本發(fā)明涉及用于從碳源生產(chǎn)至少一種鼠李糖脂的方法和細(xì)胞。

發(fā)明背景

在市場上對于作為目前可得的從石油化學(xué)原料獲得的表面活性劑的合適替代物的、從可再生原料生產(chǎn)的、生物可降解的表面活性劑存在普遍需求。該需求特別地隨著可預(yù)見的石油化學(xué)原料短缺和增加的對于表面活性劑的需求而得到加強。鼠李糖脂是這樣的表面活性劑的至少一個例子。鼠李糖脂代表了經(jīng)濟上令人感興趣的類別，因為它們可以潛在地代替從石油或其產(chǎn)品制造的常規(guī)的表面活性劑，并因此常常改善所得制劑的環(huán)保性能。

這些鼠李糖脂包含至少一個單鼠李糖基脂質(zhì)或兩個鼠李糖基團(二鼠李糖基脂質(zhì))和一個或兩個3-羥基脂肪酸殘基(Handbook of Hydrocarbon and Lipid Microbiology,2010)。它們具有表面活性特性，這是在所有種類的應(yīng)用中對于用作表面活性劑所需要的(參見Leitermann等人,2009)。特別地，鼠李糖脂可以在很大程度上在家庭、清潔、美容、食品加工、制藥、植物保護(hù)和其他應(yīng)用中用作表面活性劑。

目前所使用的用于生產(chǎn)這些鼠李糖脂的方法采用各種各樣的人和動物的致病菌，特別是假單胞菌屬(Pseudomonas)和伯克霍爾德氏菌屬(Burkholderia)的成員，的野生型分離株(Handbook of Hydrocarbon and Lipid Microbiology,2010)。這些致病生物能夠?qū)οM者引起疾病這一事實相當(dāng)大地降低了消費者對于這些常規(guī)地生產(chǎn)的鼠李糖脂的接受。進(jìn)一步地，更高的安全性要求也增加了生產(chǎn)成本，這是由于增加的資本支出和可能額外的生產(chǎn)步驟。由于其中使用了這些鼠李糖脂的產(chǎn)品大多數(shù)是可以以非常低的成本生產(chǎn)的批量規(guī)模化學(xué)品，因此鼠李糖脂還必須能夠以盡可能低的成本生產(chǎn)，其中沒有對于消費者的健康風(fēng)險并且盡可能具有確定的特性。

可用于生產(chǎn)鼠李糖脂的目前的方法包括使用這些致病生物和作為唯一底物或共底物的植物油(Handbook of Hydrocarbon and Lipid Microbiology,2010)。然而，相比于其他碳源，例如葡萄糖、蔗糖或多糖(例如淀粉、纖維素和半纖維素)、甘油、CO，CO₂或CH₄而言，植物油是相當(dāng)昂貴的原料。還通過使用碳源例如葡萄糖、蔗糖或多糖由非致病生物來生產(chǎn)鼠李糖脂，如在WO2012013554A1中所教導(dǎo)的。

但是，對于通過使用非致病生物和備選的可再生原料有效地(即便宜地和從健康觀點來看安全地)和以不止足夠的量來生產(chǎn)鼠李糖脂(特別地，單鼠李糖基脂質(zhì)和/或二鼠李糖基脂質(zhì))仍然存在需要。

發(fā)明描述

根據(jù)一個方面，本發(fā)明涉及能夠解決現(xiàn)有技術(shù)中所存在的問題的方法。特別地，本發(fā)明涉及通過在至少一種碳源存在下培養(yǎng)重組細(xì)胞來生產(chǎn)至少一種鼠李糖脂的方法，其中所述碳源為至少一種具有恰好4個碳原子的C₄分子。所述重組細(xì)胞包含相比于所述細(xì)胞的野生型而言增加的酶α/β水解酶、鼠李糖基轉(zhuǎn)移酶I或鼠李糖基轉(zhuǎn)移酶II中至少一種的活性。該方法可能尤其是有利的，因為它可以允許單鼠李糖基脂質(zhì)和/或二鼠李糖基脂質(zhì)的高選擇性生產(chǎn)，其中所產(chǎn)生的不希望的副產(chǎn)物和中間體的數(shù)量減少。例如，相比于目前可得的方法而言，可以至少存在更少的中間體，例如根據(jù)本發(fā)明的任一方面所形成的β-羥基脂肪酸的二聚體(脂肪酸二聚體)。

根據(jù)本發(fā)明的任一方面的方法的進(jìn)一步優(yōu)點包括但不限于：可以使用非致病的和培養(yǎng)簡單的生物。進(jìn)一步的優(yōu)點可以包括：用根據(jù)本發(fā)明的任一方面的方法，可以不是必需的是，油類和簡單碳水化合物底物(例如葡萄糖、果糖或蔗糖)是唯一底物或共底物。根據(jù)本發(fā)明的任一方面，另一個優(yōu)點可以是：可以產(chǎn)生具有確定的和可調(diào)節(jié)的特性的鼠李糖脂。另外，特別地，可以產(chǎn)生二鼠李糖基脂質(zhì)。進(jìn)一步的優(yōu)點可以是：可以以比用未增強這些活性的細(xì)胞更高的空間-時間和碳產(chǎn)率來產(chǎn)生鼠李糖脂。

根據(jù)本發(fā)明的任一方面，可以通過使用本發(fā)明的任一方面而產(chǎn)生的鼠李糖脂和/或其鼠李糖脂混合物同樣可以是本發(fā)明的主題。有利地可以至少在清潔或護(hù)理試劑中，在美容學(xué)、皮膚病學(xué)或藥學(xué)制劑中，以及在植物保護(hù)制劑、表面活性劑濃縮物等中使用可以根據(jù)本發(fā)明的任一方面而產(chǎn)生的鼠李糖脂和混合物。

術(shù)語“護(hù)理試劑”在此是指實現(xiàn)下列目的的制劑：維持物品處于其原始形式，降低或避免外部影響(例如，時間、光、溫度、壓力、污染、與接觸該物品的其他反應(yīng)性化合物的化學(xué)反應(yīng)等)和老化、污染、材料疲勞的效應(yīng)，和/或甚至用于改善該物品的所希望的正面特性。物品的所希望的正面特性的例子可以包括諸如物品的經(jīng)改善的毛發(fā)光澤或更大的彈性等的特征。

“植物保護(hù)制劑”在此是指通過其制備的性質(zhì)而用于植物保護(hù)的那些制劑。如果在該制劑中包含至少一種從由除草劑、殺真菌劑、殺昆蟲劑、殺螨劑、殺線蟲劑、針對鳥害的保護(hù)性物質(zhì)、植物營養(yǎng)物和土壤結(jié)構(gòu)改善試劑組成的組中選擇的化合物，那么這特別地是該情況。

根據(jù)本發(fā)明的任一方面而產(chǎn)生的鼠李糖脂可以用作在家政、工業(yè)中(特別是在硬表面、皮革和/或紡織品上)使用的護(hù)理和清潔試劑的組分。

根據(jù)本發(fā)明的一個方面，提供了至少一種制備至少一種鼠李糖脂的方法，該方法包括：

-使重組細(xì)胞與包含碳源的培養(yǎng)基相接觸；和

-在對于由所述細(xì)胞從所述碳源制備所述鼠李糖脂來說合適的條件下培養(yǎng)所述細(xì)胞，

其中所述重組細(xì)胞已經(jīng)如此地進(jìn)行了基因工程改造，從而所述細(xì)胞具有相比于所述細(xì)胞的野生型而言增加的酶E₁、E₂和E₃中至少一種的活性，其中酶E₁為α/β水解酶，酶E₂為鼠李糖基轉(zhuǎn)移酶I，和酶E₃為鼠李糖基轉(zhuǎn)移酶II，并且其中所述碳源為C₄分子。

根據(jù)本發(fā)明的另一個方面，提供了能夠從C₄分子形成至少一種鼠李糖脂的細(xì)胞，其中所述細(xì)胞已經(jīng)如此地進(jìn)行了基因工程改造，從而所述細(xì)胞具有相比于所述細(xì)胞的野生型而言增加的氧化還原酶以及酶E₁、E₂和E₃中至少一種的活性，其中酶E₁為α/β水解酶，酶E₂為鼠李糖基轉(zhuǎn)移酶I，和酶E₃為鼠李糖基轉(zhuǎn)移酶II。

更特別地，根據(jù)本發(fā)明的任一方面的細(xì)胞可以能夠形成鼠李糖脂，并且具有相比于其野生型而言增加的基因產(chǎn)物rhlA、rhlB和rhlC的至少一種基因產(chǎn)物或同系物的活性。至少在一個實例中，可以將來自銅綠假單胞菌(Pseudomonas aeruginosa)的基因rhlA、rhlB和rhlC引入到GRAS(“generally regarded as save(通常被認(rèn)為安全的)”)生物中(如在WO2012013554A1中所描述的)，以從C₄分子生產(chǎn)鼠李糖脂。在一個特別的實例中，根據(jù)本發(fā)明的任一方面的細(xì)胞可以為菌株KT2440的惡臭假單胞菌(P.putida)。

特別地，在此所提及的C₄分子可以是包含C、H和/或O的結(jié)構(gòu)。特別地，所述C₄分子可以是任何這樣的化合物，在所述化合物的結(jié)構(gòu)中包含恰好4個碳原子(即在每個單元中不大于或不小于4個碳原子)。根據(jù)本發(fā)明的任一方面的“C₄分子”是指這樣的有機化合物，其包含恰好四個C原子和可變數(shù)目的H原子，這取決于在具有4個碳原子的該化合物的結(jié)構(gòu)中所發(fā)現(xiàn)的其他原子。所述C₄分子還可以包含O原子。特別地，根據(jù)本發(fā)明的任一方面的C₄分子可以是丁烷和丁烷的氧化產(chǎn)物。丁烷的氧化產(chǎn)物至少包括1-丁醇、2-丁醇、1-丁醛、丁酮和丁酸。特別地，所述C₄分子可以選自由下列各項組成的組：丁烷、1-丁醇、2-丁醇、1-丁醛、丁酮、丁酸(丁酸鹽)及其組合。所述C₄分子還可以是四糖。

更特別地，根據(jù)本發(fā)明的任一方面進(jìn)行使用的C₄分子可以僅僅是一種類型的C₄分子(即僅丁烷、1-丁醇、2-丁醇、1-丁醛、丁酮或丁酸)。在一個實例中，所使用的C₄分子可以是任何從由下列各項組成的組中選擇的C₄分子的組合：丁烷、1-丁醇、2-丁醇、1-丁醛、丁酮和丁酸。例如，根據(jù)本發(fā)明的任一方面的C₄分子可以是丁烷和1-丁醇、丁烷和2-丁醇、丁烷和1-丁醛、丁烷和丁酮、丁烷和丁酸等的組合。在一個實例中，可以存在至少3、4、5或6種不同的C₄分子，其用作根據(jù)本發(fā)明的任一方面的碳源。在另一個實例中，可以存在丁烷、1-丁醇和丁酸的組合，其用作根據(jù)本發(fā)明的任一方面的C₄分子。在另一個實例中，可以單獨地或者與丁烷和丁烷氧化產(chǎn)物相組合地使用四糖，作為根據(jù)本發(fā)明的任一方面的碳源。

根據(jù)本發(fā)明的任一方面進(jìn)行使用的培養(yǎng)基包含至少一種碳源。在所述培養(yǎng)基中的碳源可以至少為C₄分子。特別地，在所述培養(yǎng)基中的碳源可以基本上由C₄分子組成或者實質(zhì)上包含C₄分子。特別地，C₄分子的總量至少為或等于所述培養(yǎng)基中總碳含量的20重量％、40重量％、50重量％、60重量％或70重量％的在總培養(yǎng)基中的C₄分子碳源。更特別地，C₄分子的總量至少為或等于所述培養(yǎng)基中碳源的50重量％、70重量％或80重量％。更加特別地，所述C₄分子可以至少為或等于所述培養(yǎng)基中碳源的90重量％或大約100重量％。

在一個實例中，所述培養(yǎng)基可以包含第二種碳源。特別地，所述碳源可以是碳水化合物例如葡萄糖、蔗糖、阿拉伯糖、木糖、乳糖、果糖、麥芽糖、糖蜜、淀粉、纖維素和半纖維素，植物油和動物油和脂肪例如大豆油、紅花油、花生油、大麻子油、麻風(fēng)樹油、椰子脂、葫蘆油、亞麻子油、玉米油、罌粟子油、月見草油、橄欖油、棕櫚仁油、棕櫚油、菜子油、芝麻油、向日葵油、葡萄子油、核桃油、小麥胚芽油和椰子油，脂肪酸例如辛酸、癸酸、月桂酸、肉豆蔻酸、棕櫚酸、棕櫚油酸、硬脂酸、花生四烯酸、山萮酸、油酸、亞油酸、亞麻酸、γ-亞麻酸和其甲基或乙基酯以及包含上面提及的任何脂肪酸的脂肪酸混合物、甘油單酯、甘油二酯和甘油三酯，醇類例如甘油、乙醇和甲醇，烴類例如甲烷，含碳?xì)怏w和氣體混合物例如CO、CO₂、合成氣或煙道氣，氨基酸例如L-谷氨酸或L-纈氨酸，或者有機酸例如乙酸。這些物質(zhì)可以獨個地或作為混合物進(jìn)行使用?？梢允褂锰妓衔铮貏e是單糖、寡糖或多糖，作為碳源，如在US 6,01,494和US 6,136,576中所描述的，以及烴類，特別是烷烴、烯烴和炔烴以及從其衍生的單羧酸和從這些單羧酸衍生的甘油單酯、甘油二酯和甘油三酯，以及甘油和乙酸鹽?？梢允褂冒视团c辛酸、癸酸、月桂酸、肉豆蔻酸、棕櫚酸、棕櫚油酸、硬脂酸、花生四烯酸、山萮酸、油酸、亞油酸、亞麻酸和/或γ-亞麻酸的酯化產(chǎn)物的甘油單酯、甘油二酯和甘油三酯。

根據(jù)本發(fā)明的任一方面，下述事實是一個巨大的優(yōu)勢：所述細(xì)胞可以能夠從最簡單的碳源例如丁烷形成鼠李糖脂，從而在根據(jù)本發(fā)明的任一方面的培養(yǎng)基中提供更長鏈的碳源可以不是必需的。在在根據(jù)本發(fā)明的任一方面的培養(yǎng)基中可檢測量的具有大于六個碳原子的鏈長的羧酸或者從這些可衍生出的酯或甘油酯無法可得的情況下，這可以尤其是有利的。

可以在所述培養(yǎng)基中適當(dāng)?shù)厥褂脡A性化合物例如氫氧化鈉、氫氧化鉀、氨氣或氨水或者酸性化合物例如磷酸或硫酸，以用于培養(yǎng)物的pH控制?？梢允褂孟輨├缰舅峋垡叶减?，以用于控制泡沫發(fā)展?？梢韵蛩雠囵B(yǎng)基中添加合適的選擇性地起作用的物質(zhì)例如抗生素，以用于維持質(zhì)粒的穩(wěn)定性。為了維持有氧條件，可以將氧氣或含氧氣體混合物例如空氣摻入到培養(yǎng)物中。

培養(yǎng)物的溫度通常大于或等于20℃，25℃，其也可以大于或等于40℃，其中有利地，可以使用至少或等于95℃，特別地至少或等于90℃，和更加特別地至少或等于80℃的培養(yǎng)溫度。

技術(shù)人員將會理解什么是對于培養(yǎng)根據(jù)本發(fā)明的任一方面的重組細(xì)胞以從至少一種C₄分子生產(chǎn)鼠李糖脂來說合適的條件。

通過使用本領(lǐng)域中已知的基本方法，技術(shù)人員將會能夠改變所述培養(yǎng)基中的條件以適合根據(jù)本發(fā)明的任一方面所使用的相關(guān)細(xì)胞。

在根據(jù)本發(fā)明的任一方面的方法中，可以將由所述細(xì)胞所形成的鼠李糖脂任選地從細(xì)胞和/或培養(yǎng)基中分離。可以應(yīng)用所有本領(lǐng)域中已知用于從復(fù)雜組合物中分離低分子量物質(zhì)的方法。例如，諸如過濾、提取、吸附(色譜法)、結(jié)晶等的方法可以在產(chǎn)物相中使用。

在產(chǎn)物相中的分離出的產(chǎn)物也可以包含其他不想要的生物質(zhì)殘留物和各種雜質(zhì)，例如油、脂肪酸和其他營養(yǎng)培養(yǎng)基成分。這些雜質(zhì)等的分開可以以無溶劑的過程來進(jìn)行。因此，例如，可以首先將分離出的產(chǎn)物用水進(jìn)行稀釋以促進(jìn)pH的調(diào)整。然后，可以通過經(jīng)由分別用酸或堿降低或升高pH而將鼠李糖脂轉(zhuǎn)化成水溶性形式來使產(chǎn)物和水性均質(zhì)化?？梢酝ㄟ^在較高的溫度下(例如在60至90℃下)溫育反應(yīng)混合物和/或用持續(xù)不斷的混合來協(xié)助鼠李糖脂在水相中的可溶性。然后，通過隨后用堿或酸升高或降低pH，可以將鼠李糖脂再次轉(zhuǎn)化成水不溶性形式，從而它們可以容易地與水相相分開。然后，可以用水洗滌產(chǎn)物相一次或數(shù)次以去除水溶性雜質(zhì)。

可以將油殘留物分離開，例如通過借助于合適的溶劑(有利地借助于有機溶劑)進(jìn)行提取?？梢允褂猛闊N例如正己烷等作為溶劑。

作為上面所描述的無溶劑過程的備選方案，可以通過使用合適的溶劑(例如，酯例如乙酸乙酯、乙酸丁酯等)來實施產(chǎn)物與水相的分開。這些提取步驟可以以任何所希望的順序來進(jìn)行。技術(shù)人員將會能夠容易地改變慣常適合于所述細(xì)胞和待提取的鼠李糖脂的步驟順序和/或溶劑。

在另一個實例中，可以在根據(jù)本發(fā)明的任一方面而產(chǎn)生的鼠李糖脂的提取中使用溶劑。特別地，可以使用有機溶劑。更特別地，可以使用正戊醇作為溶劑。例如，進(jìn)行蒸餾以去除溶劑。隨后，可以進(jìn)一步純化經(jīng)凍干的產(chǎn)物，例如借助于色譜學(xué)方法。作為實例，可以采用借助于合適的溶劑進(jìn)行沉淀，借助于合適的溶劑進(jìn)行提取，絡(luò)合(例如借助于環(huán)糊精或環(huán)糊精衍生物)，結(jié)晶，借助于色譜學(xué)方法進(jìn)行純化或分離，或者將鼠李糖脂轉(zhuǎn)化為可容易地分開的衍生物。

根據(jù)本發(fā)明的任一方面所使用的重組細(xì)胞已經(jīng)如此地進(jìn)行了基因工程改造，從而所述細(xì)胞具有相比于所述細(xì)胞的野生型而言增加的酶E₁、E₂和E₃中至少一種的活性，其中酶E₁為α/β水解酶，酶E₂為鼠李糖基轉(zhuǎn)移酶I，和酶E₃為鼠李糖基轉(zhuǎn)移酶II。根據(jù)本發(fā)明的任一方面所使用的重組細(xì)胞可以按照在WO2012013554A1中公開的方法來制備。

特別地，在根據(jù)本發(fā)明的任一方面的細(xì)胞中，酶E₁可以能夠催化3-羥基鏈烷?；?ACP經(jīng)由3-羥基鏈烷酰基-3-羥基鏈烷酸-ACP轉(zhuǎn)化為羥基鏈烷?；?3-羥基鏈烷酸；酶E₂可以是鼠李糖基轉(zhuǎn)移酶I并且可以能夠催化dTDP-鼠李糖和3-羥基鏈烷酰基-3-羥基鏈烷酸酯轉(zhuǎn)化為α-L-吡喃型鼠李糖基-3-羥基鏈烷?；?3-羥基鏈烷酸酯；和酶E₃可以是鼠李糖基轉(zhuǎn)移酶II并且可以能夠催化dTDP-鼠李糖和α-L-吡喃型鼠李糖基-3-羥基鏈烷?；?3-羥基鏈烷酸酯轉(zhuǎn)化為α-L-吡喃型鼠李糖基-(1-2)-α-L-吡喃型鼠李糖基-3-羥基鏈烷?；?3-羥基鏈烷酸酯，其中這些酶E₁、E₂和E₃可以選自由下列各項組成的組：至少一種酶E₁，其包含從由SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6及其片段組成的組中選擇的氨基酸序列；至少一種酶E₂，其包含從由SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11及其片段組成的組中選擇的氨基酸序列；和至少一種酶E₃，其包含從由SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:15及其片段組成的組中選擇的氨基酸序列。關(guān)于酶E₁、E₂或E₃中任一個的片段可以包含這樣的多肽序列，在所述多肽序列中相比于各自酶的序列而言至多25％的氨基酸基團通過缺失、插入、置換或其組合而被修飾，并且所述片段包含各自酶的酶活性的至少10％。

特別地，在根據(jù)本發(fā)明的任一方面的細(xì)胞中的酶E₁可以選自由下列各項組成的組：

酶E_1a，其具有多肽序列SEQ ID NO:2，或者具有這樣的多肽序列，在該多肽序列中相比于參考序列SEQ ID NO:2而言至多25％、20％、15％，特別地至多10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％、1％的氨基酸基團通過缺失、插入、置換或其組合而被修飾，并且該多肽序列仍然有著具有參考序列SEQ ID NO:2的酶的酶活性的至少10％、50％、80％，特別地大于90％，其中關(guān)于酶E_1a的酶活性可以是指將3-羥基癸酰基-ACP經(jīng)由3-羥基癸?；?3-羥基癸酸-ACP轉(zhuǎn)化為羥基癸?；?3-羥基癸酸的能力；

酶E_1b，其具有多肽序列SEQ ID NO:3，或者具有這樣的多肽序列，在該多肽序列中相比于參考序列SEQ ID NO:3而言至多25％、20％、15％，特別地至多10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％、1％的氨基酸基團通過缺失、插入、置換或其組合而被修飾，并且該多肽序列仍然有著具有參考序列SEQ ID NO:3的酶的酶活性的至少10％、50％、80％，特別地大于90％，其中關(guān)于酶E_1b的酶活性可以是指將3-羥基癸?；?ACP經(jīng)由3-羥基癸?；?3-羥基癸酸-ACP轉(zhuǎn)化為羥基癸酰基-3-羥基癸酸的能力；

酶E_1c，其具有多肽序列SEQ ID NO:4，或者具有這樣的多肽序列，在該多肽序列中相比于參考序列SEQ ID NO:4而言至多25％、20％、15％，特別地至多10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％、1％的氨基酸基團通過缺失、插入、置換或其組合而被修飾，并且該多肽序列仍然有著具有參考序列SEQ ID NO:4的酶的酶活性的至少10％、50％、80％，特別地大于90％，其中關(guān)于酶E_1c的酶活性可以是指將3-羥基癸酰基-ACP經(jīng)由3-羥基癸?；?3-羥基癸酸-ACP轉(zhuǎn)化為羥基癸酰基-3-羥基癸酸的能力；

酶E_1d，其具有多肽序列SEQ ID NO:5，或者具有這樣的多肽序列，在該多肽序列中相比于參考序列SEQ ID NO:5而言至多25％、20％、15％，特別地至多10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％、1％的氨基酸基團通過缺失、插入、置換或其組合而被修飾，并且該多肽序列仍然有著具有參考序列SEQ ID NO:5的酶的酶活性的至少10％、50％、80％，特別地大于90％，其中關(guān)于酶E_1d的酶活性可以是指將3-羥基癸酰基-ACP經(jīng)由3-羥基癸?；?3-羥基癸酸-ACP轉(zhuǎn)化為羥基癸酰基-3-羥基癸酸的能力；和

酶E_1e，其具有多肽序列SEQ ID NO:6，或者具有這樣的多肽序列，在該多肽序列中相比于參考序列SEQ ID NO:6而言至多25％、20％、15％，特別地至多10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％、1％的氨基酸基團通過缺失、插入、置換或其組合而被修飾，并且該多肽序列仍然有著具有參考序列SEQ ID NO:6的酶的酶活性的至少10％、50％、80％，特別地大于90％，其中關(guān)于酶E_1e的酶活性可以是指將3-羥基癸酰基-ACP經(jīng)由3-羥基癸?；?3-羥基癸酸-ACP轉(zhuǎn)化為羥基癸?；?3-羥基癸酸的能力。

特別地，在根據(jù)本發(fā)明的任一方面的細(xì)胞中所使用的酶E₂可以選自由下列各項組成的組：

酶E_2a，其具有多肽序列SEQ ID NO:7，或者具有這樣的多肽序列，在該多肽序列中相比于參考序列SEQ ID NO:7而言至多25％、20％、15％，特別地至多10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％、1％的氨基酸基團通過缺失、插入、置換或其組合而被修飾，并且該多肽序列仍然有著具有參考序列SEQ ID NO:7的酶的酶活性的至少10％、50％、80％，特別地大于90％，其中關(guān)于酶E_2a的酶活性可以是指優(yōu)先地將dTDP-鼠李糖和3-羥基癸?；?3-羥基癸酸轉(zhuǎn)化為α-L-吡喃型鼠李糖基-3-羥基癸酰基-3-羥基癸酸的能力；

酶E_2b，其具有多肽序列SEQ ID NO:8，或者具有這樣的多肽序列，在該多肽序列中相比于參考序列SEQ ID NO:8而言至多25％、20％、15％，特別地至多10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％、1％的氨基酸基團通過缺失、插入、置換或其組合而被修飾，并且該多肽序列仍然有著具有參考序列SEQ ID NO:8的酶的酶活性的至少10％、50％、80％，特別地大于90％，其中關(guān)于酶E_2b的酶活性可以是指優(yōu)先地將dTDP-鼠李糖和3-羥基癸?；?3-羥基癸酸轉(zhuǎn)化為α-L-吡喃型鼠李糖基-3-羥基癸酰基-3-羥基癸酸的能力；

酶E_2c，其具有多肽序列SEQ ID NO:9，或者具有這樣的多肽序列，在該多肽序列中相比于參考序列SEQ ID NO:9而言至多25％、20％、15％，特別地至多10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％、1％的氨基酸基團通過缺失、插入、置換或其組合而被修飾，并且該多肽序列仍然有著具有參考序列SEQ ID NO:9的酶的酶活性的至少10％、50％、80％，特別地大于90％，其中關(guān)于酶E_2c的酶活性可以是指優(yōu)先地將dTDP-鼠李糖和3-羥基癸?；?3-羥基癸酸轉(zhuǎn)化為α-L-吡喃型鼠李糖基-3-羥基癸?；?3-羥基癸酸的能力；

酶E_2d，其具有多肽序列SEQ ID NO:10，或者具有這樣的多肽序列，在該多肽序列中相比于參考序列SEQ ID NO:10而言至多25％、20％、15％，特別地至多10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％、1％的氨基酸基團通過缺失、插入、置換或其組合而被修飾，并且該多肽序列仍然有著具有參考序列SEQ ID NO:10的酶的酶活性的至少10％、50％、80％，特別地大于90％，其中關(guān)于酶E_2d的酶活性可以是指優(yōu)先地將dTDP-鼠李糖和3-羥基癸酰基-3-羥基癸酸轉(zhuǎn)化為α-L-吡喃型鼠李糖基-3-羥基癸?；?3-羥基癸酸的能力；和

酶E_2e，其具有多肽序列SEQ ID NO:11，或者具有這樣的多肽序列，在該多肽序列中相比于參考序列SEQ ID NO:11而言至多25％、20％、15％，特別地至多10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％、1％的氨基酸基團通過缺失、插入、置換或其組合而被修飾，并且該多肽序列仍然有著具有參考序列SEQ ID NO:11的酶的酶活性的至少10％、50％、80％，特別地大于90％，其中關(guān)于酶E_2e的酶活性可以是指優(yōu)先地將dTDP-鼠李糖和3-羥基癸?；?3-羥基癸酸轉(zhuǎn)化為α-L-吡喃型鼠李糖基-3-羥基癸?；?3-羥基癸酸的能力。

特別地，在根據(jù)本發(fā)明的任一方面的細(xì)胞中所使用的酶E₃可以選自由下列各項組成的組：

酶E_3a，其具有多肽序列SEQ ID NO:12，或者具有這樣的多肽序列，在該多肽序列中相比于參考序列SEQ ID NO:12而言至多25％、20％、15％，特別地至多10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％、1％的氨基酸基團通過缺失、插入、置換或其組合而被修飾，并且該多肽序列仍然有著具有參考序列SEQ ID NO:12的酶的酶活性的至少10％、50％、80％，特別地大于90％，其中關(guān)于酶E_3a的酶活性可以是指優(yōu)先地將dTDP-鼠李糖和α-L-吡喃型鼠李糖基-3-羥基癸?；?3-羥基癸酸轉(zhuǎn)化為α-L-吡喃型鼠李糖基-(1-2)-α-L-吡喃型鼠李糖基-3-羥基癸酰基-3-羥基癸酸的能力；

酶E_3b，其具有多肽序列SEQ ID NO:13，或者具有這樣的多肽序列，在該多肽序列中相比于參考序列SEQ ID NO:13而言至多25％、20％、15％，特別地至多10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％、1％的氨基酸基團通過缺失、插入、置換或其組合而被修飾，并且該多肽序列仍然有著具有參考序列SEQ ID NO:13的酶的酶活性的至少10％、50％、80％，特別地大于90％，其中關(guān)于酶E_3b的酶活性可以是指優(yōu)先地將dTDP-鼠李糖和α-L-吡喃型鼠李糖基-3-羥基癸?；?3-羥基癸酸轉(zhuǎn)化為α-L-吡喃型鼠李糖基-(1-2)-α-L-吡喃型鼠李糖基-3-羥基癸?；?3-羥基癸酸的能力；

酶E_3c，其具有多肽序列SEQ ID NO:14，或者具有這樣的多肽序列，在該多肽序列中相比于參考序列SEQ ID NO:14而言至多25％、20％、15％，特別地至多10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％、1％的氨基酸基團通過缺失、插入、置換或其組合而被修飾，并且該多肽序列仍然有著具有參考序列SEQ ID NO:14的酶的酶活性的至少10％、50％、80％，特別地大于90％，其中關(guān)于酶E_3c的酶活性可以是指優(yōu)先地將dTDP-鼠李糖和α-L-吡喃型鼠李糖基-3-羥基癸?；?3-羥基癸酸轉(zhuǎn)化為α-L-吡喃型鼠李糖基-(1-2)-α-L-吡喃型鼠李糖基-3-羥基癸酰基-3-羥基癸酸的能力；和

酶E_3d，其具有多肽序列SEQ ID NO:15，或者具有這樣的多肽序列，在該多肽序列中相比于參考序列SEQ ID NO:15而言至多25％、20％、15％，特別地至多10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％、1％的氨基酸基團通過缺失、插入、置換或其組合而被修飾，并且該多肽序列仍然有著具有參考序列SEQ ID NO:15的酶的酶活性的至少10％、50％、80％，特別地大于90％，其中關(guān)于酶E_3d的酶活性可以是指優(yōu)先地將dTDP-鼠李糖和α-L-吡喃型鼠李糖基-3-羥基癸?；?3-羥基癸酸轉(zhuǎn)化為α-L-吡喃型鼠李糖基-(1-2)-α-L-吡喃型鼠李糖基-3-羥基癸?；?3-羥基癸酸的能力。

技術(shù)人員將會理解，上面對于酶E_1a至E_3b所指出的活性僅是這些酶的更寬的活性譜的特殊示例性選擇；所提及的各自活性是這樣的活性，對于該活性來說，在給定的酶的情況下可靠的測量方法是可得的。因此，明顯的是，有著具有非支化的、飽和的C₁₀-烷基基團的底物的酶也可以能夠轉(zhuǎn)化那些包含C₆-或C₁₆-烷基基團(其任選地也可以是支化的或不飽和的)的底物。

根據(jù)本發(fā)明的任一方面的重組細(xì)胞也可以如此地進(jìn)行了基因工程改造，從而所述細(xì)胞具有相比于所述細(xì)胞的野生型而言增加的氧化還原酶的活性。特別地，所述細(xì)胞可以如此地進(jìn)行了基因工程改造，從而所述細(xì)胞具有增加的E₁、E₂或E₃或其組合以及氧化還原酶的活性。更特別地，所述細(xì)胞可以具有增加的E₁、E₂、E₃和氧化還原酶的活性。在一個實例中，所述細(xì)胞具有增加的E₁和E₂以及氧化還原酶，或者E₁和E₃以及氧化還原酶，或者E₂和E₃以及氧化還原酶的活性。

所述氧化還原酶可以是alkB類型的氧化還原酶。該類別的氧化還原酶，alkB，是來自惡臭假單胞菌AlkBGT系統(tǒng)的氧化還原蛋白，其依賴于兩種輔助多肽即alkG和alkT。alkT是FAD依賴性玉紅氧還蛋白還原酶，其將電子從NADH轉(zhuǎn)移至alkG。alkG是玉紅氧還蛋白(一種含鐵的氧化還原蛋白)，其作為對alkB的直接電子供體起作用。在一個特別的實例中，所述alkB類型的氧化還原酶是來自惡臭假單胞菌Gpo1的alkB(登錄號：CAB54050.1(版本1)，SEQ ID NO:1，在申請中所使用的任何登錄號是指來自由NCBI運行的Genbank數(shù)據(jù)庫的各自序列，其中所提及的發(fā)行本是在2014年4月4日在線可得的那個)。

所述alkB類型的氧化還原酶具有多肽序列SEQ ID NO:1，或者具有這樣的多肽序列，在該多肽序列中相比于參考序列SEQ ID NO:1而言直至25％、20％、15％，特別地直至10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％、1％的氨基酸基團通過缺失、插入、置換或其組合而被修飾，并且該多肽序列仍然有著具有參考序列SEQ ID NO:1的酶的酶活性的至少10％、50％、80％，特別地大于92％，其中關(guān)于alkB類型的氧化還原酶的酶活性可以是指當(dāng)使用丁烷作為碳源時，即當(dāng)使用丁烷作為根據(jù)本發(fā)明的任一方面的C₄分子時，優(yōu)先地將丁烷轉(zhuǎn)化為1-丁醇和/或2-丁醇的能力。

所述氧化還原酶可以是單加氧酶。特別地，所述單加氧酶可以是P450類型的單加氧酶，例如來自熱帶假絲酵母(Candida tropicalis)或鷹嘴豆(Cicer arietinum)的細(xì)胞色素P450。更特別地，CYP153單加氧酶，例如來自博爾庫姆食烷菌(Alcanivorax borkumensis)SK2的細(xì)胞色素P450-單加氧酶(YP_691921)。可以在丁烷至醇的第一次氧化中使用單加氧酶。

在另一個實例中，所述氧化還原酶可以是NAD(P)H依賴性醇脫氫酶(ADH)。特別地，所述ADH可以來自大腸桿菌(Escherichia coli)MS 187-1(ZP_07145023)、來自嗜熱脂肪芽孢桿菌(Bacillus stearothermophilus)(P42328)、來自富養(yǎng)羅爾斯通氏菌(Ralstonia eutropha)(ACB78191.1)、來自短乳桿菌(Lactobacillus brevis)(YP_795183.1)、來自高加索乳桿菌(Lactobacillus kefiri)(ACF95832.1)、來自馬肝、來自泛養(yǎng)副球菌(Paracoccus pantotrophus)(ACB78182.1)或來自矢野口鞘氨醇菌(Sphingobium yanoikuyae)(EU427523.1)。在一個實例中，所述ADH可以是黃素依賴性ADH，例如來自熱帶假絲酵母的那種(AAS46878.1)。當(dāng)使用丁醇作為碳源時，即當(dāng)使用丁醇作為根據(jù)本發(fā)明的任一方面的C₄分子時(所述丁醇直接地或以從丁烷原位產(chǎn)生的方式進(jìn)行使用)，可以使用ADH。

在一個實例中，所述氧化還原酶可以來自葡萄糖-甲醇-膽堿-氧化還原酶家族，尤其是來自柄桿菌屬物種(Caulobacter sp.)K31的那種(ABZ74557.1)。當(dāng)使用丁醇作為碳源時，即當(dāng)使用丁醇作為根據(jù)本發(fā)明的任一方面的C₄分子時(所述丁醇直接地或以從丁烷原位產(chǎn)生的方式進(jìn)行使用)，也可以使用該特別的氧化還原酶。

術(shù)語“增加的酶的活性”是指增加的細(xì)胞內(nèi)活性。

下面關(guān)于增加細(xì)胞中的酶活性的描述和定義應(yīng)用于酶E₁至E₃和氧化還原酶的活性的增加，以及應(yīng)用于所有在本公開內(nèi)容中隨后提及的其活性可以任選地被增加的酶。特別地，所有在整個本說明書中關(guān)于酶E₁、E₂和E₃所描述的方法可以應(yīng)用于可以任選地存在于根據(jù)本發(fā)明的任一方面的重組細(xì)胞中的氧化還原酶。

原則上，酶活性的增加可以通過下列方式來實現(xiàn)：增加編碼所述酶的基因序列的拷貝數(shù)；使用強啟動子或經(jīng)改善的核糖體結(jié)合位點；減弱基因表達(dá)的負(fù)調(diào)控，例如通過轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)蛋白，或放大基因表達(dá)的正調(diào)控；改變所述基因的密碼子使用；以各種方式增加mRNA或酶的半壽期；改變所述基因的表達(dá)調(diào)控；或者使用編碼合適的具有增加的活性的酶的基因或等位基因；和任選地，將這些措施相組合。根據(jù)本發(fā)明的任一方面，產(chǎn)生經(jīng)基因工程改造的細(xì)胞，例如通過轉(zhuǎn)化、轉(zhuǎn)導(dǎo)、接合或這些方法的組合，其中使用包含所希望的基因、該基因的等位基因或其部分和任選地包含使所述基因的表達(dá)成為可能的啟動子的載體。特別地，異源表達(dá)通過將所述基因或等位基因整合到細(xì)胞的染色體中或整合到染色體外復(fù)制型載體中來實現(xiàn)。

DE-A-10031999給出了數(shù)個用于增加細(xì)胞中的酶活性的方式的例子，其通過丙酮酸羧化酶來例示。技術(shù)人員將會容易地能夠使用在DE-A-10031999中所公開的方法來增加在根據(jù)本發(fā)明的任一方面的細(xì)胞中的酶活性。

借助于1-維和/或2-維蛋白質(zhì)凝膠分開和隨后的通過使用合適的分析軟件的在凝膠中蛋白質(zhì)濃度的光學(xué)鑒定，上面和所有隨后提及的酶或基因的表達(dá)是可檢測的。如果酶活性的增加唯一地基于相應(yīng)的基因的表達(dá)的增加，那么所述酶活性的增加的定量可以以簡單的方式通過在野生型和經(jīng)基因工程改造的細(xì)胞之間比較1-維和/或2-維蛋白質(zhì)分開來測定。用于在棒桿菌屬(Corynebacterium)情況下的蛋白質(zhì)凝膠的制備和用于蛋白質(zhì)鑒定的慣常方法為由Hermann等人,2001所描述的程序。蛋白質(zhì)濃度可以通過下述方式來分析：使用對于待檢測的蛋白質(zhì)來說特異的抗體的Western印跡雜交(Sambrook等人,1989)，和隨后的使用合適的用于濃度測定的軟件的光學(xué)分析(Lohaus和Meyer,1989)。DNA結(jié)合蛋白的活性可以借助于DNA條帶移位測定法(也稱為凝膠阻滯)來測量(Wilson等人,2001)。DNA結(jié)合蛋白對于其他基因的表達(dá)的作用可以通過各種眾所周知的報道基因測定法方法來檢測(Sambrook等人,1989)。細(xì)胞內(nèi)酶活性也可以按照各種已建立的方法來測定(Donahue等人,2000；Ray等人,2000；Freedberg等人,1973)。如果在下面的實施例中對于某種精確的酶的活性的測定沒有指出特定的方法，那么酶活性的增加的測定或酶活性的減少的測定可以借助于在Hermann等人,2001，Lohaus等人,1998，Lottspeich，1999和Wilson等人,2001中所描述的方法來進(jìn)行。

如果酶活性的增加通過內(nèi)源基因的突變來完成，那么此類突變可以隨機地產(chǎn)生，這要么通過常規(guī)方法例如通過UV輻射或通過誘變化學(xué)品來進(jìn)行，要么借助于基因工程方法例如缺失、插入和/或核苷酸交換而選擇性地來進(jìn)行。通過這些突變來獲得經(jīng)修飾的細(xì)胞。酶的突變體特別地還是那些這樣的酶，其不再是反饋可抑制的、產(chǎn)物可抑制的或底物可抑制的，或者至少相比于野生型酶而言在減小的程度上是反饋可抑制的、產(chǎn)物可抑制的或底物可抑制的。

如果酶活性的增加是通過酶的合成的增加來完成的，那么可以增加相應(yīng)的基因的拷貝數(shù)，或者可以使位于結(jié)構(gòu)基因上游的啟動子和調(diào)控區(qū)或核糖體結(jié)合位點突變。在結(jié)構(gòu)基因上游摻入的表達(dá)盒以相同的方式發(fā)揮作用。借助于至少誘導(dǎo)型啟動子，也可能在任何所希望的時間點增加基因的表達(dá)。也可以給目的酶基因分配“增強子”作為調(diào)控序列，其同樣地借助于經(jīng)改善的在RNA聚合酶和DNA之間的相互作用而帶來增加的基因表達(dá)。作為用于延長mRNA的壽命的措施的結(jié)果，同樣地改善了表達(dá)。此外，通過阻止酶蛋白質(zhì)的降解，也可以增加酶活性。在此，所述基因或基因構(gòu)建體要么存在于具有不同拷貝數(shù)的質(zhì)粒中，要么整合在染色體中并在其中擴增。在另一個實例中，所涉及的基因的過表達(dá)可以通過改變培養(yǎng)基組成和培養(yǎng)管理來實現(xiàn)。本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠找到關(guān)于此的指導(dǎo)，尤其是在Martin等人,1987，Guerrero等人,1994，Tsuchiya和Morinaga,1988，Eikmanns等人,1991，EP-A-0472869，US 4,601,893，Schwarzer和Pühler,1991，Reinscheid等人,1994，LaBarre等人,1993，WO96/15246A，Malumbres等人,1993，JP10229891A，Jensen和Hammer,1998中，和在已知的遺傳學(xué)和分子生物學(xué)教科書中。像突變那樣，上面所描述的措施同樣地導(dǎo)致可以在本發(fā)明的任一方面中使用的經(jīng)基因工程改造的細(xì)胞。

例如，將附加型質(zhì)粒用于增加各自基因的表達(dá)。合適的質(zhì)?；蜉d體原則上均是對于本領(lǐng)域技術(shù)人員來說為了該目的在理論上可得的。此類質(zhì)粒和載體可以取自例如Novagen、Promega、New England Biolabs、Clontech或Gibco BRL這些公司的小冊子。特別地，質(zhì)粒和載體可以在下列文獻(xiàn)中找到：Glover,D.M.,1985；Rodriguez,R.L.和Denhardt,D.T.,1988,Butterworth,Stoneham；Goeddel,D.V.,1990；Fritsch,E.F.和Maniatis,T.,1989。

然后，將包含待擴增的基因的質(zhì)粒載體通過接合或轉(zhuǎn)化而轉(zhuǎn)換至所希望的菌株。接合的方法例如描述在等人,1994中。用于轉(zhuǎn)化的方法例如至少描述在Thierbach等人,1988，Dunican和Shivnan,1989和Tauch等人,1994中。在借助于“交換(cross-over)”事件的同源重組后，所得的菌株包含至少兩個拷貝的所涉及的基因。通過使用該方法，至少可以在所述菌株中將所述基因的拷貝數(shù)增加至所希望的數(shù)目。

在上面和在下面實施例中所使用的措詞之下，“相比于其野生型而言增加的酶(E_x)的活性”總是是指各自酶E_x的活性的增加程度為至少2倍，特別地至少10倍，更特別地至少100倍，更加特別地至少1,000倍，和最特別地至少10,000倍。特別地，具有“相比于其野生型而言增加的酶(E_x)的活性”的根據(jù)本發(fā)明的任一方面的細(xì)胞還包括這樣的細(xì)胞，其野生型不包含該酶E_x的活性或至少不包含可檢測的該酶E_x的活性，并且其僅在增加了酶活性(例如通過過表達(dá))之后才顯示出可檢測的該酶E_x的活性。在該背景下，術(shù)語“過表達(dá)”或在下面實施例中所使用的措詞“增加表達(dá)”還包括這樣的情況，其中起始細(xì)胞，例如野生型細(xì)胞，不具有酶E_x的表達(dá)或至少不具有可檢測的酶E_x的表達(dá)，并且可檢測的酶E_x的合成僅通過重組方法來誘導(dǎo)。E_x也可以是指氧化還原酶。

細(xì)胞的“野生型”在此指定其基因組以如通過進(jìn)化而天然地形成的那樣的狀態(tài)存在的細(xì)胞。該術(shù)語用于整個細(xì)胞以及獨個基因。因此，術(shù)語“野生型”特別地不包括其基因序列至少部分地被人借助于重組方法進(jìn)行了修飾的那些細(xì)胞或那些基因。

特別地，相對于野生型細(xì)胞而言酶活性的增加可以通過使用本領(lǐng)域已知的常規(guī)方法來測量。例如E₁、E₂和E₃的活性的增加可以通過使用在Burger,M.M.,1963和Burger,M.M.,1966中所公開的方法來測量。

不導(dǎo)致給定多肽的特性和功能的顯著變化的給定多肽序列的氨基酸基團的變化是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的。因此，例如“保守氨基酸”可以互相交換。此類氨基酸置換的例子包括但不限于：Ala置換為Ser；Arg置換為Lys；Asn置換為Gln或His；Asp置換為Glu；Cys置換為Ser；Gln置換為Asn；Glu置換為Asp；Gly置換為Pro；His置換為Asn或Gln；Ile置換為Leu或Val；Leu置換為Met或Val；Lys置換為Arg或Gln或Glu；Met置換為Leu或Ile；Phe置換為Met或Leu或Tyr；Ser置換為Thr；Thr置換為Ser；Trp置換為Tyr；Tyr置換為Trp或Phe；Val置換為Ile或Leu。同樣地知曉，以例如氨基酸插入或缺失的形式的變化(特別是在多肽的N-或C-末端處)常常對于該多肽的功能不產(chǎn)生顯著的影響。

酶的活性可以通過以本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的方式(例如借助于球磨機、弗式壓碎器或超聲破碎器)使包含該活性的細(xì)胞破裂來測定。隨后，可以通過在13,000rpm和4℃下至少離心10分鐘來進(jìn)行細(xì)胞、細(xì)胞碎片和破裂助劑(例如玻璃珠)的分開。

然后，可以通過使用所得的無細(xì)胞的粗提取物來進(jìn)行具有隨后的產(chǎn)物的LC-ESI-MS檢測的酶測定法。備選地，所希望的酶可以通過本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的手段，例如通過色譜學(xué)方法(例如鎳-氨三乙酸親和色譜法、鏈霉抗生物素蛋白親和色譜法、凝膠過濾色譜法或離子交換色譜法)來進(jìn)行富集，或者純化至同質(zhì)。

酶E₁的活性可以通過使用如上面所描述的那樣而獲得的酶樣品以下面的方式來進(jìn)行測定：標(biāo)準(zhǔn)測定法可以在120μL的最終體積中包含100μΜ大腸桿菌ACP，1mMβ-巰基乙醇，200μΜ丙二酸單酰輔酶A，40μΜ辛酰輔酶A(對于E_1a)或十二烷酰輔酶A(對于E_1b)，100μΜNADPH，2μg的大腸桿菌FabD，2μg的結(jié)核分枝桿菌(Mycobacterium tuberculosis)FabH，1μg的大腸桿菌FabG，0.1M磷酸鈉緩沖液(pH 7.0)和5μg的酶E₁。將ACP、β-巰基乙醇和磷酸鈉緩沖液在37℃下溫育30分鐘以完全地還原ACP。然后，通過添加酶E₁來開始反應(yīng)。所述反應(yīng)可以通過使用2ml的已用HCl酸化至pH 2.0的水來終止，并隨后用2ml的氯仿/甲醇(2:1(v:v))提取兩次。然后，通過離心(16,100g，5分鐘，室溫)來進(jìn)行相分開?？梢匀〕鱿虏康挠袡C相，將其在真空離心機中完全蒸發(fā)，并且可以將沉淀物吸收在50μl的甲醇中。未溶解的成分通過離心(16,100g，5分鐘，室溫)作為沉淀物被除去，并且將樣品借助于LC-ESI-MS來進(jìn)行分析。產(chǎn)物的鑒定通過相應(yīng)的質(zhì)量跡線(mass trace)和MS²譜的分析來進(jìn)行。

酶E₂的活性可以如下地通過使用如上面所描述的那樣而獲得的酶樣品以下面的方式來進(jìn)行測定：標(biāo)準(zhǔn)測定法可以包含185μl的10mM tris-HCl(pH 7.5)，10μl的125mM dTDP-鼠李糖和50μl的蛋白質(zhì)粗提取物(大約1mg的總蛋白質(zhì))或在溶液中的經(jīng)純化的蛋白質(zhì)(5μg的經(jīng)純化的蛋白質(zhì))。通過添加10μl的10mM的3-羥基癸?；?3-羥基癸酸(對于E_2a)或3-羥基十四烷?；?3-羥基十四烷酸(對于E_2b)的乙醇溶液來開始反應(yīng)，并將其在搖動(600rpm)下于30℃溫育1小時。隨后，所述反應(yīng)可以用1ml的丙酮進(jìn)行處理。未溶解的成分通過離心(16,100g，5分鐘，室溫)作為沉淀物被除去，并且將樣品借助于LC-ESI-MS來進(jìn)行分析。產(chǎn)物的鑒定通過相應(yīng)的質(zhì)量跡線和MS²譜的分析來進(jìn)行。

酶E₃的活性可以通過使用如上面所描述的那樣而獲得的酶樣品如下地來進(jìn)行測定：標(biāo)準(zhǔn)測定法可以包含185μl的10mM tris-HCl(pH 7.5)，10μl的125mM dTDP-鼠李糖和50μl的蛋白質(zhì)粗提取物(大約1mg的總蛋白質(zhì))或在溶液中的經(jīng)純化的蛋白質(zhì)(5μg的經(jīng)純化的蛋白質(zhì))。通過添加10μl的10mM的α-L-吡喃型鼠李糖基-3-羥基癸?；?3-羥基癸酸(對于E_3a)或α-L-吡喃型鼠李糖基-3-羥基十四烷?；?3-羥基十四烷酸(對于E_3b)的乙醇溶液來開始反應(yīng)，并將其在搖動(600rpm)下于30℃溫育1小時。隨后，所述反應(yīng)用1ml的丙酮進(jìn)行處理。通過離心(16,100g，5分鐘，室溫)來沉淀出未溶解的成分，并且將樣品借助于LC-ESI-MS來進(jìn)行分析。產(chǎn)物的鑒定通過相應(yīng)的質(zhì)量跡線和MS²譜的分析來進(jìn)行。

根據(jù)本發(fā)明的任一方面的重組細(xì)胞可以具有增加的至少E₁、E₂和/或E₃的活性。特別地，所述細(xì)胞可以具有增加的E₁、E₂或E₃或者其組合的活性。更特別地，所述細(xì)胞可以具有增加的E₁、E₂和E₃的活性。在一個實例中，所述細(xì)胞具有增加的E₁和E₂，或E₁和E₃，或E₂和E₃的活性。

氧化還原酶的活性可以通過本領(lǐng)域中已知的任何方法來測定。特別地，alkB類型的氧化還原酶的活性可以通過使用在WO2009/077461A1中所公開的方法來測定，P450類型的單加氧酶的活性可以通過使用在Scheps,D等人,2011中所提供的方法來測定，和ADH的活性可以通過在Benson,S.,Shapiro,J.,J.Bacteriol.1976,126,794-798中所提供的方法來測定。

可以使根據(jù)本發(fā)明的任一方面的經(jīng)基因工程改造的細(xì)胞在分批過程(分批培養(yǎng))中或者在補料分批過程(補料過程)或重復(fù)的補料分批過程(重復(fù)補料過程)中與培養(yǎng)基連續(xù)地或不連續(xù)地相接觸以為了產(chǎn)生上面提及的產(chǎn)物，并因此進(jìn)行培養(yǎng)。半連續(xù)過程也是可想到的，如在GB-A-1009370中所描述的。已知的培養(yǎng)方法的概括描述在Chmiel的教科書中或描述在Storhas的教科書中。待使用的培養(yǎng)基必須以合適的方式滿足各自菌株的需求。不同酵母菌株的培養(yǎng)基的描述例如包含在Klaus Wolf,1996中。

根據(jù)本發(fā)明的任一方面的細(xì)胞可以是原核生物或真核生物。這些細(xì)胞可以是哺乳動物細(xì)胞(例如，來自人的細(xì)胞)，植物細(xì)胞，或者微生物例如酵母、真菌或細(xì)菌，其中微生物是特別優(yōu)選的，并且細(xì)菌和酵母是最優(yōu)選的。

合適的細(xì)菌、酵母或真菌特別地為作為細(xì)菌、酵母或真菌菌株保藏在德意志微生物和細(xì)胞培養(yǎng)物保藏中心(Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen,GmbH(DSMZ)),Brunswick,Germany中的那些細(xì)菌、酵母或真菌。根據(jù)本發(fā)明合適的細(xì)菌屬于在http://www.dsmz.de/species/bacteria.htm之下所列出的類別；根據(jù)本發(fā)明合適的酵母屬于在http://www.dsmz.de/species/yeasts.htm之下所列出的那些類別；和根據(jù)本發(fā)明合適的真菌為在http://www.dsmz.de/species/fungi.htm之下所列出的那些。

特別地，所述細(xì)胞可以選自下列屬：曲霉屬(Aspergillus)、棒桿菌屬(Corynebacterium)、短桿菌屬(Brevibacterium)、芽孢桿菌屬(Bacillus)、不動桿菌屬(Acinetobacter)、產(chǎn)堿菌屬(Alcaligenes)、乳桿菌屬(Lactobacillus)、副球菌屬(Paracoccus)、乳球菌屬(Lactococcus)、假絲酵母屬(Candida)、畢赤酵母屬(Pichia)、漢遜酵母屬(Hansenula)、克魯維酵母屬(Kluyveromyces)、糖酵母屬(Saccharomyces)、埃希氏菌屬(Escherichia)、發(fā)酵單胞菌屬(Zymomonas)、耶氏酵母屬(Yarrowia)、甲基桿菌屬(Methylobacterium)、羅爾斯通氏菌屬(Ralstonia)、假單胞菌屬(Pseudomonas)、紅螺菌屬(Rhodospirillum)、紅細(xì)菌屬(Rhodobacter)、伯克霍爾德氏菌屬(Burkholderia)、梭菌屬(Clostridium)和貪銅菌屬(Cupriavidus)。更特別地，所述細(xì)胞可以選自由下列各項組成的組：構(gòu)巢曲霉(Aspergillus nidulans)、黑曲霉(Aspergillus niger)、廣泛產(chǎn)堿菌(Alcaligenes latus)、巨大芽孢桿菌(Bacillus megaterium)、枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)、黃色短桿菌(Brevibacterium flavum)、乳發(fā)酵短桿菌(Brevibacterium lactofermentum)、須芒草伯克霍爾德氏菌(Burkholderia andropogonis)、巴西伯克霍爾德氏菌(B.brasilensis)、喀里多尼亞伯克霍爾德氏菌(B.caledonica)、加勒比伯克霍爾德氏菌(B.caribensis)、石竹伯克霍爾德氏菌(B.caryophylli)、真菌狀伯克霍爾德氏菌(B.fungorum)、唐菖蒲伯克霍爾德氏菌(B.gladioli)、格氏伯克霍爾德氏菌(B.glathei)、莢殼伯克霍爾德氏菌(B.glumae)、禾草伯克霍爾德氏菌(B.graminis)、好客伯克霍爾德氏菌(B.hospita)、久留里伯克霍爾德氏菌(B.kururiensis)、吩嗪伯克霍爾德氏菌(B.phenazinium)、瘤塊伯克霍爾德氏菌(B.phymatum)、固植伯克霍爾德氏菌(B.phytofirmans)、植物伯克霍爾德菌(B.plantarii)、甘蔗伯克霍爾德氏菌(B.sacchari)、新加坡伯克霍爾德氏菌(B.singaporensis)、骯臟伯克霍爾德氏菌(B.sordidicola)、地生伯克霍爾德氏菌(B.terricola)、熱帶伯克霍爾德氏菌(B.tropica)、結(jié)節(jié)伯克霍爾德氏菌(B.tuberum)、烏汶伯克霍爾德氏菌(B.ubonensis)、B.unamae、食異伯克霍爾德氏菌(B.xenovorans)、花伯克霍爾德氏菌(B.anthina)、吡咯菌素伯克霍爾德氏菌(B.pyrrocinia)、泰國伯克霍爾德氏菌(B.thailandensis)、布蘭克假絲酵母(Candida blankii)、皺落假絲酵母(Candida rugosa)、谷氨酸棒桿菌(Corynebacterium glutamicum)、有效棒桿菌(Corynebacterium efficiens)、大腸桿菌(Escherichia coli)、多形漢遜酵母(Hansenula polymorpha)、乳酸克魯維酵母(Kluveromyces lactis)、扭脫甲基桿菌(Methylobacterium extorquens)、善變副球菌(Paracoccus versutus)、阿根廷假單胞菌(Pseudomonas argentinensis)、P.borbori、香茅醇假單胞菌(P.citronellolis)、變黃假單胞菌(P.flavescens)、門多薩假單胞菌(P.mendocina)、硝基還原假單胞菌(P.nitroreducens)、食油假單胞菌(P.oleovorans)、類產(chǎn)堿假單胞菌(P.pseudoalcaligenes)、食樹脂假單胞菌(P.resinovorans)、稻草假單胞菌(P.straminea)、桔黃假單胞菌(P.aurantiaca)、致金色假單胞菌(P.aureofaciens)、綠針假單胞菌(P.chlororaphis)、莓實假單胞菌(P.fragi)、隆德假單胞菌(P.lundensis)、腐臭假單胞菌(P.taetrolens)、南極假單胞菌(P.antarctica)、產(chǎn)氮假單胞菌(P.azotoformans)、布拉奇福德假單胞菌(P.blatchfordae)、十字花科假單胞菌(P.brassicacearum)、布倫納假單胞菌(P.brenneri)、雪松假單胞菌(P.cedrina)、皺紋假單胞菌(P.corrugata)、熒光假單胞菌(P.fluorescens)、熱莎爾假單胞菌(P.gessardii)、黎巴嫩假單胞菌(P.libanensis)、曼德爾假單胞菌(P.mandelii)、邊緣假單胞菌(P.marginalis)、地中海假單胞菌(P.mediterranea)、南方假單胞菌(P.meridiana)、米古拉假單胞菌(P.migulae)、霉味假單胞菌(P.mucidolens)、東方假單胞菌(P.orientalis)、人參假單胞菌(P.panacis)、溶蛋白假單胞菌(P.proteolytica)、羅德島假單胞菌(P.rhodesiae)、類黃假單胞菌(P.synxantha)、賽維瓦爾假單胞菌(P.thivervalensis)、托拉氏假單胞菌(P.tolaasii)、維羅納假單胞菌(P.veronii)、反硝化假單胞菌(P.denitrificans)、百日咳假單胞菌(P.pertucinogena)、酪著色假單胞菌(P.cremoricolorata)、黃褐假單胞菌(P.fulva)、蒙泰伊假單胞菌(P.monteilii)、莫塞爾假單胞菌(P.mosselii)、副黃假單胞菌(P.parafulva)、惡臭假單胞菌(P.putida)、巴利阿里假單胞菌(P.balearica)、施氏假單胞菌(P.stutzeri)、扁桃假單胞菌(P.amygdali)、洋榛假單胞菌(P.avellanae)、番木瓜假單胞菌(P.caricapapayae)、菊苣假單胞菌(P.cichorii)、暈斑假單胞菌(P.coronafaciens)、天仙果假單胞菌(P.ficuserectae)、向日葵假單胞菌(P.helianthi)、苦楝假單胞菌(P.meliae)、薩氏假單胞菌(P.savastanoi)、丁香假單胞菌(P.syringae)、番茄假單胞菌(P.tomato)、綠黃假單胞菌(P.viridiflava)、嗜松香烷假單胞菌(P.abietaniphila)、嗜酸假單胞菌(P.acidophila)、傘菌假單胞菌(P.agarici)、嗜堿假單胞菌(P.alcaliphila)、解堿假單胞菌(P.alkanolytica)、淀粉皮假單胞菌(P.amyloderamosa)、鐵角蕨假單胞菌(P.asplenii)、P.azotifigens、大麻假單胞菌(P.cannabina)、海污假單胞菌(P.coenobios)、P.congelans、科斯坦廷假單胞菌(P.costantinii)、克羅斯韋假單胞菌(P.cruciviae)、德里假單胞菌(P.delhiensis)、外囊假單胞菌(P.excibis)、極東假單胞菌(P.extremorientalis)、弗雷德里克斯堡假單胞菌(P.frederiksbergensis)、褐鞘假單胞菌(P.fuscovaginae)、石花菜假單胞菌(P.gelidicola)、格萊蒙特假單胞菌(P.grimontii)、印度假單胞菌(P.indica)、熱桑假單胞菌(P.jessenii)、晉州假單胞菌(P.jinjuensis)、基爾假單胞菌(P.kilonensis)、P.knackmussii、高麗假單胞菌(P.koreensis)、亞麻假單胞菌(P.lini)、藤黃假單胞菌(P.lutea)、摩拉維亞假單胞菌(P.moraviensis)、耳炎假單胞菌(P.otitidis)、P.pachastrellae、P.palleroniana、罌粟假單胞菌(P.papaveris)、P.peli、腐卵假單胞菌(P.perolens)、早熟禾假單胞菌(P.poae)、浦項假單胞菌(P.pohangensis)、嗜冷假單胞菌(P.psychrophila)、耐冷假單胞菌(P.psychrotolerans)、拉梭假單胞菌(P.rathonis)、食爬蟲假單胞菌(P.reptilivora)、嗜樹脂假單胞菌(P.resiniphila)、根際假單胞菌(P.rhizosphaerae)、淺紅假單胞菌(P.rubescens)、薩洛莫假單胞菌(P.salomonii)、P.segitis、敗血假單胞菌(P.septica)、猿猴假單胞菌(P.simiae)、豬假單胞菌(P.suis)、耐熱假單胞菌(P.thermotolerans)、銅綠假單胞菌(P.aeruginosa)、山黃麻假單胞菌(P.tremae)、次要假單胞菌(P.trivialis)、陀螺形假單胞菌(P.turbinellae)、杜蒂戈林假單胞菌(P.tuticorinensis)、陰城假單胞菌(P.umsongensis)、溫哥華假單胞菌(P.vancouverensis)、弗拉諾夫假單胞菌(P.vranovensis)、黃色海洋假單胞菌(P.xanthomarina)、富養(yǎng)羅爾斯通氏菌(Ralstonia eutropha)、深紅紅螺菌(Rhodospirillum rubrum)、類球紅細(xì)菌(Rhodobacter sphaeroides)、釀酒糖酵母(Saccharomyces cerevisiae)、解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica)和運動發(fā)酵單胞菌(Zymomonas mobile)。更加特別地，所述細(xì)胞選自由下列各項組成的組：惡臭假單胞菌、大腸桿菌和泰國伯克霍爾德氏菌。

根據(jù)本發(fā)明的任一方面，處于其野生型的細(xì)胞可以不能夠形成可檢測量的鼠李糖脂，和/或不具有酶E₁、酶E₂、酶E₃和/或氧化還原酶的活性或者不具有可檢測的酶E₁、酶E₂、酶E₃和/或氧化還原酶的活性。

根據(jù)本發(fā)明有利的是，所述細(xì)胞以其野生型能夠形成具有C₆-C₁₆的單鏈烷酸酯鏈長的聚羥基鏈烷酸酯。此類細(xì)胞例如為伯克霍爾德氏菌屬物種、泰國伯克霍爾德氏菌、假單胞菌屬物種、惡臭假單胞菌、銅綠假單胞菌、食油假單胞菌、施氏假單胞菌、熒光假單胞菌、香茅醇假單胞菌、食樹脂假單胞菌、睪丸酮叢毛單胞菌(Comamonas testosteroni)、嗜水氣單胞菌(Aeromonas hydrophila)、鉤蟲貪銅菌(Cupriavidus necator)、廣泛產(chǎn)堿菌和富養(yǎng)羅爾斯通氏菌。在該背景下，根據(jù)本發(fā)明的任一方面的細(xì)胞可以如此地進(jìn)行基因工程改造，從而它們能夠形成相比于其野生型而言更少的聚羥基鏈烷酸酯。此類細(xì)胞例如至少描述在De Eugenio等人,2010和Rehm等人,2001中。這樣的能夠形成相比于其野生型而言更少的聚羥基鏈烷酸酯的重組細(xì)胞的特征特別地在于，它具有相比于其野生型而言減少的至少一種酶E₉或E₁₀的活性。

E₉表示聚羥基鏈烷酸酯合酶，EC:2.3.1.，其特別地具有多肽序列SEQ ID NO:20(E_9a)或SEQ ID NO:21(E_9b)，或者具有這樣的多肽序列，在該多肽序列中相比于各自的參考序列SEQ ID NO:20或SEQ ID NO:21而言至多25％、20％、15％，特別地至多10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％、1％的氨基酸基團通過缺失、插入、置換或其組合而被修飾，并且該多肽序列仍然有著具有各自的參考序列SEQ ID NO:20或SEQ ID NO:21的酶的酶活性的至少10％、50％，特別地80％，特別地大于90％，其中關(guān)于酶E₉(E_9a和E_9b)的酶活性可以是指將3-羥基鏈烷酰輔酶A轉(zhuǎn)化為聚-3-羥基鏈烷酸，特別地將3-羥基十四烷酰輔酶A轉(zhuǎn)化為聚-3-羥基十四烷酸的能力。

E₁₀表示3-羥基鏈烷酰基-ACP:輔酶A轉(zhuǎn)移酶，其特別地具有多肽序列SEQ ID NO:22(E_10a)或SEQ ID NO:23(E_10b)，或者具有這樣的多肽序列，在該多肽序列中相比于各自的參考序列SEQ ID NO:22或SEQ ID NO:23而言至多25％、20％，特別地15％，特別地至多10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％、1％的氨基酸基團通過缺失、插入、置換或其組合而被修飾，并且該多肽序列仍然有著具有各自的參考序列SEQ ID NO:22(E_10a)或SEQ ID NO:23(E_10b)的酶的酶活性的至少10％、50％，特別地80％，特別地大于90％，其中關(guān)于酶E₁₀(E_10a和E_10b)的酶活性可以是指將3-羥基鏈烷?；?ACP轉(zhuǎn)化為3-羥基鏈烷酰輔酶A，特別地將3-羥基鏈烷酰基-ACP轉(zhuǎn)化為3-羥基十四烷酰輔酶A的能力。

酶E₉(E_9a和E_9b)的活性可以例如通過使用如上面對于酶E₁至E₃所描述那樣而獲得的樣品以下述方式來測定：首先混合560μl的100mM tris/HCl(pH 7.5)、20μl的在DMSO中的35mM DTNB和20μl的41mM 3-羥基癸酰輔酶A。隨后，添加在100μl的tris/HCl(pH 7.5)中的5μg的經(jīng)純化的酶E₉，并隨后在分光光度計中在1分鐘期間內(nèi)連續(xù)地記錄隨時間而發(fā)生的在412nm處的消光的增加(由于添加5,5’-二硫代雙(2-硝基苯甲酸鹽)(DTNB)以釋放SH基團而引起)(ΔΕ/分鐘)。

酶E₁₀(E_10a和E_10b)的活性可以例如通過使用如上面對于酶E₁至E₃所描述那樣而獲得的樣品來測定。標(biāo)準(zhǔn)測定法可以在200μl的總體積中包含3mM MgCl₂、40μM羥基癸酰輔酶A和20μM大腸桿菌ACP(在50mM tris-HCl(pH 7.5)中)。通過添加在50μl的tris-HCl(pH 7.5)中的5μg的經(jīng)純化的酶E₁₀來開始反應(yīng)，并將其在30℃下溫育1小時。所述反應(yīng)通過添加50％(w/v)三氯乙酸和10mg/ml的BSA(30μl)來終止。所釋放出的輔酶A可以通過記錄隨時間而發(fā)生的在412nm處的消光的增加(其由于添加5,5’-二硫代雙(2-硝基苯甲酸鹽)(DTNB)以釋放SH基團而引起)以分光光度法來測定。

關(guān)于本發(fā)明的任一方面而使用的短語“減少的酶E_x的活性”可以是指活性的減少程度為至少0.5倍，特別地至少0.1倍，更特別地至少0.01倍，更加特別地至少0.001倍，和最特別地至少0.0001倍。短語“減少的活性”還包括不可檢測的活性(“零活性”)。某種酶的活性的減少可以例如通過選擇性突變或者通過本領(lǐng)域技術(shù)人員已知用于減少某種酶的活性的其他措施來實施。

特別地，例如至少在Dubeau等人,2009，Singh&2008，Lee等人,2009等中，本領(lǐng)域技術(shù)人員可找到關(guān)于借助于間斷特定的基因來實現(xiàn)蛋白質(zhì)表達(dá)的修飾和減少以及伴隨的酶活性降低(尤其是對于假單胞菌屬和伯克霍爾德氏菌屬)的指導(dǎo)。

根據(jù)本發(fā)明的任一方面的細(xì)胞的特征在于，酶活性的減少通過修飾包含所述核酸序列之一的基因來實現(xiàn)，其中所述修飾選自包括下列各項的組或由下列各項組成的組：在所述基因中外源DNA的插入，所述基因的至少部分的缺失，在所述基因序列中的點突變，RNA干擾(siRNA)，反義RNA，或者位于所述基因側(cè)翼的調(diào)控序列例如啟動子和終止子或者核糖體結(jié)合位點的修飾(插入、缺失或點突變)。

在該背景下，外源DNA是指任何這樣的DNA序列，其對于所述基因來說(而不是對于所述生物來說)是“外來的”，即在該背景下內(nèi)源性DNA序列也可以擔(dān)當(dāng)“外源DNA”。在該背景下，特別優(yōu)選的是，所述基因通過插入選擇標(biāo)記基因而被間斷，因此所述外源DNA為選擇標(biāo)記基因，其中所述插入優(yōu)選地通過在所述基因座位中的同源重組來實施。

特別地，可以根據(jù)本發(fā)明的任一方面進(jìn)行使用的細(xì)胞可以是惡臭假單胞菌細(xì)胞，其具有相比于其野生型而言減少的聚羥基鏈烷酸酯合成。此類細(xì)胞例如至少作為KTOY01和KTOY02而描述在Ren等人,1998，Huisman等人,1991，De Eugenio等人,2010和Ouyang等人,2007中。

根據(jù)本發(fā)明的方法而形成的鼠李糖脂可以至少具有通式(I)或其鹽，

其中

m＝2、1或0，特別地1或0，

n＝1或0，特別地1，

R¹和R²＝相互獨立地，相同或不同的、具有2至24個(優(yōu)選地5至13個)碳原子的有機基團，特別地，任選地支化的、任選地經(jīng)取代的(特別地經(jīng)羥基取代的)、任選地不飽和的(特別地任選地單不飽和、雙不飽和或三不飽和的)烷基基團，其可以選自由下列各項組成的組：戊烯基、庚烯基、壬烯基、十一碳烯基和十三碳烯基，以及(CH₂)_o-CH₃，其中o＝1至23，優(yōu)選地4至12。

對于根據(jù)本發(fā)明的任一方面的細(xì)胞能夠形成具有m＝1的鼠李糖脂的情況，所述基團可以為

其借助于衍生自下列化合物的R¹和R²來定義：3-羥基辛?；?3-羥基辛酸、3-羥基辛?；?3-羥基癸酸、3-羥基癸?；?3-羥基辛酸、3-羥基辛?；?3-羥基癸烯酸、3-羥基癸烯酰基-3-羥基辛酸、3-羥基辛酰基-3-羥基十二烷酸、3-羥基十二烷?；?3-羥基辛酸、3-羥基辛?；?3-羥基十二碳烯酸、3-羥基十二碳烯?；?3-羥基辛酸、3-羥基癸?；?3-羥基癸酸、3-羥基癸?；?3-羥基癸烯酸、3-羥基癸烯?；?3-羥基癸酸、3-羥基癸烯?；?3-羥基癸烯酸、3-羥基癸酰基-3-羥基十二烷酸、3-羥基十二烷?；?3-羥基癸酸、3-羥基癸酰基-3-羥基十二碳烯酸、3-羥基癸?；?3-羥基十四碳烯酸、3-羥基十四烷?；?3-羥基癸烯酸、3-羥基十二碳烯?；?3-羥基癸酸、3-羥基癸?；?3-羥基十四烷酸、3-羥基十四烷?；?3-羥基癸酸、3-羥基癸?；?3-羥基十四碳烯酸、3-羥基十四碳烯?；?3-羥基癸酸、3-羥基十二烷?；?3-羥基十二烷酸、3-羥基十二碳烯?；?3-羥基十二烷酸、3-羥基十二烷?；?3-羥基十二碳烯酸、3-羥基十二烷?；?3-羥基十四烷酸、3-羥基十四烷?；?3-羥基十二烷酸、3-羥基十四烷?；?3-羥基十四烷酸、3-羥基十六烷?；?3-羥基十四烷酸、3-羥基十四烷酰基-3-羥基十六烷酸或3-羥基十六烷?；?3-羥基十六烷酸。

對于本領(lǐng)域技術(shù)人員來說明顯的是，根據(jù)本發(fā)明的任一方面，可以形成不同的具有通式(I)的鼠李糖脂的混合物。

在該背景下，根據(jù)本發(fā)明的任一方面的細(xì)胞可以能夠形成具有通式(I)的鼠李糖脂的混合物，其特征在于，在大于80重量％，大于90重量％，特別地大于95重量％的所形成的鼠李糖脂中，n＝1，并且在小于10重量％，小于5重量％，特別地小于2重量％的所形成的鼠李糖脂中，借助于R¹和R²進(jìn)行定義的基團衍生自3-羥基癸?；?3-羥基辛酸或3-羥基辛酰基-3-羥基癸酸，其中所指出的“重量％”涉及所有所形成的具有通式(I)的鼠李糖脂之和。

由于根據(jù)本發(fā)明的任一方面的細(xì)胞可以有利地用于生產(chǎn)鼠李糖脂并且由于這些脂質(zhì)隨后任選地進(jìn)行純化，因此如果根據(jù)本發(fā)明的任一方面的細(xì)胞具有相比于其野生型而言增加的至少一種酶E₈(其催化具有通式(I)的鼠李糖脂從細(xì)胞中輸出到周圍的培養(yǎng)基中)的活性，那么這是有利的。

在該背景下，蛋白質(zhì)E₈選自由下列各項組成的組：

酶E₈，其具有多肽序列SEQ ID NO:16(E_8a)、SEQ ID NO:17(E_8b)、SEQ ID NO:18(E_8c)或SEQ ID NO:19(E_8d)，或者具有這樣的多肽序列，在該多肽序列中相比于各自的參考序列SEQ ID NO:16(E_8a)、SEQ ID NO:17(E_8b)、SEQ ID NO:18(E_8c)或SEQ ID NO:19(E_8d)而言至多25％，至多20％，特別地至多15％，特別地至多10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％、1％的氨基酸基團通過缺失、插入、置換或其組合而被修飾，并且該多肽序列仍然有著具有各自的參考序列SEQ ID NO:16(E_8a)、SEQ ID NO:17(E_8b)、SEQ ID NO:18(E_8c)或SEQ ID NO:19(E_8d)的酶的酶活性的至少50％、65％，特別地80％，特別地大于90％，其中關(guān)于酶E₈(E_8a、

E_8b、E_8c和E_8d)的酶活性是指將具有通式(I)的鼠李糖脂從細(xì)胞中輸出到周圍的培養(yǎng)基中的能力。

表1.根據(jù)本發(fā)明的任一方面所使用的酶的序列

附圖簡述

圖1是圖解說明了依賴于不同碳源而形成的鼠李糖脂產(chǎn)物的組成(以百分比表示)的圖。

實施例

下面描述了優(yōu)選的實施方案，其如本領(lǐng)域技術(shù)人員將會理解的，可以經(jīng)歷在設(shè)計、構(gòu)建或操作方面的改變或修飾，而不背離權(quán)利要求書的范圍。例如，這些改變旨在由權(quán)利要求書的范圍所涵蓋。

在用惡臭假單胞菌生產(chǎn)鼠李糖脂中，于在不同的實施例中測定產(chǎn)物濃度之前，將反應(yīng)樣品在發(fā)酵之后立即用丙酮以1:1的體積比進(jìn)行稀釋，并在21,000g和4℃下離心2分鐘。然后，將樣品上清液通過HPLC進(jìn)行測量。

實施例1(比較實施例，非本發(fā)明的)

用BS-PP-001從葡萄糖生產(chǎn)鼠李糖脂

在包含50mg/l卡那霉素的LB瓊脂平板上，將一個接種環(huán)的惡臭假單胞菌菌株KT2440pBBR1MCS-2::ABC(BS-PP-001)的甘油冷凍培養(yǎng)物進(jìn)行劃線。產(chǎn)生載體pBBR1MCS-2::ABC的方法提供在DE102010032484A1的實施例2中。然后，將惡臭假單胞菌用該載體進(jìn)行轉(zhuǎn)化并儲存。將瓊脂平板在30℃下溫育24小時。將包含25ml的具有卡那霉素的LB培養(yǎng)基的100ml的具有擋板的瓶用長滿了的瓊脂平板的單個培養(yǎng)物進(jìn)行接種，并在搖動培養(yǎng)器中在30℃和200rpm下溫育24小時以產(chǎn)生預(yù)培養(yǎng)物。將預(yù)培養(yǎng)物在室溫下以5500g離心10分鐘。然后棄去上清液。將粒狀沉淀重懸浮在25ml的M9培養(yǎng)基(組成：6.8g/l Na₂PO₄·2H₂O，2.4g/l KH₂PO₄，0.4g/l NaCl，1.6g/l NH₄Cl，0.5g/l MgSO₄·7H₂O，1ml的由36.5g/l的強度為37％的鹽酸、1.91g/l MnCl₂·4H₂O、1.87g/l ZnSO₄·7H₂O、0.84g/l Na-EDTA·2H₂O、0.3g/l H₃BO₃、0.25g/l Na₂MoO₄·2H₂O、4.7g/l CaCl₂·2H₂O、17.3g/l FeSO₄·7H₂O、0.15g/l CuCl₂·2H₂O組成的痕量元素溶液US3)中。然后，重復(fù)該洗滌步驟。

在300ml的發(fā)酵罐中，向180ml的上面所描述的M9培養(yǎng)基中添加20g/l葡萄糖和50mg/l卡那霉素。用大體積的預(yù)培養(yǎng)物懸浮液接種所述發(fā)酵罐，以達(dá)到0.4的起始OD₆₀₀。在發(fā)酵期間設(shè)置下列參數(shù)：2NL/小時的用空氣進(jìn)行的通氣，通過調(diào)節(jié)攪拌速度而調(diào)節(jié)至30％的溶解氧濃度。該測量通過使用標(biāo)準(zhǔn)的氧傳感器、30℃的溫度、7.4的初始pH值(在整個實驗中不調(diào)節(jié))來進(jìn)行。在40小時的發(fā)酵后，通過注射器供給葡萄糖溶液(在發(fā)酵罐中的濃度：15g/l)。在規(guī)定的時間處，從發(fā)酵罐中取出樣品以測定所產(chǎn)生的鼠李糖脂和脂肪酸二聚體的濃度。

結(jié)果顯示在下面的表2和圖1中。

實施例2

用BS-PP-001從丁酸生產(chǎn)鼠李糖脂

與采用葡萄糖的實施例1類似地來制備預(yù)培養(yǎng)物。

在300ml的發(fā)酵罐中，向180ml的在實施例1中所描述的M9培養(yǎng)基中添加6.5g/l丁酸鈉和50mg/l卡那霉素。用大體積的預(yù)培養(yǎng)物懸浮液接種所述發(fā)酵罐，以達(dá)到0.4的起始OD₆₀₀。在發(fā)酵期間設(shè)置下列參數(shù)：2NL/小時的用空氣進(jìn)行的通氣，設(shè)置在300rpm的攪拌速度，30℃的溫度，7.4的初始pH值(在整個實驗中不調(diào)節(jié))。在40小時的發(fā)酵后，通過注射器供給丁酸鈉溶液(在發(fā)酵罐中的濃度：5g/l丁酸)。將攪拌速度增加至900rpm。

在規(guī)定的時間處，從發(fā)酵罐中取出樣品以測定所產(chǎn)生的鼠李糖脂和脂肪酸二聚體的濃度。

結(jié)果顯示在下面的表2和圖1中。

實施例3

使用BS-PP-001+alkB從正丁烷生產(chǎn)鼠李糖脂

在包含50mg/l卡那霉素的LB瓊脂平板上，將滿滿一個接種環(huán)的惡臭假單胞菌菌株pBBR1MCS-2::ABC pBT10(BS-PP001+alkB)的甘油冷凍培養(yǎng)物進(jìn)行劃線。該菌株是通過向?qū)嵤├?的菌株添加在WO2009/077461A1的第36和37頁上所描述的基因構(gòu)建體pΒΤ10(SEQ-ID 31)而產(chǎn)生的。將該瓊脂平板在30℃下溫育24小時。

將三個100ml的具有擋板的瓶裝以25ml的包含卡那霉素的LB培養(yǎng)基，并且將每個瓶用長滿了的瓊脂平板的單個培養(yǎng)物進(jìn)行接種并在搖動培養(yǎng)器中在30℃和200rpm下溫育24小時。

三個1升的具有擋板的瓶中的每一個用于混合75ml的經(jīng)改良的M9培養(yǎng)基(組成：15g/l葡萄糖，6.8g/l Na₂PO₄，3g/l KH₂PO₄，0.5g/l NaCl，2g/l NH₄Cl，15g/l酵母提取物，0.49g/l MgSO₄·7H₂O，50mg/l硫酸卡那霉素，15ml/l的由36.5g/l的強度為37％的鹽酸、11.91g/l MnCl₂·4H₂O、1.87g/l ZnSO₄·7H₂O、0.84g/l Na-EDTA·2H₂O、0.3g/l H₃BO₃、0.25g/l Na₂MoO₄·2H₂O、4.7g/l CaCl₂·2H₂O、17.3g/l FeSO₄·7H₂O、0.15g/l CuCl₂·2H₂O組成的痕量元素溶液US3)和來自所述100ml的瓶的預(yù)培養(yǎng)物。將培養(yǎng)物在30℃和200rpm下進(jìn)行溫育。在3小時的溫育后，通過添加0.4mM的二環(huán)丙基酮來激活alkBGT基因。將培養(yǎng)物在25℃和200rpm下進(jìn)一步培養(yǎng)16小時。

合并在所述三個瓶中的培養(yǎng)物，并在室溫下以5500g離心10分鐘。棄去上清液。將粒狀沉淀重懸浮在25ml的M9培養(yǎng)基(其組成提供在上面)中。重復(fù)該洗滌步驟以去除葡萄糖和其他可能的碳源。

在300ml的發(fā)酵罐中，向180ml的M9培養(yǎng)基(其組成提供在上面，但沒有碳源)中添加50mg/l卡那霉素。用大體積的來自早期步驟的預(yù)培養(yǎng)物懸浮液接種所述發(fā)酵罐，以達(dá)到10的起始OD₆₀₀。在發(fā)酵期間設(shè)置下列參數(shù)：2NL/小時的用丁烷/空氣混合物(25％/75％)進(jìn)行的通氣，設(shè)置在900rpm的攪拌速度，30℃的溫度，7.4的初始pH值(在整個實驗中不調(diào)節(jié))。在規(guī)定的時間處，從發(fā)酵罐中取出樣品以測定所產(chǎn)生的鼠李糖脂和脂肪酸二聚體的濃度。

結(jié)果顯示在下面的表2和圖1中。

表2.基于所使用的底物而產(chǎn)生的鼠李糖脂和脂肪酸二聚體的最終濃度

如可以看出的，表2顯示了，惡臭假單胞菌這一物種的配備有來自銅綠假單胞菌的基因rhlA、rhlB和rhlC的菌株KT2440(BS-PP-001)能夠產(chǎn)生大約1g/l的產(chǎn)物(其中大約110mg/l為二鼠李糖脂和81mg/l為單鼠李糖脂)，以及幾乎800mg的不想要的脂肪酸二聚體(當(dāng)使用葡萄糖作為底物時)。

當(dāng)使用丁酸鹽作為唯一碳源時，二鼠李糖脂的量顯著增加，而僅形成大約三分之一的不想要的脂肪酸二聚體。在另一個實例中，將菌株進(jìn)行基因工程改造以引入來自惡臭假單胞菌GPO1的氧化還原酶AlkB，并供給丁烷作為唯一碳源。在表2中所提供的結(jié)果顯示，形成了直至超過1000mg/l的二鼠李糖脂，并且沒有產(chǎn)生可測量量的不希望的脂肪酸二聚體。

圖1中的結(jié)果也圖解說明了依賴于不同碳源而形成的產(chǎn)物的組成(以百分比表示)?？梢钥闯觯∷猁}的使用將不想要的脂肪酸二聚體的量從81％減少至64％，并且在使用丁烷和丁醇的情況下，所形成的脂肪酸二聚體的量是不可測量的。

實施例4

使用BS-PP-001+alkB從1-丁醇生產(chǎn)鼠李糖脂

將三個100ml的具有擋板的瓶裝以25ml的包含卡那霉素和四環(huán)素的LB培養(yǎng)基，并且將每個瓶用100μl的惡臭假單胞菌菌株pBBR1MCS-2::ABC pBT10(BS-PP001+alkB)的甘油冷凍培養(yǎng)物進(jìn)行接種。該菌株是通過向?qū)嵤├?的菌株添加在WO2009/077461A1的第36和37頁上所描述的基因構(gòu)建體pBT10(SEQ-ID 31)而產(chǎn)生的。將所述瓶在搖動培養(yǎng)器中在30℃和200rpm下溫育24小時。

三個1升的具有擋板的瓶中的每一個用于混合75ml的經(jīng)改良的M9培養(yǎng)基(組成：15g/l葡萄糖，6.8g/l Na₂PO₄，3g/l KH₂PO₄，0.5g/l NaCl，2g/l NH₄Cl，15g/l酵母提取物，0.49g/l MgSO₄·7H₂O，50mg/l硫酸卡那霉素，10mg/l四環(huán)素，15ml/l的由36.5g/l的強度為37％的鹽酸、11.91g/l MnCl₂·4H₂O、1.87g/l ZnSO₄·7H₂O、0.84g/l Na-EDTA·2H₂O、0.3g/l H₃BO₃、0.25g/l Na₂MoO₄·2H₂O、4.7g/l CaCl₂·2H₂O、17.3g/l FeSO₄·7H₂O、0.15g/l CuCl₂·2H₂O組成的痕量元素溶液US3)和來自所述100ml的瓶的預(yù)培養(yǎng)物。將培養(yǎng)物在30℃和200rpm下進(jìn)行溫育。在3小時的溫育后，通過添加0.4mM的二環(huán)丙基酮來激活alkBGT基因。將培養(yǎng)物在30℃和200rpm下進(jìn)一步培養(yǎng)4小時。

合并在所述三個瓶中的培養(yǎng)物，并在室溫下以5500g離心10分鐘。棄去上清液。將粒狀沉淀重懸浮在25ml的M9培養(yǎng)基(其組成提供在上面)中。重復(fù)該洗滌步驟以去除葡萄糖和其他可能的碳源。

在300ml的發(fā)酵罐中，向180ml的M9培養(yǎng)基(其組成提供在上面，但沒有碳源)中添加50mg/l卡那霉素。用10ml的來自早期步驟的預(yù)培養(yǎng)物懸浮液接種所述發(fā)酵罐，以達(dá)到5的起始OD₆₀₀。在發(fā)酵期間設(shè)置下列參數(shù)：3NL/小時的用空氣進(jìn)行的通氣，設(shè)置在700rpm的攪拌速度，30℃的溫度，7.0的pH值(在整個實驗中用5％氨溶液進(jìn)行調(diào)節(jié))。通過注射器供給丁醇溶液(供給速率為0.2g/(l·小時))。在規(guī)定的時間處，從發(fā)酵罐中取出樣品以測定所產(chǎn)生的鼠李糖脂和脂肪酸二聚體的濃度。

結(jié)果提供在上面的表2中。

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序列表

<110> Evonik Industries AG

<120> 生產(chǎn)鼠李糖脂的方法

<130> 2014P00077

<140> 14169799.5

<141> 2014-05-26

<160> 23

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 399

<212> PRT

<213> 惡臭假單胞菌（Pseudomonas putida）

<220>

<221> SITE

<222> (1)..(399)

<223> alkB類型的氧化還原酶

<400> 1

Glu Lys His Arg Val Leu Asp Ser Ala Pro Glu Tyr Val Asp Lys Lys

1 5 10 15

Lys Tyr Leu Trp Ile Leu Ser Thr Leu Trp Pro Ala Thr Pro Met Ile

20 25 30

Gly Ile Trp Leu Ala Asn Glu Thr Gly Trp Gly Ile Phe Tyr Gly Leu

35 40 45

Val Leu Leu Val Trp Tyr Gly Ala Leu Pro Leu Leu Asp Ala Met Phe

50 55 60

Gly Glu Asp Phe Asn Asn Pro Pro Glu Glu Val Val Pro Lys Leu Glu

65 70 75 80

Lys Glu Arg Tyr Tyr Arg Val Leu Thr Tyr Leu Thr Val Pro Met His

85 90 95

Tyr Ala Ala Leu Ile Val Ser Ala Trp Trp Val Gly Thr Gln Pro Met

100 105 110

Ser Trp Leu Glu Ile Gly Ala Leu Ala Leu Ser Leu Gly Ile Val Asn

115 120 125

Gly Leu Ala Leu Asn Thr Gly His Glu Leu Gly His Lys Lys Glu Thr

130 135 140

Phe Asp Arg Trp Met Ala Lys Ile Val Leu Ala Val Val Gly Tyr Gly

145 150 155 160

His Phe Phe Ile Glu His Asn Lys Gly His His Arg Asp Val Ala Thr

165 170 175

Pro Met Asp Pro Ala Thr Ser Arg Met Gly Glu Ser Ile Tyr Lys Phe

180 185 190

Ser Ile Arg Glu Ile Pro Gly Ala Phe Ile Arg Ala Trp Gly Leu Glu

195 200 205

Glu Gln Arg Leu Ser Arg Arg Gly Gln Ser Val Trp Ser Phe Asp Asn

210 215 220

Glu Ile Leu Gln Pro Met Ile Ile Thr Val Ile Leu Tyr Ala Val Leu

225 230 235 240

Leu Ala Leu Phe Gly Pro Lys Met Leu Val Phe Leu Pro Ile Gln Met

245 250 255

Ala Phe Gly Trp Trp Gln Leu Thr Ser Ala Asn Tyr Ile Glu His Tyr

260 265 270

Gly Leu Leu Arg Gln Lys Met Glu Asp Gly Arg Tyr Glu His Gln Lys

275 280 285

Pro His His Ser Trp Asn Ser Asn His Ile Val Ser Asn Leu Val Leu

290 295 300

Phe His Leu Gln Arg His Ser Asp His His Ala His Pro Thr Arg Ser

305 310 315 320

Tyr Gln Ser Leu Arg Asp Phe Pro Gly Leu Pro Ala Leu Pro Thr Gly

325 330 335

Tyr Pro Gly Ala Phe Leu Met Ala Met Ile Pro Gln Trp Phe Arg Ser

340 345 350

Val Met Asp Pro Lys Val Val Asp Trp Ala Gly Gly Asp Leu Asn Lys

355 360 365

Ile Gln Ile Asp Asp Ser Met Arg Glu Thr Tyr Leu Lys Lys Phe Gly

370 375 380

Thr Ser Ser Ala Gly His Ser Ser Ser Thr Ser Ala Val Ala Ser

385 390 395

<210> 2

<211> 295

<212> PRT

<213> 假單胞菌屬物種（Pseudomonas sp.）

<220>

<221> SITE

<222> (1)..(295)

<223> 酶E1a

<400> 2

Met Arg Arg Glu Ser Leu Leu Val Ser Val Cys Lys Gly Leu Arg Val

1 5 10 15

His Val Glu Arg Val Gly Gln Asp Pro Gly Arg Ser Thr Val Met Leu

20 25 30

Val Asn Gly Ala Met Ala Thr Thr Ala Ser Phe Ala Arg Thr Cys Lys

35 40 45

Cys Leu Ala Glu His Phe Asn Val Val Leu Phe Asp Leu Pro Phe Ala

50 55 60

Gly Gln Ser Arg Gln His Asn Pro Gln Arg Gly Leu Ile Thr Lys Asp

65 70 75 80

Asp Glu Val Glu Ile Leu Leu Ala Leu Ile Glu Arg Phe Glu Val Asn

85 90 95

His Leu Val Ser Ala Ser Trp Gly Gly Ile Ser Thr Leu Leu Ala Leu

100 105 110

Ser Arg Asn Pro Arg Gly Ile Arg Ser Ser Val Val Met Ala Phe Ala

115 120 125

Pro Gly Leu Asn Gln Ala Met Leu Asp Tyr Val Gly Arg Ala Gln Ala

130 135 140

Leu Ile Glu Leu Asp Asp Lys Ser Ala Ile Gly His Leu Leu Asn Glu

145 150 155 160

Thr Val Gly Lys Tyr Leu Pro Pro Arg Leu Lys Ala Ser Asn His Gln

165 170 175

His Met Ala Ser Leu Ala Thr Gly Glu Tyr Glu Gln Ala Arg Phe His

180 185 190

Ile Asp Gln Val Leu Ala Leu Asn Asp Arg Gly Tyr Leu Ala Cys Leu

195 200 205

Glu Arg Ile Gln Ser His Val His Phe Ile Asn Gly Ser Trp Asp Glu

210 215 220

Tyr Thr Thr Ala Glu Asp Ala Arg Gln Phe Arg Asp Tyr Leu Pro His

225 230 235 240

Cys Ser Phe Ser Arg Val Glu Gly Thr Gly His Phe Leu Asp Leu Glu

245 250 255

Ser Lys Leu Ala Ala Val Arg Val His Arg Ala Leu Leu Glu His Leu

260 265 270

Leu Lys Gln Pro Glu Pro Gln Arg Ala Glu Arg Ala Ala Gly Phe His

275 280 285

Glu Met Ala Ile Gly Tyr Ala

290 295

<210> 3

<211> 346

<212> PRT

<213> 伯克霍爾德氏菌屬物種（Burkholderia sp.）

<220>

<221> SITE

<222> (1)..(346)

<223> 酶E1b

<400> 3

Met Arg Gly Ser Gly Glu Trp Val Ala Ala Ala Ala Arg Val Arg Gln

1 5 10 15

Gly Gly Gln Ile Ala Arg Glu Gly Gly Tyr Val Glu Ala Ser Ile Lys

20 25 30

Gly Ala Gly Ser Ala His Leu Pro Ser Arg Cys Gly Arg Tyr Ala Met

35 40 45

Pro Ile Glu Lys Gln Val Val Ala Leu Pro Ser Gly Leu Lys Val His

50 55 60

Val Glu Arg His Val Phe Asp Pro Ala Phe Glu Thr Val Ile Leu Val

65 70 75 80

Asn Gly Ala Leu Ala Thr Thr Ala Ser Phe Gly Gln Thr Ile Arg Tyr

85 90 95

Leu Gly Glu Arg Val Asn Ala Val Cys Phe Asp Leu Pro Tyr Ala Gly

100 105 110

Gln Ser Arg Gln His Asn Pro Gly Glu Tyr Ile Leu Thr Lys Asp Asp

115 120 125

Glu Val Glu Ile Leu Leu His Leu Ala Glu Arg Phe Glu Pro Ser Phe

130 135 140

Leu Leu Ser Val Ser Trp Gly Gly Val Ala Ser Leu Phe Ala Leu Ala

145 150 155 160

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