一株利用棕櫚油生產(chǎn)鼠李糖脂生物表面活性劑的銅綠假單胞菌及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及到一株生產(chǎn)鼠李糖脂的銅綠假單胞菌iPseudomonas aeruginosa ) TIB-R02 CGMCC No9376和該菌利用棕櫚油發(fā)酵生產(chǎn)鼠李糖脂的方法。
【背景技術(shù)】
[0002]生物表面活性劑是一種與化學(xué)合成的表面活性劑相比除具有其優(yōu)點(diǎn)外，還具有化學(xué)合成表面活性劑所不具備的無毒，能生物降解，無污染，具有良好的選擇性和專一性，生物相容性好等優(yōu)點(diǎn)，在醫(yī)藥、食品、化妝品、環(huán)境保護(hù)等眾多工業(yè)領(lǐng)域有獨(dú)特的應(yīng)用前景。大力發(fā)展生物表面活性劑技術(shù)產(chǎn)業(yè)，將成功的帶動石油、醫(yī)藥、洗滌用品等相關(guān)領(lǐng)域的全面發(fā)展，促進(jìn)社會進(jìn)步和經(jīng)濟(jì)發(fā)展，使我國擁有自主知識產(chǎn)權(quán)，提高國際競爭力。
[0003]鼠李糖酯是一種陰離子生物表面活性劑，它們不僅溶于甲醇、氯仿和乙醚，在堿性水溶液中也表現(xiàn)出良好的溶解特性。然而鼠李糖酯最突出的特性是它的表面活性，如能顯著降低水的表面張力改變固體表面的潤濕性，具有乳化、破乳、消泡、洗滌、分散與絮凝、抗靜電和潤滑等多種功能。鼠李糖酯不僅能乳化碳?xì)浠衔?，而且還能穩(wěn)定其乳化體系。鼠李糖酯的另外一個重要特性是它的抗菌性。已經(jīng)報(bào)道有好幾種鼠李糖酯混合物具有抗菌和抗真菌的效果。因此深入的研究已鼠李糖酯為代表的表面活性劑，具有非常重要的應(yīng)用價(jià)值。棕櫚油毛油粗原料屬于廉價(jià)碳源料，使用它作為發(fā)酵原料可以有效降低生產(chǎn)成本，開發(fā)棕櫚油毛油的利用效率，可以為鼠李糖酯的大規(guī)模生產(chǎn)和廣泛應(yīng)用提供基礎(chǔ)。
[0004]目前，鼠李糖脂主要是利用銅綠假單胞菌通過液態(tài)發(fā)酵的方法獲得。由于鼠李糖脂是一種良好的生物表面活性劑具有優(yōu)良的發(fā)泡、乳化等作用，所以在生產(chǎn)過程中隨著不停地?cái)嚢韬屯獍l(fā)酵罐內(nèi)會產(chǎn)生大量體積微小、結(jié)構(gòu)致密的泡沫。傳統(tǒng)的消泡方法如流加消泡劑、機(jī)械消泡及加壓消泡等均無法達(dá)到消泡的作用，導(dǎo)致大量泡沫攜帶培養(yǎng)基從尾氣管逃液造成培養(yǎng)基浪費(fèi)及產(chǎn)物損失，同時增加了染菌的風(fēng)險(xiǎn)無法達(dá)到發(fā)酵生產(chǎn)的要求。因此如何改造發(fā)酵設(shè)備并結(jié)合傳統(tǒng)消泡方法優(yōu)化發(fā)酵工藝來控制發(fā)酵過程中逃液的發(fā)生，成為鼠李糖脂發(fā)酵生產(chǎn)的關(guān)鍵。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明的目的是提供一株能夠生產(chǎn)鼠李糖脂的銅綠假單胞菌和發(fā)酵法生產(chǎn)鼠李糖脂的方法及應(yīng)用。
[0006]本發(fā)明篩選得到一株生產(chǎn)鼠李糖脂的銅綠假單胞菌iPseudomonas aeruginosa )TIB-R02已于2014年6月25日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(簡稱CGMCC)，保藏號為CGMCC No9376，保藏地址為北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號。
[0007]本發(fā)明具體提供了使用上述菌種以棕櫚油為碳源進(jìn)行發(fā)酵生產(chǎn)鼠李糖脂的方法。該方法包括發(fā)酵培養(yǎng)基，菌種培養(yǎng)，發(fā)酵生產(chǎn)工藝: 1.菌種培養(yǎng):以上述銅綠假單胞菌為生產(chǎn)菌種，使用合適的培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件，通過固體平板培養(yǎng)和搖瓶液體培養(yǎng)獲得菌種。在發(fā)酵罐發(fā)酵中的種子使用30L發(fā)酵罐進(jìn)行二級種子培養(yǎng)，在300L發(fā)酵中將種子直接打入發(fā)酵罐中。
[0008]固體平板培養(yǎng)基組成:10g/L葡萄糖，5g/L蛋白胨，lg/L酵母粉，0.5g/LNaCl，1.5g/L瓊脂；搖瓶種子培養(yǎng)基組成:10g/L葡萄糖，5g/L蛋白胨，lg/L酵母粉，0.5g/L NaClo
[0009]培養(yǎng)條件:溫度30-37°C，轉(zhuǎn)速100-250rpm，培養(yǎng)時間10_24h。
[0010]2.搖瓶發(fā)酵生產(chǎn)工藝:
發(fā)酵培養(yǎng)基組成:1.1 g/L KC1; 1.1 g/L NaCl; 0.00028 g/L FeS04.7H20; 3.4 g/L KH2P04; 4.4 g/L K2HP04; 0.5 g/L MgS04.7H20; 0.5 g/L 酵母粉；0.5-1.5g/L NaN03;5-20g/L棕櫚油。無機(jī)鹽培養(yǎng)基中加入適當(dāng)微量元素包括:0.29 g/L ZnS04.7H20; 0.24 g/L CaCl2.4H20; 0.25 g/L CuS04.5H20; 0.17 g/L MnS04.H20。
[0011]搖培養(yǎng)基碳氮源進(jìn)行優(yōu)化，獲得分批搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)基組成，優(yōu)化后培養(yǎng)基碳源為:NaN03 7.5g/L,碳源:棕櫚油 75g/L。
[0012]將1步培養(yǎng)的菌種以10%接種量接入優(yōu)化后發(fā)酵培養(yǎng)基中培養(yǎng)192小時，鼠李糖脂產(chǎn)量可以達(dá)到57g/L，搖瓶發(fā)酵生產(chǎn)過程見附圖1。
[0013]3.發(fā)酵罐發(fā)酵工藝:將1步培養(yǎng)菌種接入發(fā)酵罐，采用主從發(fā)酵罐串聯(lián)進(jìn)行發(fā)酵(發(fā)酵罐示意圖見附圖2)，主罐進(jìn)行發(fā)酵，主罐為300L發(fā)酵罐，發(fā)酵液體積150L，發(fā)酵溫度為30°C，攪拌轉(zhuǎn)速為200rpm，初始通氣量為lv/v/m，接種量按體積比10%接種。在發(fā)酵過程中，根據(jù)主罐起泡情況，發(fā)酵罐壓力，以及菌體生長情況控制通氣量達(dá)到控制發(fā)酵過程逃液的情況(具體情況見實(shí)施例，參數(shù)控制見附圖4)。從罐收集逃逸的泡沫并進(jìn)行消泡工作，從罐不進(jìn)行溫度和pH控制，主罐逃逸過來的泡沫采用頂部進(jìn)入，控制從罐壓力，使泡沫破裂，起到消除泡沫的作用，將消泡后液體通過蠕動泵由從罐底部打回主罐進(jìn)行發(fā)酵。發(fā)酵168h，鼠李糖脂產(chǎn)量60g/L以上，轉(zhuǎn)化率80%以上，串聯(lián)發(fā)酵生產(chǎn)過程見附圖3。
[0014]4.利用該菌及發(fā)酵工藝生產(chǎn)鼠李糖脂有以下優(yōu)點(diǎn):
1)該菌種發(fā)酵產(chǎn)量高，轉(zhuǎn)化率高，可以有效以棕櫚油為碳源生產(chǎn)鼠李糖脂。
[0015]2)使用本發(fā)酵工藝，在300L發(fā)酵罐中可以在避免發(fā)酵起泡逃液的情況下達(dá)到較高鼠李糖脂發(fā)酵產(chǎn)量。
【附圖說明】
[0016]附圖1:搖瓶發(fā)酵鼠李糖脂產(chǎn)量及細(xì)胞干重圖附圖2:主從串聯(lián)發(fā)酵罐示意圖
附圖3:主從罐串聯(lián)發(fā)酵生產(chǎn)鼠李糖脂產(chǎn)量及細(xì)胞干重圖附圖4:主罐發(fā)酵過程關(guān)鍵參數(shù)示意圖具體實(shí)施
以下為列舉的實(shí)施例，以便于更好地理解本發(fā)明。
[0017]實(shí)施例1銅綠假單胞菌TIB R02無機(jī)鹽發(fā)酵培養(yǎng)基中硝酸銨濃度的優(yōu)化:銅綠假單胞菌TIB R02分別接種于10%的棕櫚油為碳源，硝酸鈉濃度為5g/L、7.5g/L、10g/L、12.5g/L和15g/L的無機(jī)鹽培養(yǎng)基中，該培養(yǎng)基其他成分為:1.1 g/L KC1; 1.1 g/L NaCl;0.00028 g/L FeS04.7H20; 3.4 g/L KH2P04; 4.4 g/L K2HP04; 0.5 g/L MgS04.7H20; 0.5g/L酵母粉。無機(jī)鹽培養(yǎng)基中加入適當(dāng)微量元素包括:0.29 g/L ZnS04.7H20; 0.24 g/LCaC12.4H20; 0.25 g/L CuS04.5H20; 0.17 g/L MnS04.H20。發(fā)酵使用 250ml 搖瓶裝液量為25ml，30度、200r/min的培養(yǎng)144小時，每24h取樣檢測鼠李糖脂產(chǎn)量、細(xì)胞干重及棕櫚油剩余量。銅綠假單胞菌TIB R02在硝酸鈉濃度為7.5g/L時產(chǎn)量最高、轉(zhuǎn)化率最高，分別為鼠李糖脂最高產(chǎn)44.4g/L和60.02%，所以發(fā)酵過程中硝酸鈉的濃度選擇為7.5g/L。
[0018]實(shí)施例2銅綠假單胞菌TIB R02無機(jī)鹽發(fā)酵培養(yǎng)基中棕櫚油濃度的優(yōu)化:
銅綠假單胞菌TIB R02分別接種于棕櫚油濃度為75g/L、100g/L、125g/L和150g/L
的無機(jī)鹽培養(yǎng)基中，無機(jī)鹽培養(yǎng)基成分為:7.5g/L NaN03 ； 1.1 g/L KC1; 1.1 g/L NaCl;0.00028 g/L FeS04.7H20; 3.4 g/L KH2P04; 4.4 g/L K2HP04; 0.5 g/L MgS04.7H20; 0.5g/L酵母粉。無機(jī)鹽培養(yǎng)基中加入適當(dāng)微量元素包括:0.29 g/L ZnS04.7H20; 0.24 g/LCaC12.4H20; 0.25 g/L CuS04.5H20; 0.17 g/L MnS04.H20。發(fā)酵使用 250ml 搖瓶裝液量為25ml，30度、200r/min的培養(yǎng)196小時，每24h取樣檢測鼠李糖脂產(chǎn)量、細(xì)胞干重及棕櫚油剩余量。銅綠假單胞菌TIB R02在棕櫚油濃度為75g/L時轉(zhuǎn)化率最高，約為76.9%。所以發(fā)酵過程中棕櫚油的濃度選擇為75g/L。
[0019]實(shí)施例3在最適C/N條件下以棕櫚油為碳源利用銅綠假單胞菌TIB R02進(jìn)行搖瓶發(fā)酵:銅綠假單胞菌TIB R02,10%的接種量接種于棕櫚油濃度為75g/L、硝酸鈉7.5g/L的