活性下降，與 對照組比較有統(tǒng)計學差異(P〈〇.〇l)，說明ox-LDL組細胞活性顯著降低，ox-LDL(50yg/mL)對 正常HUVEC具有損傷作用。化合物（I)不同劑量組的細胞活性均高于ox-LDL組，與ox-LDL組 比較差異有統(tǒng)計學意義(P〈〇.01)，說明此三個劑量組的細胞活性顯著高于ox-LDL組，提示 化合物（I)可抑制ox-LDL誘導的HUVEC損傷?；衔铮↖) 10yg/mL和化合物（I )20yg/mL組的細 胞活性高于化合物（I)5yg/mL組，與化合物（I)5yg/mL比較有統(tǒng)計學差異（P=0.01SP〈 0.01)?；衔铮↖ )20yg/mL細胞活性較化合物（I) 10yg/mL組有升高趨勢，但沒有統(tǒng)計學差異 (P=0.185)。提示化合物(I)的內(nèi)皮保護作用在一定范圍內(nèi)具有量效關(guān)系。
[0041 ] 4、化合物(I)對ox-LDL誘導損傷的臍靜脈內(nèi)皮細胞凋亡的影響 各組流式細胞結(jié)果顯示:各組細胞的凋亡率差異有統(tǒng)計學意義(P〈〇. 01)，〇x-LDL組的 增殖指數(shù)明顯升高，與對照組比較有統(tǒng)計學差異（P〈〇.〇l)說明〇x-LDL(50iig/mL)對正常 HUVEC具有損傷作用?；衔铮↖)不同劑量組的凋亡率均低于ox-LDL組，與ox-LDL組比較差 異有統(tǒng)計學意義(P〈〇. 01)，說明此三個劑量組的凋亡率顯著低于ox-LDL組，提示化合物（I) 可抑制ox-LDL誘導的HUVEC凋亡。化合物（I)不同劑量組的凋亡率隨著劑量升高逐漸降低， 各組之間差異有統(tǒng)計學意義(P〈〇.01)。結(jié)果見表4(KS ox-LDL group #P〈0.01)。提示化合 物(I)的內(nèi)皮保護效應在一定范圍內(nèi)具有量效關(guān)系。
[0042]結(jié)論，本研究采用MTT法檢測發(fā)現(xiàn)化合物（I)能明顯提高ox-LDL損傷的人臍靜脈內(nèi) 皮細胞的細胞活力，說明其具有抑制0 X - L D L誘導的H U V E C損傷的作用。進一步采用 AnnexinV-FITC、PI雙染色流式細胞術(shù)檢測細胞凋亡，研究發(fā)現(xiàn)各濃度組化合物（I)均能顯 著減少ox-LDL誘導的HUVEC凋亡，并且效果呈劑量依賴性。提示化合物（I)能通過抑制ox-LDL誘導的HUVEC凋亡來實現(xiàn)內(nèi)皮保護作用。
[0043] 表1不同濃度化合物（I)對HUVEC細胞活力的影響(x土s，n=6)
表2 ox-LDL對HUVEC細胞活力的影響（x土s n=6 )
表3不同劑化合物（I)對ox-LDL誘導HUVEC損傷的干預作用(x 土 s，n=6 )
表4不同劑量化合物（I)對ox-LDL誘導HUVEC凋亡的作用(x土s，n=3)
實施例3 片劑的制備:按實施例1方法先制得化合物(I )，以及利用有機酸如酒石酸、或檸檬酸或 甲酸或乙二酸等、無機酸如鹽酸或硫酸或磷酸制成的鹽，按其與賦形劑重量比為1:9的比例 加入賦形劑，制粒壓片。
[0044] 實施例4 口服液制備:按實施例1方法先制得化合物(I)，以及利用有機酸如酒石酸、或檸檬酸或 甲酸或乙二酸等、無機酸如鹽酸或硫酸或磷酸制成的鹽，按常規(guī)口服液制法制成口服液。
[0045] 實施例5 膠囊劑或顆粒劑的制備:按實施例1方法先制得化合物(I)，以及利用有機酸如酒石酸、 或檸檬酸或甲酸或乙二酸等、無機酸如鹽酸或硫酸或磷酸制成的鹽，按其與賦形劑重量比 為1:9的比例加入賦形劑，制成膠囊或顆粒劑。
[0046] 實施例6 注射液的制備:按實施例1方法先制得化合物(I)，以及利用有機酸如酒石酸、或檸檬酸 或甲酸或乙二酸等、無機酸如鹽酸或硫酸或磷酸制成的鹽，按常規(guī)加注射用水，精濾，灌封 滅菌制成注射液。
[0047] 實施例7 無菌粉針的制備:按實施例1方法先制得化合物(I)，以及利用有機酸如酒石酸、或檸檬 酸或甲酸或乙二酸等、無機酸如鹽酸或硫酸或磷酸制成的鹽，將其溶于無菌注射用水中，攪 拌使溶，用無菌抽濾漏斗過濾，再無菌精濾，分裝于安瓿中，低溫冷凍干燥后無菌熔封得粉 針劑。
[0048]上述實施例的作用在于說明本發(fā)明的實質(zhì)性內(nèi)容，但并不以此限定本發(fā)明的保護 范圍。本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員應當理解，可以對本發(fā)明的技術(shù)方案進行修改或者等同替換， 而不脫離本發(fā)明技術(shù)方案的實質(zhì)和保護范圍。
【主權(quán)項】
1. 具有下述結(jié)構(gòu)式的化合物（I)，2. 權(quán)利要求1所述的化合物（I)的制備方法，其特征在于包含W下操作步驟：（a)將大黃 的干燥根及根莖粉碎，用75~85%乙醇熱回流提取，合并提取液，濃縮至無醇味，依次用石油 酸、乙酸乙醋和水飽和的正下醇萃取，分別得到石油酸萃取物、乙酸乙醋萃取物和正下醇萃 取物；（b)步驟(a)中乙酸乙醋萃取物用大孔樹脂除雜，先用15%乙醇洗脫8個柱體積，再用 75%乙醇洗脫12個柱體積，減壓濃縮得75%乙醇洗脫物浸膏；（C)步驟(b)中75%乙醇洗脫浸膏 用正相硅膠分離，依次用體積比為80:1、55:1、35:1、10:1和1:1的二氯甲燒-甲醇梯度洗脫 得到5個組分；（d)步驟(C)中組分4用正相硅膠進一步分離，依次用體積比為15:1、10:1和5: 1的二氯甲燒-甲醇梯度洗脫得到3個組分；（e)步驟(d)中組分2用十八烷基硅烷鍵合的反相 硅膠分離，用體積百分濃度為75%的甲醇水溶液等度洗脫，收集8~10個柱體積洗脫液，洗脫 液減壓濃縮得到純的化合物(I)。3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的化合物（I)的制備方法，其特征在于:所述大孔樹脂為AB-8型 大孔吸附樹脂。4. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的化合物（I)的制備方法，其特征在于:所述用乙醇熱回流提取 采用的乙醇濃度為80%。5. -種藥物組合物，其中含有治療有效量的權(quán)利要求1所述的化合物（I)和藥學上可接 受的載體。6. 權(quán)利要求1所述的化合物（I)在制備內(nèi)皮細胞保護的藥物中的應用。7. 權(quán)利要求5所述的藥物組合物在制備內(nèi)皮細胞保護的藥物中的應用。
【文檔編號】A61P9/00GK105968079SQ201610321333
【公開日】2016年9月28日
【申請日】2016年5月16日
【發(fā)明人】徐珍
【申請人】蘇州畢諾佳醫(yī)藥技術(shù)有限公司