一種鼠李糖乳桿菌的胞外多糖及其制備方法和應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種鼠李糖乳桿菌的胞外多糖及其制備方法和應(yīng)用。該胞外多糖由質(zhì)量分?jǐn)?shù)比為45.13～47.80％的葡萄糖、35.26～36.17％的鼠李糖和16.94～18.70％的半乳糖組成，該胞外多糖由式I所示重復(fù)結(jié)構(gòu)單元組成，該胞外多糖的平均重量分子量為98萬(wàn)～147萬(wàn)道爾頓，其為一種組成明確，具備一定免疫調(diào)節(jié)作用的新型多糖，可作為添加劑應(yīng)用于制藥、臨床等領(lǐng)域中，應(yīng)用前景十分廣闊。
【專利說(shuō)明】_種鼠李糖乳桿菌的胞外多糖及其制備方法和應(yīng)用
[0001] 本申請(qǐng)要求申請(qǐng)日為2013年12月27日的中國(guó)專利申請(qǐng)CN201310743058. 0的優(yōu) 先權(quán)。本申請(qǐng)引用該中國(guó)專利申請(qǐng)的全文。

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0002] 本發(fā)明涉及一種鼠李糖乳桿菌（Lactobacillus rhamnosus)的胞外多糖及其制備 方法和應(yīng)用。

【背景技術(shù)】
[0003] 乳酸菌（Lactic acid bacteria)是一類能利用可發(fā)酵性糖產(chǎn)生大量乳酸的細(xì)菌 總稱，目前在自然界已發(fā)現(xiàn)的這類細(xì)菌在分類學(xué)上至少有23個(gè)屬。在食品、醫(yī)藥等領(lǐng)域應(yīng) 用較多的乳酸菌主要有乳桿菌屬、鏈球菌屬、腸球菌屬、乳球菌屬、片球菌屬和明串珠菌屬 等。乳酸菌是益生菌最主要的來(lái)源，許多乳酸菌是人體腸道固有的益生菌，具有改善人體腸 道菌群，調(diào)節(jié)機(jī)體免疫力，抑腫瘤，降低血清膽固醇，調(diào)節(jié)血壓等重要的生理活性。
[0004] 乳酸菌發(fā)揮主要功能特性的作用機(jī)理，除了定殖、通過(guò)主要代謝產(chǎn)物（乳酸等）改 善腸道內(nèi)環(huán)境等以外，一些次生代謝產(chǎn)物如細(xì)菌素、胞外多糖等也發(fā)揮著非常重要的作用。 其中，具有理論和實(shí)際應(yīng)用價(jià)值的乳酸菌胞外多糖引起了國(guó)內(nèi)外許多學(xué)者的研宄興趣。
[0005] 乳酸菌胞外多糖是乳酸菌產(chǎn)生并分泌到細(xì)胞外的一種多糖。乳酸菌胞外多糖具有 重要的工藝學(xué)功能，對(duì)酸乳、干酪及絕大多數(shù)發(fā)酵乳制品的流變性質(zhì)、質(zhì)構(gòu)、口感以及風(fēng)味 具有重要的影響。乳酸菌胞外多糖可以改善乳制品的流變學(xué)特性和質(zhì)構(gòu)特性。由于天然增 稠作用，由產(chǎn)粘乳桿菌與非產(chǎn)粘球菌混合發(fā)酵形成的酸乳與非產(chǎn)粘菌株形成的酸乳相比口 感滑潤(rùn)、粘度增加；產(chǎn)胞外多糖乳酸菌能夠賦予酸乳更強(qiáng)的持水力，從而避免乳清析出；此 夕卜，由胞外多糖而產(chǎn)生的持水性增強(qiáng)有助于提高干酪等產(chǎn)品的得率。乳酸菌胞外多糖還具 有良好的生理功能，如增強(qiáng)黏膜吸附作用、抗腫瘤、抗?jié)?、免疫調(diào)節(jié)、降膽固醇、降血壓，還 可以作為益生元促進(jìn)腸道內(nèi)其他益生菌的生長(zhǎng)，優(yōu)化腸道微生態(tài)環(huán)境等。因此，開展產(chǎn)胞外 多糖乳酸菌的研宄，對(duì)于改善乳制品生產(chǎn)加工、開發(fā)具有特定功能性質(zhì)的乳酸菌發(fā)酵乳制 品，具有十分重要的研宄意義和經(jīng)濟(jì)價(jià)值。開發(fā)具有益生功能的乳酸菌胞外多糖成為目前 研宄的熱點(diǎn)。
[0006] 20世紀(jì)60年代以來(lái)，多糖被認(rèn)為是一種廣譜的非特異性的免疫促進(jìn)劑，可增強(qiáng)宿 主細(xì)胞的細(xì)胞免疫和體液免疫功能，如激活巨噬細(xì)胞、T細(xì)胞、B細(xì)胞和NK細(xì)胞等，激活補(bǔ)體 及誘導(dǎo)產(chǎn)生干擾素等，其作用將是激活人體的非特異性防御機(jī)能，在抗病毒、抗腫瘤、抗輻 射等方面有很好的療效。
[0007] 然而，目前在本領(lǐng)域內(nèi)，研宄成熟的并且能夠在實(shí)踐中推廣應(yīng)用的乳酸菌胞外多 糖的種類并不多，生產(chǎn)和科研上都存在對(duì)新的胞外多糖進(jìn)行研宄的需要，以豐富性能優(yōu)良、 用途廣泛的乳酸菌胞外多糖的種類。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0008] 本發(fā)明所要解決的技術(shù)問(wèn)題是針對(duì)目前乳酸菌胞外多糖種類和產(chǎn)品功能不夠豐 富的現(xiàn)狀，而提供一種新的乳酸菌胞外多糖，具體為一種鼠李糖乳桿菌的胞外多糖，本發(fā)明 還提供所述胞外多糖的制備方法和應(yīng)用。本發(fā)明的胞外多糖被證明具有良好的有絲分裂原 活性和免疫調(diào)節(jié)活性。
[0009] 本發(fā)明所述的鼠李糖乳桿菌的胞外多糖最初發(fā)現(xiàn)由保藏編號(hào)為CGMCC No. 6430的 鼠李糖乳桿菌所產(chǎn)生。所述的保藏編號(hào)為CGMCC No. 6430的鼠李糖乳桿菌篩選自健康成 年人的糞便，在發(fā)酵乳中能夠產(chǎn)生胞外多糖。本發(fā)明人在研宄中發(fā)現(xiàn)該菌株具有良好的耐 酸耐膽鹽性能，其具有潛在的益生功能，并且體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)其粗多糖可以提高小鼠 T/B 淋巴細(xì)胞的活性，其具有潛在的提高機(jī)體免疫力的功能。為了更好地了解其結(jié)構(gòu)和功能，對(duì) 其粗多糖進(jìn)行分離純化及其功能研宄。該菌株已在中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微 生物中心（簡(jiǎn)稱CGMCC)保藏，其保藏編號(hào)為CGMCC No. 6430。在此基礎(chǔ)上，本發(fā)明提供下述 技術(shù)方案。
[0010] 本發(fā)明提供的技術(shù)方案之一是：一種鼠李糖乳桿菌的胞外多糖，所述胞外多糖由 質(zhì)量分?jǐn)?shù)比為45. 13?47. 80%的葡萄糖、35. 26?36. 17%的鼠李糖和16. 94?18. 70% 的半乳糖組成，該胞外多糖由式I所示的重復(fù)結(jié)構(gòu)單元組成，
[0011] -1)_α-D-葡萄糖（2- l)-a-L-鼠李糖（3 -l)-a-L-鼠李糖（3-1)-(接 下行）
[0012] a -L-鼠李糖（3 - 1) - β -D-葡萄糖（3 - 1) - β -D-半乳糖（3 -
[0013]

【權(quán)利要求】
1. 一種鼠李糖乳桿菌的胞外多糖，其特征在于，所述胞外多糖由質(zhì)量分?jǐn)?shù)比為 45. 13?47. 80%的葡萄糖、35. 26?36. 17%的鼠李糖和16. 94?18. 70%的半乳糖組成， 該胞外多糖由式I所示的重復(fù)結(jié)構(gòu)單元組成，
該胞外多糖的平均重量分子量為98萬(wàn)?147萬(wàn)道爾頓。
2. 如權(quán)利要求1所述的胞外多糖，其特征在于，所述的胞外多糖由保藏號(hào)為CGMCC NO. 6430的鼠李糖乳桿菌（L.rhamnosus)菌株所產(chǎn)生。
3. -種如權(quán)利要求1所述的鼠李糖乳桿菌的胞外多糖的制備方法，其特征在于，包括 如下步驟： (1) 將保藏編號(hào)為CGMCCNo. 6430的鼠李糖乳桿菌的種子液以體積比1. 0?5. 0%的 接種量接種于無(wú)菌脫脂乳培養(yǎng)基，于28?36°C培養(yǎng)24?40小時(shí)得發(fā)酵液； (2) 將步驟（1)所得的發(fā)酵液在95?100°C加熱10?30min，冷卻至15?25°C后靜 置3?16小時(shí)，離心取上清并向所述上清中加入三氯乙酸溶液至終濃度為5?8%，靜置 8?16小時(shí)，離心獲得發(fā)酵上清液；所述百分比為每100毫升中含有的三氯乙酸的克數(shù)，所 述三氯乙酸溶液是質(zhì)量百分?jǐn)?shù)為75?85%的三氯乙酸溶液； (3) 向步驟（2)所得的發(fā)酵上清液中加入2?4倍體積的體積百分?jǐn)?shù)為80?100%的 乙醇，離心或過(guò)濾收集沉淀物并將沉淀物溶于水，用截留分子量為5000?14000道爾頓的 透析袋在水中透析48?72小時(shí)，每8?12小時(shí)換水一次，在溫度不超過(guò)105°C下干燥或者 真空冷凍干燥，即得所述胞外多糖的粗品。
4. 如權(quán)利要求3所述的制備方法，其特征在于，步驟（1)中，所述的無(wú)菌脫脂乳培養(yǎng)基 是將10?12重量份脫脂乳和0. 8?1. 2重量份葡萄糖溶解于85?90重量份的水中，于 115?125°C滅菌15?20分鐘，冷卻至15?25°C所得的無(wú)菌脫脂乳培養(yǎng)基；所述的接種 量是2. 0?4. 0%，發(fā)酵的時(shí)間是24?36小時(shí)。
5. 如權(quán)利要求3所述的制備方法，其特征在于，步驟（1)中，所述的接種量是2.0? 2. 5%，發(fā)酵的時(shí)間是28?32小時(shí)。
6. 如權(quán)利要求3所述的制備方法，其特征在于，步驟（2)中，所述的加熱為將步驟（1) 所得的發(fā)酵液在95?100°C加熱15?20min;所述的三氯乙酸的質(zhì)量百分?jǐn)?shù)為78?82%。
7. 如權(quán)利要求3所述的制備方法，其特征在于，步驟（3)中，所述的乙醇的體積百分?jǐn)?shù) 為82?90% ;所述透析袋的截留分子量為12000?14000道爾頓。
8. 如權(quán)利要求3所述的制備方法，其特征在于，其還包括步驟（4):所述的步驟（4)為： 采用離子交換層析柱對(duì)步驟（3)所得的胞外多糖的粗品進(jìn)行分離純化，依次以45?55mM， pH7. 5 ?7. 8 的Tris-HCl緩沖液和含 0? 2 ?1. 2MNaCl的 45 ?55mM，pH7. 5 ?7. 8 的 Tris-HCl緩沖液進(jìn)行線性梯度洗脫，洗脫速度為2. 5?3. 5mL/min，合并收集第二個(gè)組分峰 的洗脫產(chǎn)物，裝入截留分子量為10000?15000道爾頓的透析袋在去離子水透析中48?72 小時(shí)，每8?12小時(shí)換水一次，在溫度不超過(guò)105°C下干燥或者真空冷凍干燥，即得所述胞 外多糖。
9. 如權(quán)利要求8所述的制備方法，其特征在于，所述的步驟⑷為：采用 DEAE-Sepharose Fast Flow離子交換層析柱對(duì)步驟（3)所得的胞外多糖的粗品進(jìn)行分離純 化，所述離子交換層析柱的規(guī)格為D2.6cmX30cm，依次以50mM，pH7. 6的Tris-HCl緩沖 液和含0. 5?1. 0M NaCl的50mM，pH7. 6的Tris-HCl緩沖液進(jìn)行線性梯度洗脫，洗脫速度 為3mL/min，合并收集第二個(gè)組分峰的洗脫產(chǎn)物，裝入截留分子量為14000道爾頓的透析袋 在去離子水透析中72小時(shí)，每8小時(shí)換水一次，在溫度不超過(guò)105°C下干燥或者真空冷凍干 燥，即得所述胞外多糖。
10. 如權(quán)利要求1所述的胞外多糖在食品、醫(yī)藥和相關(guān)領(lǐng)域的應(yīng)用。
【文檔編號(hào)】A23L1/09GK104479043SQ201410842673
【公開日】2015年4月1日 申請(qǐng)日期:2014年12月25日 優(yōu)先權(quán)日:2013年12月27日
【發(fā)明者】吳正鈞, 郭本恒, 韓瑨, 邵麗, 杭鋒, 劉振民 申請(qǐng)人:光明乳業(yè)股份有限公司