一種天然蛋白/聚己內(nèi)酯納米纖維電紡膜及其制備和應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及含天然蛋白/PCL納米纖維成分電紡膜的制備及其在細胞培養(yǎng)及組織工程的基礎(chǔ)研究及應(yīng)用，屬于生物醫(yī)藥，組織工程學(xué)，細胞生物學(xué)，干細胞生物學(xué)，生物材料學(xué)及心臟大血管外科領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002]缺血性心臟病作為我國主要健康問題之一，給我國及世界其他國家?guī)砹顺林氐慕?jīng)濟負擔(dān)。盡管目前的藥物，介入以及外科手術(shù)治療缺血性心臟病可以有效的改善心肌供血，挽救瀕死心肌，可是對于已經(jīng)造成死亡的無功能心肌并沒有修復(fù)作用。大面積的心肌死亡可引起的嚴重的心律失常、心衰以及心臟驟停。對于晚期心臟病的治療，目前較為有效的方法是心臟移植。但是心臟移植的供體數(shù)量少，強烈的免疫排斥反應(yīng)等因素增加了其醫(yī)療成本并導(dǎo)致其很難在臨床上大范圍應(yīng)用。
[0003]心肌細胞作為心臟組成的基本單元是參與完成心臟一系列復(fù)雜功能的物質(zhì)基礎(chǔ)。已有研究報道稱，應(yīng)用成體干細胞移植的方法可以治療小鼠缺血性心臟病，包括改善心梗后射血分數(shù)，阻止左心室重構(gòu)，以及通過干細胞的分化增加心肌細胞數(shù)量。因此干細胞移植技術(shù)受到了越來越多的關(guān)注，為治療缺血性心臟病提供了一種全新的治療前景。
[0004]干細胞分類多樣，來源廣泛。骨髓干細胞在心肌再生及心臟損傷修復(fù)中已有廣泛的報道。其中，c_kit+骨髓干細胞移植入小鼠體內(nèi)可減少小鼠心梗面積，提高左心室射血分數(shù)，并且在小鼠心梗周邊區(qū)還出現(xiàn)了新生心肌。這些研究提示恰當(dāng)?shù)囊浦卜绞揭约罢_的干細胞選擇可以促進梗死區(qū)域心肌細胞的再生以及瀕死區(qū)心肌的再血管化。
[0005]血管內(nèi)注射和心肌原位注射是目前干細胞移植修復(fù)受損心肌的主要方法。血管內(nèi)注射是一種創(chuàng)傷小，操作簡單的治療方法，但是血管內(nèi)注射干細胞后，干細胞歸巢的數(shù)量，免疫排斥反應(yīng)等因素制約了其療效。而心肌原位注射的方法雖然可以保證一定數(shù)量的干細胞存在在受損心肌的局部，但是由于其損傷心肌的正常組織結(jié)構(gòu)并且注射部位局限等因素大大限制了其廣泛的臨床應(yīng)用。而心肌細胞是存在于大量外基質(zhì)(ECM)中的，其主要成分是心肌間隙中成纖維母細胞產(chǎn)生和分泌的膠原蛋白及彈性纖維，這些細胞外基質(zhì)對維持心臟正常的形態(tài)和功能起重要作用，心肌膠原纖維相互交織，形成多層次、多方位、復(fù)雜的三維空間結(jié)構(gòu)，在支持、保護心肌細胞、協(xié)調(diào)心肌收縮、舒張等方面發(fā)揮重要作用。因此，為骨髓干細胞建立一種類似心肌基質(zhì)的環(huán)境將更加有利于其對心肌缺損的修復(fù)。
[0006]在目前的研究中，聚己內(nèi)酯(Polycaprolactone，PCL)作為由ε-己內(nèi)酯開環(huán)聚合所得到的線性脂肪族聚酯，具有良好的熱穩(wěn)定性、生物降解性、半結(jié)晶性、力學(xué)性能、藥物通透性和生物相容性，常被用于心肌組織工程。通過干細胞移植，形成“支架材料-干細胞”復(fù)合體，治療心肌梗死。但是由于心肌是一種納米級別的片層狀機構(gòu)，傳統(tǒng)的支架無法準(zhǔn)確模擬心肌基質(zhì)環(huán)境。因此，本發(fā)明通過靜電紡絲技術(shù)簡單快速的制備納米纖維，利用其超微結(jié)構(gòu)不僅可以模擬心肌細胞外基質(zhì)環(huán)境，促進細胞向纖維膜內(nèi)生長，而且較大的比表面積增強細胞間的相互接觸，利于細胞之間的相互作用。
[0007]心肌組織細胞外基質(zhì)最主要的構(gòu)成組分即膠原蛋白及彈力蛋白。因此本發(fā)明創(chuàng)立了應(yīng)用靜電紡絲技術(shù)將天然蛋白(膠原蛋白/彈力蛋白)與聚酯類材料聚己內(nèi)酯(PCL)制成納米纖維膜，利用天然蛋白對脂肪族聚酯類材料聚己內(nèi)酯(PCL)的疏水性進行改性，增強聚合物材料對細胞的粘附，從而更充分的模擬心肌細胞外基質(zhì)環(huán)境。該納米纖維具有良好的生物相容性與力學(xué)性能，可以從結(jié)構(gòu)和成分仿生兩方面改善干細胞移植治療心肌梗死的治療效果，從而實現(xiàn)“支架材料-干細胞”復(fù)合體的生物功能性。因此，本發(fā)明提出:將天然蛋白(膠原蛋白/彈力蛋白)與聚己內(nèi)酯(PCL)制成電紡膜，復(fù)合骨髓C_kit+干細胞種制成“支架材料-干細胞”復(fù)合體-心肌復(fù)合補片，修復(fù)受損心肌，改善心梗后心功能。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0008]本發(fā)明的目的是提供一種可模擬心肌細胞外基質(zhì)環(huán)境的天然蛋白組分復(fù)合PCL納米纖維電紡膜并通過種植干細胞制備心肌補片從而修復(fù)受損心肌，達到治療心肌梗死的目的。
[0009]為了達到上述目的，本發(fā)明提供了一種天然蛋白/聚己內(nèi)酯納米纖維電紡膜，通過將天然蛋白和聚己內(nèi)酯混合配制紡絲液，經(jīng)電紡而成，所述的天然蛋白包含天然彈力蛋白(elastin)和天然膠原蛋白(collagen)。
[0010]本發(fā)明還提供了上述的天然蛋白/聚己內(nèi)酯納米纖維電紡膜的制備方法，其特征在于，包括:將天然彈力蛋白和天然膠原蛋白按照質(zhì)量比1: 9?3: 7混合成天然蛋白混合物，將所述的天然蛋白混合物與聚己內(nèi)酯按照質(zhì)量比2: 8?8: 2混合，溶于六氟異丙醇或三氟乙醇中，攪拌，得到紡絲液，電紡，所述的電紡條件為:電壓為15kV，接收距離為12.5cm，注射速率為1.2ml/h，環(huán)境溫度為室溫，相對濕度為20-80%，得到天然蛋白/聚己內(nèi)酯納米纖維電紡膜。
[0011]優(yōu)選地，所述的攪拌為采用磁力攪拌器攪拌24h。
[0012]優(yōu)選地，所述的天然蛋白混合物與六氟異丙醇或三氟乙醇的質(zhì)量體積比為15%(0.15g/ml)(以 g/ml 計)。
[0013]優(yōu)選地，所得的天然蛋白/聚己內(nèi)酯納米纖維電紡膜經(jīng)干燥、消毒備用。
[0014]本發(fā)明還提供了上述的天然蛋白/聚己內(nèi)酯納米纖維電紡膜作為組織工程支架在制備組織工程移植物中的應(yīng)用。
[0015]優(yōu)選地，所述的組織工程移植物為用于修復(fù)缺血性心肌損傷、改善心臟功能、改善心力衰竭或其他原因造成的心肌重構(gòu)的組織工程移植物。
[0016]優(yōu)選地，所述的組織工程移植物為用于修復(fù)其他除心臟缺損外的組織缺損疾病的組織工程移植物。
[0017]本發(fā)明還提供了上述的天然蛋白/聚己內(nèi)酯納米纖維電紡膜作為細胞體外培養(yǎng)介質(zhì)中的應(yīng)用。所述的細胞體外培養(yǎng)介質(zhì)可用于提供促進細胞黏附、存活、增殖的微環(huán)境及模擬心肌細胞外基質(zhì)構(gòu)架。
[0018]本發(fā)明還提供了一種心臟補片，其特征在于，包含種子細胞以及上述的天然蛋白/聚己內(nèi)酯納米纖維電紡膜。
[0019]優(yōu)選地，所述的種子細胞為骨髓來源的c_kit+干細胞、骨髓單個核細胞、間充質(zhì)干細胞、心肌去分化細胞、心肌干細胞及胚胎干細胞來源的細胞中的至少一種。
[0020]優(yōu)選地，所述的骨髓C_kit+干細胞為小鼠骨髓來源的C-kit+干細胞，其制備方法包括:取心梗3天后的小鼠的股骨和脛骨，用Hanks平衡鹽溶液沖出骨髓，分離出骨髓單個核細胞，磁珠分選得到c_kit+干細胞。
[0021]本發(fā)明還提供了上述的心臟補片的制備方法，其特征在于，包括:將種子細胞種于上述的天然蛋白/聚己內(nèi)酯納米纖維電紡膜上，培養(yǎng)得到心肌補片。
[0022]本發(fā)明驗證了此心臟補片對心功能的修復(fù)狀況以及含天然蛋白和可降解高分子物質(zhì)的電紡膜作為模擬心肌細胞外基質(zhì)環(huán)境為干細胞體外培養(yǎng)提供促進細胞粘附，存活，增殖的場所和細胞外基質(zhì)骨架。
[0023]與現(xiàn)有的技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果是:
[0024]1.本發(fā)明將含有心肌組織細胞外基質(zhì)成分的天然蛋白和人工合成的可降材料混合，通過靜電紡絲技術(shù)快速，有效的制成納米纖維膜，具有操作簡單，材料易獲得，制作成本低廉的優(yōu)勢。確保今后商品化的可能。利用天然蛋白與人工合成可降解材料的各自優(yōu)點，不僅保留良好的生物力學(xué)性能，而且充分模擬心肌細胞外基質(zhì)環(huán)境。從結(jié)構(gòu)和成分兩方面進行仿生模擬，改善干細胞移植治療心肌梗死的治療效果。因此可以作為細胞外培養(yǎng)介質(zhì)提供促進細胞粘附，存活，增殖的細胞外基質(zhì)微環(huán)境。
[0025]2.已有文獻報道，骨髓C_kit+干細胞可以向心肌細胞，血管平滑肌，內(nèi)皮細胞方向分化，并在缺血性心臟病中發(fā)揮治療作用。但是有報道稱骨髓C_kit+干細胞在體外增殖能力差，存活時間短。本發(fā)明中含有天然蛋白和人工合成可降解材料的靜電紡絲在體外可以促進骨髓C_kit+干細胞的大量增增值，從而為細胞移植制造足夠多數(shù)量的種子細胞。本發(fā)明首次提出將骨髓C_kit+干細胞種植于含有天然蛋白成分和可降解物質(zhì)混合的電紡膜上制成心臟補片。
[0026]3.本發(fā)明中還發(fā)現(xiàn)含有天然蛋白成分和可降解物質(zhì)混合的電紡膜在體外具有促進細胞粘附、增殖的作用，移植到心梗心肌表面可以有效改善心梗后心功能，組織左心室重構(gòu)，起到缺血性心臟病的干細胞治療作用。
【附圖說明】
[0027]圖1為對照組以及天然蛋白/聚己內(nèi)酯納米纖維電紡膜的電鏡照片；(放大倍數(shù)1.5k 倍)
[0028]圖2A為各天然蛋白/聚己內(nèi)酯納米纖維電紡膜的接觸角圖片；圖2B為各天然蛋白/聚己內(nèi)酯納米纖維電紡膜接觸角統(tǒng)計圖；#，&，*代表與20%天然蛋白(NP)組，50%天然蛋白(NP)組中相同天然蛋白配比形成的電紡膜以及對照組相比P< 0.05。
[0029]圖3為各組分電紡膜中天然蛋白配比比例彈力蛋白與膠原蛋白