專利名稱：：具有抗腫瘤和影響線粒體功能的錳配合物及其制備方法
技術領域：
：本發(fā)明涉及具有抗腫瘤和影響細粒體功能錳配合物及其制備方法。
背景技術：
：癌癥是嚴重危害人類健康的主要疾病之一，尋找高效低毒的抗腫瘤藥一直是人類不懈奮斗的目標。合成和發(fā)現(xiàn)高效低毒的抗腫瘤藥物，研究其作用機制以及在分子和細胞水平上研究癌癥的起因，在醫(yī)學、生物學和化學等學科領域有著重要的意義。最早的有關金屬配合物在抗腫瘤活性中的報道可以追溯到16世紀，但直到20世紀60年代無機配合物順鉑的抗腫瘤活性被發(fā)現(xiàn)才引起人們對其他種類的非有機抑制細胞生長藥的研究發(fā)生極大興趣(ClarkeMJ,ZhuF，F(xiàn)rascaDR,Chem.Rev.,1999,99(9):2511)?？茖W工作者在鉑類抗腫瘤藥物領域進行了大量研究工作，這些研究工作大多是圍繞著經(jīng)典鉑類抗腫瘤藥物即以順鉑為模式的二價鉑類配合物進行的，已有四項鉑類抗腫瘤專利報道(CN86106751抗腫瘤鉑配合物及其制備和應用；CN87104027新順鉑鉻合物，其小鼠抗腫瘤組合物及其制備過程；中國專利CN89106648.9鉑-(IV)-二胺復合物；中國專利CN95103058.2新的抗腫瘤鉑絡合物，但鉑類抗腫瘤藥物具有毒副作用和交叉耐藥性等缺點(楊寧，國際泌尿系統(tǒng)雜志，2006，26(6)，849)。順鉑劑量依賴的腎毒性限制了其臨床治療腫瘤的效果。隨后許多非鉑族金屬的配合物，都顯示對人和實驗動物的腫瘤有效，如膦基-烴基VI族金屬絡合物具有良好在抗腫瘤方面的應用(CN92104058.X制備膦基-烴基Vl族金屬絡合物及含有這些絡合物的抗腫瘤組合物方法其小鼠抗腫瘤組合物及其制備過程)。己報道的抗腫瘤配合物主要包括過渡金屬鈦、釩、鈮、鉬、錸、釕、銠、銥、鉑以及銅和金等重金屬元素配合物(DreicerR.，PropertK.J.,RothB.J.,etal,Caneer，1997,79(1):110.曲平，何華，化學進展，2006，18(12)，1646。李風華，吳紅星，林華寬，高等學校化學學報，2006，27(10)，1800)。而具有抗腫瘤和對抗Ca2+誘發(fā)的線粒體的腫脹功能的錳配合物未見報道。肝組織內(nèi)線粒體豐富，由肝細胞制備的線粒體有一定的生物活性，可以反映化合物對線粒體的直接作用。線粒體腫脹是其中最直觀的一個指標。鈣離子誘導下，線粒體發(fā)生腫脹，是線粒體自我調(diào)控功能的表現(xiàn)之一。對抗Ca2+誘發(fā)的線粒體腫脹的化合物在抗衰和治療缺血再灌注損傷方面有廣闊的應用前景(李毅，黃永青，鄭民纓，楊海華，徐評議，劉焯霖，國際遺傳學雜志，2007,30G)，l卯)。我們發(fā)明的具有抗腫瘤活性和對抗〔&2+誘發(fā)的線粒體腫脹功能的錳配合物為高效低毒抗腫瘤藥的研制開辟了一條新途徑。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的是提供一種具有抗腫瘤和影響線粒體功能的錳配合物及其制備方法。本發(fā)明用化學方法合成了一個新的錳配合物，并運用物理手段確定了配合物的結構。體外抗腫瘤活性測試研究了配合物對腫瘤細胞的影響，發(fā)現(xiàn)錳配合物對腫瘤細胞A549，Hela、H印G-2和Ecal09生長均有強的抑制作用，能誘導腫瘤細胞凋亡；配合物以劑量的方式對抗Ca2+誘發(fā)的線粒體的腫脹功能。所以錳配合物成為新的具有抗腫瘤活性和治療Ca2+誘發(fā)的線粒體的腫脹相關疾病的小分子藥用先導物。一種具有抗腫瘤和影響線粒體功能的錳配合物，其結構式為上述抗腫瘤和影響線粒體功能的錳配合物的制備方法，其特征在于將N-烯丙基二吡啶甲基胺和MnCl2按摩爾比l:l溶于甲醇溶液中，控制在30-100°C;最佳反應溫度為8(TC，反應時間2-8小時，最佳反應時間為4小時，去甲醇獲得淡黃色錳配合物二氯)二氯二(N-烯丙基二吡啶甲基胺)雙錳(II)[L2Mn2Cl4]。Yield:80%，分子式C30H34Cl4Mn2N6。元素分析實測值C，49.40%;H，4.53%;N，11.46;Mn，14.21%;計算值C，49.34%;H，4.69%;N，11.51;Mn,14.19%。紅外光譜數(shù)據(jù)(IR，era—1):2936，1615，1577，簡寫為L2Mn2Cl4，其中L代表:1498，1037，841，806，506。錳配合物的制備路線如下-"lMn"代表lpmolMn-ENP配合物，"Ca2+"為鈣離子，"Mn"代表只加藥物而不加鈣離子組，"BL"表示空白組，"Mn+Ca2+"表示先加不同濃度化合物孵育3min后再加鈣離子。本發(fā)明用化學方法合成了一個新的錳配合物，并運用物理手段確定了配合物的結構。研究了錳配合物體外抗腫瘤活性，MTT實驗結果顯示我們合成的錳配合物對腫瘤細胞A549，Hela、HepG-2和Ecal09生長均有強的抑制作用，能誘導腫瘤細胞凋亡；配合物以劑量的方式對抗C^+誘發(fā)的線粒體的腫脹功能。所以錳配合物成為新的具有抗腫瘤活性和治療Ca^誘發(fā)的線粒體的腫脹相關疾病的小分子藥用先導物。圖1錳配合物對50nmolC^+誘導的小鼠肝臟線粒體腫脹的影響具體實施方式1試劑和原料實驗中所用試劑均為分析純，除特別注明外，未經(jīng)進一步處理。元素分析用Carlo-Erba-l106型元素分析儀測定，紅外光譜用Fr-IR169(固體用KBr壓片)?？鼓[瘤試驗試劑如下(1)RPMI1640培養(yǎng)基(RPMI1640+10%小牛血清+HEPES3.5g/l+NaHC032.2g/l+青霉素0.13g/l+鏈霉素0.15g/l)。(2)高糖DMEM培養(yǎng)基(DMEM+10%小牛血清+HEPES3.5g/l+NaHC032.2g/l+青霉素0.13g/l+鏈霉素0.15g/1)。(3)MTT(美國Amresco公司產(chǎn)品)。2、錳配合物的合成實施例l(最價反應條件舉例)將N-烯丙基二吡啶甲基胺和MnCl2按摩爾比1:1溶于甲醇溶液中，控制反應溫度為80°C，反應時間4小時，冷至室溫，蒸去甲醇獲得淡黃色錳配合物二(p氯)二氯二(N-烯丙基二吡啶甲基胺)雙錳(II)[L2Mn2Cl4]。Yield:80%。分子式C3QH34Cl4Mn2N6。元素分析實測值c，49.40%;H，4.53%;N，11.46;Mn，14.21%;計算值C，49.34%;H，4.69%;N，11.51;Mn，14.19%。紅外光譜數(shù)據(jù)(IR，cm-l)2936，1615，1577，1498，1037，841，806，506。實施例2:將N-烯丙基二吡啶甲基胺和MnCl2按摩爾比h2溶于甲醇溶液中，控制反應溫度為8CTC，反應時間4小時，冷至室溫，蒸去甲醇獲得淡黃色錳配合物二(k氯)二氯二(N-烯丙基二吡啶甲基胺)雙錳(II)[L2Mn2Cl4]。Yield:40%。實施例3:將N-烯丙基二吡啶甲基胺和MnCl2按摩爾比1:1溶于甲醇溶液中，控制反應溫度為4(TC,反應時間8小時，冷至室溫，蒸去甲醇獲得淡黃色錳配合物二(p-氯)二氯二(N-烯丙基二吡啶甲基胺)雙錳(II)[L2Mn2Cl4〗。Yield:62%。3、抗腫瘤活性測定篩選的細胞株有人肝癌細胞株(A549，Hela、HepG-2和Ecal09)。測定采用溴化四氮唑藍(MTT)法?；罴毎€粒體中的琥珀酸脫氫酶能使外源性溴化四氮唑藍還原為難溶性的藍紫色結晶物(Formazan)并沉積在細胞中，而死細胞無此功能。二甲基亞砜(DMSO)能溶解細胞中的紫色結晶物，用酶聯(lián)免疫檢測儀在570nm波長處測定其光吸收值，可間接反映活細胞數(shù)量。操作步驟如下3丄1接種取處于指數(shù)生長期，狀態(tài)良好的細胞一瓶，加入適量胰蛋白酶消化液，消化使貼壁細胞脫落，用含12%小牛血清的RPMI1640(或DMEM)培養(yǎng)液配成細胞懸液，計數(shù)，并將細胞密度調(diào)整稀釋至2.2*104/ml.取細胞懸液接種于96孔板上，180ul/孔(含腫瘤細胞4000/孔)。3丄2培養(yǎng)將培養(yǎng)板轉入恒溫C02培養(yǎng)箱中，在37"C，5%032及飽和濕度條件下培養(yǎng)24小時。3丄3加藥受試化合物先用DMSO或超純水配制成0.1M濃度，再作4個稀釋度，濃度依次為10—4M，1(T5M，1(T6M，1(T7M。加入受試化合物，20ul/孔，培養(yǎng)48小時。每組設3個平行孔，并重復3次。3丄4染色3丄4.1將MTT加入96孔板(貼壁細胞)中，20ul/孔，置于培養(yǎng)箱中孵育4小時，吸棄孔內(nèi)上清液，加入DMSO100ul/孔，置平板搖床上震蕩5分鐘。3丄4.2將MTT加入96孔板中(懸浮細胞)，20ul/L，置于培養(yǎng)箱中孵育4小時，再加入20。/。SDS50ul/孔，置于培養(yǎng)箱中過夜。3丄5領iJ定酶標儀設定波長為570nm，參考波長為630nm，測定96孔板每孔吸光值，記錄結果并計算細胞抑制率，以判斷受試藥物的抗腫瘤活性。3.3數(shù)據(jù)處理3.3.1細胞抑制率的計算對照組平均OD值-給藥組平均OD值抑制率=..............................................xl00%對照組平均OD值.IC50的計算:根據(jù)中國藥科大學新藥篩選中心提供的IC50軟件計算所得。MTT法測試結果示于表1。錳配合物體外抗腫瘤活性實驗MTT法測試結果示于表1。表1錳配合物對癌鄉(xiāng)田胞抑制作用MTT實驗數(shù)據(jù)<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>數(shù)據(jù)顯示在100umol/L濃度錳配合物對肝癌細胞抑制率超過50%，對宮頸癌細胞和細胞肺癌抑制率分別為85%和90%。對宮頸癌細胞Hela和細胞肺癌A549半數(shù)抑制率需要的化合物濃度IC50分別為9和18umol/L，對肝癌細胞半數(shù)抑制率需要的化合物濃度為IC50為61umol/L。而化合物MnCl2在小于100umol/L對腫瘤細胞的生長沒有抑制作用。這說明我們合成的錳配合物[L2Mn2CU]可作為抗癌藥用先導物。4化合物與線粒體作用實驗腫脹程度根據(jù)線粒體懸液在波長為540nm處的吸光值的變化進行測定。制備的肝臟線粒體按0.51.0mg蛋白^r1重懸于線粒體緩沖液(125mmol-L—1sucrose,50mmol'L-1KC1,2mmol.L-1KH2PO4,5mmol'I/1succinateacid，5Hmol丄-1rotenone,10mmol.L懇1Hepes，pH7.4)中，加入50jamol'L"Ca2+(30。C)。檢測加入Ca"后5min內(nèi)吸光值的變化(AA)，AA值越大，表明線粒體腫脹度越高。在觀察化合物作用的實驗中，化合物先加入線粒體懸液中，孵育3min,加入Ca2—，每30S測一次吸光值。最后以時間為橫坐標，AA540nm為縱坐標作圖。錳配合物對5(^molC^+誘導的小鼠肝臟線粒體腫脹的影響實驗結果示于圖2，由圖2的結果可以看出BL組的吸光值下降較小(0.075)，說明線粒體懸液較穩(wěn)定，但仍有一些自發(fā)腫脹。50pmoH/1C^+可以誘發(fā)線粒體明顯腫脹，AAs4o達0.32。5(Vmol.L—1配合物預處理可以明顯對抗50nmol.L"Ca"誘發(fā)的線粒體腫脹(AAs4o達0.062)、而80^unol丄"配合物幾乎可以完全對抗Ca^誘發(fā)的線粒體腫脹(AA54o與BL組接近)，100nmol.U1配合物甚至可以對抗線粒體懸液的自發(fā)腫脹。另外，濃度高于50pmol丄"的配合物單獨作用時能夠對抗線粒體懸液的自發(fā)腫脹。實驗結果表明配合物以劑量依賴方式對抗C^+誘發(fā)的線粒體腫脹功能，直接影響線粒體的作用。權利要求1、具有抗腫瘤和影響線粒體功能的錳配合物，其結構式為id="icf0001"file="S2007101922285C00011.gif"wi="89"he="43"top="5"left="5"img-content="drawing"img-format="tif"orientation="portrait"inline="no"/>2、權利要求1所述的抗腫瘤和影響線粒體功能的掹配合物的制備方法，其特征在于將N-烯丙基二吡啶甲基胺和MnCl2按摩爾比1:l溶于甲醇溶液中，控制在30-10(TC;反應2-8小時，去甲醇獲得錳配合物二(y-氯)二氯二(N-烯丙基二吡啶甲基胺)雙錳(II)。3、權利要求2所述的抗腫瘤和影響線粒體功能的錳配合物的制備方法，其特征在于反應溫度為8(TC，反應時間為4小時。4、權利要求1所述的具有抗腫瘤和影響線粒體功能的錳配合物在制備具有抗腫瘤活性和治療<^2+誘發(fā)的線粒體的腫脹相關疾病的小分子藥用先導物的應用。全文摘要一種具有抗腫瘤和影響線粒體功能的錳配合物，其結構式為將N-烯丙基二吡啶甲基胺和MnCl₂按摩爾比1∶1溶于甲醇溶液中，控制在30-100℃；最佳反應溫度為80℃，反應時間2-8小時，最佳反應時間為4小時，去甲醇獲得淡黃色錳配合物。本發(fā)明的錳配合物對腫瘤細胞A549，Hela、HepG-2和Eca109生長均有強的抑制作用，能誘導腫瘤細胞凋亡；配合物以劑量的方式對抗Ca²⁺誘發(fā)的線粒體的腫脹功能。文檔編號C07F13/00GK101182332SQ200710192228公開日2008年5月21日申請日期2007年12月21日優(yōu)先權日2007年12月21日發(fā)明者郭文杰,陳秋云,靜高,娟黃申請人:江蘇大學