本發(fā)明涉及一種天然柞蠶絲素蛋白/聚乳酸-聚己內(nèi)酯復(fù)合納米纖維神經(jīng)組織工程支架的制備方法，屬于生物醫(yī)學(xué)材料涉及神經(jīng)缺損修復(fù)領(lǐng)域。

背景技術(shù)：

在人類醫(yī)療和保健方面，器官和組織的缺損或衰竭是發(fā)生最為頻繁、最具破壞性和花費(fèi)最為昂貴的問題。神經(jīng)的再生以及功能的恢復(fù)一直是困擾臨床的一個(gè)難題，全世界每年都有很多的患者因神經(jīng)組織壞死需要進(jìn)行神經(jīng)修復(fù)。而目前的治療方法主要是自體神經(jīng)移植來治療神經(jīng)斷裂或損傷。這種方法雖然拯救或延長了不少人的生命，但采用以犧牲健康組織為代價(jià)的“以傷治傷”方法并不完美，關(guān)鍵問題是具有生物活性的自體神經(jīng)來源非常有限。此外在目前的醫(yī)療條件下很難避免神經(jīng)纖維的錯(cuò)向?qū)?，從而影響神?jīng)功能的恢復(fù)。近年來，組織工程與再生醫(yī)學(xué)的發(fā)展為重建或修復(fù)神經(jīng)組織提供了有效的治療手段，利用生物材料構(gòu)建的神經(jīng)再生導(dǎo)管，為臨床神經(jīng)缺損修復(fù)帶來了曙光。

神經(jīng)支架材料的設(shè)計(jì)應(yīng)該最大限度仿生人體內(nèi)細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)的結(jié)構(gòu)與功能特點(diǎn)才能有效解決材料的生物相容性問題，調(diào)控生物信號的傳導(dǎo)，誘導(dǎo)神經(jīng)細(xì)胞和組織生長，促進(jìn)神經(jīng)機(jī)體的再生與修復(fù)。人體細(xì)胞外基質(zhì)本質(zhì)上是由蛋白質(zhì)和糖胺聚糖交聯(lián)而成的納米纖維網(wǎng)絡(luò)，纖維直徑一般為50-500nm。天然的細(xì)胞外基質(zhì)包含很多生物信息，能使細(xì)胞更容易附著并維持細(xì)胞功能。細(xì)胞通過細(xì)胞膜上的受體系統(tǒng)與細(xì)胞外基質(zhì)上的配體特異性結(jié)合并對外界信號做出反應(yīng)，影響細(xì)胞行為。因此從結(jié)構(gòu)和功能上仿生細(xì)胞外基質(zhì)的理想神經(jīng)支架具有廣闊的開發(fā)前景。

柞蠶絲素蛋白是絲素蛋白的一種，但在絕大部分的絲素蛋白材料的研究或報(bào)道中，所用的原料都是家蠶絲。柞蠶絲素蛋白是由柞蠶絲腺內(nèi)壁上的內(nèi)皮細(xì)胞分泌的高純度蛋白質(zhì)，其氨基酸組成中以甘氨酸、丙氨酸和絲氨酸為主，具有良好的生物相容性，其本身及其降解產(chǎn)物對細(xì)胞和機(jī)體無毒，不會或較少引起炎癥和免疫排斥反應(yīng)。特別是其蛋白質(zhì)分子中含有特殊的精氨酸-甘氨酸-天門冬氨酸(RGD)三肽序列。RGD序列作為細(xì)胞膜整合素受體與細(xì)胞外配體相結(jié)合的識別位點(diǎn)，介導(dǎo)細(xì)胞與細(xì)胞外基質(zhì)及細(xì)胞之間的相互作用，能夠促進(jìn)細(xì)胞對于支架的識別及粘附。但由于天然蛋白質(zhì)力學(xué)性能較差無法滿足組織功能的需要，所以限制了其在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域中應(yīng)用。

聚乳酸-聚己內(nèi)酯(P(LLA-CL))是乳酸和己內(nèi)酯的共聚物，由于其具有良好的生物可降解性和良好機(jī)械性能，被廣泛用于組織工程和藥物釋放領(lǐng)域。但是聚乳酸-聚己內(nèi)酯屬于合成高分子材料，不能為神經(jīng)組織生長提供所需的生物信號，同時(shí)親水性較差，不利于細(xì)胞的粘附和生長。因此，將柞蠶絲素蛋白和聚乳酸-聚己內(nèi)酯混紡可以結(jié)合二者的優(yōu)點(diǎn)，既能使支架材料具有較高且符合神經(jīng)組織的力學(xué)性能，又能為組織生長提供生物信號，促進(jìn)神經(jīng)細(xì)胞的粘附、增值和分化，從而滿足神經(jīng)組織的需要。

因此，將柞蠶絲素蛋白和聚乳酸-聚己內(nèi)酯共混采用靜電紡絲技術(shù)制備的復(fù)合納米纖維支架能最大限度的從結(jié)構(gòu)和功能上仿生人體細(xì)胞外基質(zhì)，有望成為理想中的神經(jīng)組織支架。公開號為101502671的中國發(fā)明專利中，公開了絲素蛋白/P(LLA-CL)復(fù)合納米纖維組織修復(fù)支架的制備方法，其絲素蛋白采用的是家蠶絲蛋白，由于家蠶絲素蛋白氨基酸序列中不含有RGD三肽序列，因此對于細(xì)胞識別以及粘附性方面不足。而柞蠶絲素蛋白與聚乳酸-聚己內(nèi)酯共混采用靜電紡絲的方法制備神經(jīng)導(dǎo)管支架至今未見報(bào)道。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是提供一種天然柞蠶絲素蛋白/聚乳酸-聚己內(nèi)酯復(fù)合納米纖維神經(jīng)組織工程支架的制備方法。

為了解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明提供了一種納米纖維神經(jīng)組織工程支架的制備方法，其特征在于，包括：將柞蠶絲素蛋白或柞蠶絲素蛋白與聚乳酸-聚己內(nèi)酯溶于溶劑中，得到靜電紡絲溶液，進(jìn)行靜電紡絲，將所得的納米纖維膜采用乙醇或乙醇溶液進(jìn)行熏蒸處理，真空干燥，得到納米纖維神經(jīng)組織工程支架。

優(yōu)選地，所述的靜電紡絲溶液中柞蠶絲素蛋白與聚乳酸-聚己內(nèi)酯的總濃度為4％-12％(w/v)。

優(yōu)選地，所述的柞蠶絲素蛋白與聚乳酸-聚己內(nèi)酯的質(zhì)量比為0∶100-100∶0，不包括0∶100。

更優(yōu)選地，所述的柞蠶絲素蛋白與聚乳酸-聚己內(nèi)酯的質(zhì)量比為100∶0、75：25、50∶50或25∶75。

最優(yōu)選地，所述的柞蠶絲素蛋白與聚乳酸-聚己內(nèi)酯的質(zhì)量比為25∶75。

優(yōu)選地，所述的柞蠶絲素蛋白的制備方法包括：將柞蠶絲進(jìn)行脫膠、溶解、透析處理后得到柞蠶絲素蛋白溶液，進(jìn)行冷凍干燥，得到柞蠶絲素蛋白。

優(yōu)選地，所述的聚乳酸-聚己內(nèi)酯的分子量Mn為25-35萬。

優(yōu)選地，所述的溶劑為六氟異丙醇。

優(yōu)選地，所述的靜電紡絲的工藝參數(shù)為：電壓為10-15KV，噴絲頭和接收裝置之間的距離為8-15cm，紡絲速率為0.8-1.5ml/h。

優(yōu)選地，所述的熏蒸處理采用體積分?jǐn)?shù)為75％的乙醇進(jìn)行。

優(yōu)選地，所述的真空干燥時(shí)間為24-72h。

優(yōu)選地，通過調(diào)節(jié)柞蠶絲素蛋白和聚乳酸-聚己內(nèi)酯的質(zhì)量比及靜電紡絲溶液中柞蠶絲素蛋白與聚乳酸-聚己內(nèi)酯的總質(zhì)量濃度來調(diào)節(jié)納米纖維神經(jīng)組織工程支架的直徑、力學(xué)性能、親疏水性、降解速率和細(xì)胞粘附性中的至少一種。

本發(fā)明的納米纖維神經(jīng)組織工程支架在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域神經(jīng)組織工程中應(yīng)用。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果是：

(1)本發(fā)明采用含有RGD序列的柞蠶絲素蛋白和高分子共聚物聚乳酸-聚己內(nèi)酯(P(LLA-CL))共混，采用靜電紡技術(shù)巧妙地將二者優(yōu)點(diǎn)結(jié)合，得到柞蠶絲素蛋白/聚乳酸-聚己內(nèi)酯復(fù)合納米纖維支架，既能使支架材料具有較高且符合神經(jīng)組織的力學(xué)性能，又能為組織生長提供生物信號，促進(jìn)神經(jīng)細(xì)胞的粘附、增殖和分化。

(2)本發(fā)明以天然材料柞蠶絲素蛋白和生物可降解高聚物聚乳酸-聚己內(nèi)酯共混采用靜電紡絲技術(shù)制備得到物理化學(xué)性能優(yōu)異，生物相容性好的復(fù)合納米纖維神經(jīng)組織工程支架材料。得到的復(fù)合納米纖維直徑，力學(xué)性能，親疏水性，降解速率，細(xì)胞粘附性等可由柞蠶絲素蛋白和聚乳酸-聚己內(nèi)酯的質(zhì)量比及共混溶液的濃度比調(diào)節(jié)。制備的柞蠶絲素蛋白/聚乳酸-聚己內(nèi)酯納米纖維神經(jīng)支架能夠保持柞蠶絲素蛋白的相容性，對人體無毒無害，無免疫原性，同時(shí)，支架材料保持了柞蠶絲素蛋白的RGD序列，能夠促進(jìn)神經(jīng)細(xì)胞對于支架材料的識別，提高了細(xì)胞的粘附性以及材料的靶向性。

(3)本發(fā)明可通過調(diào)節(jié)混紡比例及濃度來控制神經(jīng)組織工程支架的物理化學(xué)性能。同時(shí)制得的納米纖維支架能夠很好地仿生天然細(xì)胞外基質(zhì)的結(jié)構(gòu)、組成及功能，是理想的神經(jīng)組織工程支架。

(4)本發(fā)明制備方法簡單，材料來源豐富，可重復(fù)性好，經(jīng)濟(jì)效益高，為臨床中遇到的神經(jīng)缺損修復(fù)提供了新的實(shí)驗(yàn)思路，同時(shí)適合工業(yè)化批量生產(chǎn)。

附圖說明

圖1紡絲液濃度6％-12％，柞蠶絲素蛋白和聚乳酸-聚己內(nèi)酯質(zhì)量比為50∶50的靜電紡納米纖維支架材料的掃描電鏡照片及直徑分布圖：(a)6％，(b)8％，(c)10％，(d)12％.

圖2紡絲液濃度為10％，不同質(zhì)量比的柞蠶絲素蛋白和聚乳酸-聚己內(nèi)酯靜電紡納米纖維支架材料的掃描電鏡照片及直徑分布圖：(a)100∶0；(b)75∶25；(c)50∶50；(d)25∶75；(e)0∶100.

圖3紡絲液濃度為10％，不同質(zhì)量比的柞蠶絲素蛋白和聚乳酸-聚己內(nèi)酯靜電紡納米纖維支架材料親疏水性能；

圖4雪旺細(xì)胞(SCs)在不同質(zhì)量比的柞蠶絲素蛋白和聚乳酸-聚己內(nèi)酯靜電紡納米纖維支架材料上的增殖情況

圖5雪旺細(xì)胞(SCs)在不同質(zhì)量比的柞蠶絲素蛋白和聚乳酸-聚己內(nèi)酯靜電紡納米纖維支架材料上生長形貌觀察掃描電鏡圖片(a)100∶0；(b)75∶25；(c)：50∶50；(d)25∶75；(e)0∶100；(f)對照組Cover slips(蓋玻片)。

圖6雪旺細(xì)胞(SCs)在不同質(zhì)量比的柞蠶絲素蛋白和聚乳酸-聚己內(nèi)酯靜電紡納米纖維支架材料上生長3天熒光染色圖片(a)100∶0；(b)75∶25；(c)：50∶50；(d)25∶75；(e)0∶100；(f)對照組Cover slips(蓋玻片)。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實(shí)施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。此外應(yīng)理解，在閱讀了本發(fā)明講授的內(nèi)容之后，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以對本發(fā)明作各種改動或修改，這些等價(jià)形式同樣落于本申請所附權(quán)利要求書所限定的范圍。

本發(fā)明各實(shí)施例中所用的聚乳酸-聚己內(nèi)酯為市售產(chǎn)品，其分子量Mn為30萬，其中，乳酸單元和己內(nèi)酯單元的摩爾比為50∶50。

實(shí)施例1

一種納米纖維神經(jīng)組織工程支架的制備方法，具體步驟為：

(1)將柞蠶絲在95～100℃環(huán)境下，置于含5g/L Na₂CO₃的溶液中脫膠3次，每次30min，浴比1∶50。脫膠后得到柞蠶絲素纖維，60℃烘干。將柞蠶絲素纖維按浴比1∶10置于飽和的LiSCN溶液中，50℃±2℃下溶解70min，獲得的柞蠶絲素蛋白溶液裝入截留分子質(zhì)量為8-10KDa的透析袋中，用去離子水透析3d，經(jīng)冷凍干燥得到柞蠶絲素蛋白。

(2)將柞蠶絲素蛋白0.3g和聚乳酸-聚己內(nèi)酯0.3g溶于10ml六氟異丙醇，以200r/min的速率磁力攪拌4h至完全溶解，得到柞蠶絲素蛋白與聚乳酸-聚己內(nèi)酯的總濃度為6％(w/v)的靜電紡絲溶液，進(jìn)行靜電紡絲，用鋁箔平整包纏10x10cm²接收板接收納米纖維，紡絲條件：電壓14千伏，噴絲頭和接收板之間的距離為10cm，紡絲速率1.5ml/h，大約7h后鋁箔上接收到一定厚度的納米纖維膜，取下后放入密閉容器內(nèi)，用體積分?jǐn)?shù)75％的乙醇在溫度為25℃、標(biāo)準(zhǔn)大氣壓的條件下進(jìn)行熏蒸處理24h進(jìn)行交聯(lián)，處理完畢后在溫度為25℃、真空度為-30KPa的條件下真空干燥48h，去除殘留溶劑，得到納米纖維神經(jīng)組織工程支架。用Image J軟件分析納米纖維直徑為180±57m。

實(shí)施例2

一種納米纖維神經(jīng)組織工程支架的制備方法，具體步驟為：

(1)將柞蠶絲在95～100℃環(huán)境下，置于含5g/L Na₂CO₃的溶液中脫膠3次，每次30min，浴比1∶50。脫膠后得到柞蠶絲素纖維，60℃烘干。將柞蠶絲素纖維按浴比1∶10置于飽和的LiSCN溶液中，50℃±2℃下溶解70min，獲得的柞蠶絲素蛋白溶液裝入截留分子質(zhì)量為8-10KDa的透析袋中，用去離子水透析3d，經(jīng)冷凍干燥得到柞蠶絲素蛋白。

(2)將柞蠶絲素蛋白0.4g和聚乳酸-聚己內(nèi)酯0.4g溶于10ml六氟異丙醇，以200r/min的速率磁力攪拌4h至完全溶解，得到柞蠶絲素蛋白與聚乳酸-聚己內(nèi)酯的總濃度為8％(w/v)的靜電紡絲溶液，進(jìn)行靜電紡絲，用鋁箔平整包纏10x10cm²接收板接收納米纖維，紡絲條件：電壓14千伏，噴絲頭和接收板之間的距離為10cm，紡絲速率1.5ml/h，大約7h后鋁箔上接收到一定厚度的納米纖維膜，取下后放入密閉容器內(nèi)，用體積分?jǐn)?shù)75％的乙醇在溫度為25℃、25℃、標(biāo)準(zhǔn)大氣壓的條件下進(jìn)行熏蒸處理24h進(jìn)行交聯(lián)，處理完畢后溫度為25℃、真空度為-30KPa的條件下真空干燥48h，去除殘留溶劑，得到納米纖維神經(jīng)組織工程支架。用Image J軟件分析納米纖維直徑為247±39nm。

實(shí)施例3

一種納米纖維神經(jīng)組織工程支架的制備方法，具體步驟為：

(1)將柞蠶絲在95～100℃環(huán)境下，置于含5g/L Na₂CO₃的溶液中脫膠3次，每次30min，浴比1∶50。脫膠后得到柞蠶絲素纖維，60℃烘干。將柞蠶絲素纖維按浴比1∶10置于飽和的LiSCN溶液中，50℃±2℃下溶解70min，獲得的柞蠶絲素蛋白溶液裝入截留分子質(zhì)量為8-10KDa的透析袋中，用去離子水透析3d，經(jīng)冷凍干燥得到柞蠶絲素蛋白。

(2)將柞蠶絲素蛋白0.5g和聚乳酸-聚己內(nèi)酯0.5g溶于10ml六氟異丙醇，以200r/min的速率磁力攪拌4h至完全溶解，得到柞蠶絲素蛋白與聚乳酸-聚己內(nèi)酯的總濃度為10％(w/v)的靜電紡絲溶液，進(jìn)行靜電紡絲，用鋁箔平整包纏10x10cm²接收板接收納米纖維，紡絲條件：電壓14千伏，噴絲頭和接收板之間的距離為10cm，紡絲速率1.5ml/h，大約7h后鋁箔上接收到一定厚度的納米纖維膜，取下后放入密閉容器內(nèi)，用體積分?jǐn)?shù)75％的乙醇在溫度為25℃、標(biāo)準(zhǔn)大氣壓的條件下的條件下進(jìn)行熏蒸處理24h進(jìn)行交聯(lián)，處理完畢后溫度為25℃、真空度為-30KPa的條件下真空干燥48h，去除殘留溶劑，得到納米纖維神經(jīng)組織工程支架。用Image J軟件分析納米纖維直徑為539±90nm。

實(shí)施例4

一種納米纖維神經(jīng)組織工程支架的制備方法，具體步驟為：

(1)將柞蠶絲在95～100℃環(huán)境下，置于含5g/L Na₂CO₃的溶液中脫膠3次，每次30min，浴比1∶50。脫膠后得到柞蠶絲素纖維，60℃烘干。將柞蠶絲素纖維按浴比1∶10置于飽和的LiSCN溶液中，50℃±2℃下溶解70min，獲得的柞蠶絲素蛋白溶液裝入截留分子質(zhì)量為8-10KDa的透析袋中，用去離子水透析3d，經(jīng)冷凍干燥得到柞蠶絲素蛋白。

(2)將柞蠶絲素蛋白0.6g和聚乳酸-聚己內(nèi)酯0.6g溶于10ml六氟異丙醇，以200r/min的速率磁力攪拌4h至完全溶解，得到柞蠶絲素蛋白與聚乳酸-聚己內(nèi)酯的總濃度為12％(w/v)的靜電紡絲溶液，進(jìn)行靜電紡絲，用鋁箔平整包纏10x10cm²接收板接收納米纖維，紡絲條件：電壓14千伏，噴絲頭和接收板之間的距離為10cm，紡絲速率1.5ml/h，大約7h后鋁箔上接收到一定厚度的納米纖維膜，取下后放入密閉容器內(nèi)，用體積分?jǐn)?shù)75％的乙醇在在溫度為25℃、標(biāo)準(zhǔn)大氣壓的條件下的條件下進(jìn)行熏蒸處理24h進(jìn)行交聯(lián)，處理完畢后溫度為25℃、真空度為-30KPa的條件下真空干燥48h，去除殘留溶劑，得到納米纖維神經(jīng)組織工程支架。用Image J軟件分析納米纖維直徑為838±147nm。

實(shí)施例5

一種納米纖維神經(jīng)組織工程支架的制備方法，具體步驟為：

(1)將柞蠶絲在95～100℃環(huán)境下，置于含5g/L Na₂CO₃的溶液中脫膠3次，每次30min，浴比1∶50。脫膠后得到柞蠶絲素纖維，60℃烘干。將柞蠶絲素纖維按浴比1∶10置于飽和的LiSCN溶液中，50℃±2℃下溶解70min，獲得的柞蠶絲素蛋白溶液裝入截留分子質(zhì)量為8-10KDa的透析袋中，用去離子水透析3d，經(jīng)冷凍干燥得到柞蠶絲素蛋白。

(2)將柞蠶絲素蛋白0.25g和聚乳酸-聚己內(nèi)酯0.75g溶于10ml六氟異丙醇，以200r/min的速率磁力攪拌4h至完全溶解，得到柞蠶絲素蛋白與聚乳酸-聚己內(nèi)酯的總濃度為10％(w/v)的靜電紡絲溶液，進(jìn)行靜電紡絲，用鋁箔平整包纏10x10cm²接收板接收納米纖維，紡絲條件：電壓14千伏，噴絲頭和接收板之間的距離10cm，紡絲速率1.5ml/h，大約7h后鋁箔上接收到一定厚度的納米纖維膜。取下后放入密閉容器內(nèi)，用體積分?jǐn)?shù)75％的乙醇在溫度為25℃、標(biāo)準(zhǔn)大氣壓的條件下的條件下進(jìn)行熏蒸處理24h進(jìn)行交聯(lián)，處理完畢后溫度為25℃、真空度為-30KPa的條件下真空干燥48h，去除殘留溶劑，得到納米纖維神經(jīng)組織工程支架。用Image J軟件分析納米纖維直徑為399±83nm。

實(shí)施例6

一種納米纖維神經(jīng)組織工程支架的制備方法，具體步驟為：

(1)將柞蠶絲在95～100℃環(huán)境下，置于含5g/L Na₂CO₃的溶液中脫膠3次，每次30min，浴比1∶50。脫膠后得到柞蠶絲素纖維，60℃烘干。將柞蠶絲素纖維按浴比1∶10置于飽和的LiSCN溶液中，50℃±2℃下溶解70min，獲得的柞蠶絲素蛋白溶液裝入截留分子質(zhì)量為8-10KDa的透析袋中，用去離子水透析3d，經(jīng)冷凍干燥得到柞蠶絲素蛋白。

(2)將柞蠶絲素蛋白0.75g和聚乳酸-聚己內(nèi)酯0.25g溶于10ml六氟異丙醇，以200r/min的速率磁力攪拌4h至完全溶解，得到柞蠶絲素蛋白與聚乳酸-聚己內(nèi)酯的總濃度為10％(w/v)的靜電紡絲溶液，進(jìn)行靜電紡絲，用鋁箔平整包纏10x10cm²接收板接收納米纖維，紡絲條件：電壓14千伏；噴絲頭和接收板之間的距離10cm，紡絲速率1.5ml/h，大約7h后鋁箔上接收到一定厚度的納米纖維膜。取下后放入密閉容器內(nèi)，用體積分?jǐn)?shù)75％的乙醇在溫度為25℃、標(biāo)準(zhǔn)大氣壓的條件下的條件下進(jìn)行熏蒸處理24h進(jìn)行交聯(lián)，處理完畢后溫度為25℃、真空度為-30KPa的條件下真空干燥48h，去除殘留溶劑，得到納米纖維神經(jīng)組織工程支架。用Image J軟件分析納米纖維直徑為514±102nm。

實(shí)施例7

類似于實(shí)施例6，區(qū)別在于：所述步驟(2)中，柞蠶絲素蛋白的用量為1g，聚乳酸-聚己內(nèi)酯的用量為0g。

對比例1

類似于實(shí)施例6，區(qū)別在于：所述步驟(2)中，柞蠶絲素蛋白的用量為0g，聚乳酸-聚己內(nèi)酯的用量為1g。

實(shí)施例1-4中的納米纖維神經(jīng)組織工程支架的掃描電鏡照片及直徑分布如圖1所示。實(shí)施例3，5-7和對比例1中的納米纖維神經(jīng)組織工程支架的掃描電鏡照片及直徑分布如圖2所示。

實(shí)施例3，5-7和對比例1中的納米纖維神經(jīng)組織工程支架的親疏水性如圖3所示，采用接觸角測試儀進(jìn)行測試，其結(jié)果表明，實(shí)施例3，5-7和對比例1相比親水性降低，疏水性增加，且親水性隨著P(LLA-CL)含量的增加而降低。

神經(jīng)雪旺細(xì)胞接種于實(shí)施例3，5-7和對比例1中的納米纖維神經(jīng)組織工程支架及蓋玻片上，即利用24孔打孔器進(jìn)行各樣品的準(zhǔn)備，每種樣品在特定時(shí)間點(diǎn)準(zhǔn)備3個(gè)平行樣，將各樣品置于24孔培養(yǎng)板中，以蓋玻片作為對照樣，將各板置于體積分?jǐn)?shù)為75％的酒精蒸汽缸中進(jìn)行滅菌處理2h后置于超凈工作臺備用，利用PBS依次清洗支架以及空白培養(yǎng)板3次，以此除去未揮發(fā)的酒精蒸汽。雪旺細(xì)胞的種植密度為每孔1×10⁴個(gè)，再將配好的DMEM培養(yǎng)基(89％DMEM，10％胎牛血清，1％雙抗)依次加入各孔中，放入37℃和5％CO₂的培養(yǎng)箱內(nèi)孵育，以上操作步驟均在超凈臺內(nèi)完成。在培養(yǎng)基中培養(yǎng)1，3，5和7天后的細(xì)胞活力如圖4所示。細(xì)胞活力采用MTT測試法表征，其結(jié)果表明相比于蓋玻片和對比例，實(shí)施例3，5-7中的樣品更有利于細(xì)胞的增殖，且實(shí)施例5增殖更顯著。

神經(jīng)雪旺細(xì)胞接種于實(shí)施例3，5-7和對比例1中的納米纖維神經(jīng)組織工程支架及蓋玻片上，利用24孔打孔器進(jìn)行各樣品的準(zhǔn)備，將各樣品置于24孔培養(yǎng)板中，以蓋玻片作為對照樣，將各板置于體積分?jǐn)?shù)為75％的酒精蒸汽缸中進(jìn)行滅菌處理2h后置于超凈工作臺備用，利用PBS依次清洗支架以及空白培養(yǎng)板3次，以此除去未揮發(fā)的酒精蒸汽。雪旺細(xì)胞的種植密度為每孔8×10³個(gè)，再將配好的DMEM培養(yǎng)基(89％DMEM，10％胎牛血清，1％雙抗)依次加入各孔中，放入37℃和5％CO₂的培養(yǎng)箱內(nèi)孵育，以上操作步驟均在超凈臺內(nèi)完成。培養(yǎng)3天后，進(jìn)行酒精脫水處理，干燥后用于電鏡的拍攝，在培養(yǎng)基中培養(yǎng)3天后細(xì)胞的生長狀態(tài)如圖5所示。

神經(jīng)雪旺細(xì)胞接種于實(shí)施例3，5-7和對比例1中的納米纖維神經(jīng)組織工程支架及蓋玻片上，利用24孔打孔器進(jìn)行各樣品的準(zhǔn)備，將各樣品置于24孔培養(yǎng)板中，以蓋玻片作為對照樣，將各板置于體積分?jǐn)?shù)為75％的酒精蒸汽缸中進(jìn)行滅菌處理2h后置于超凈工作臺備用，利用PBS依次清洗支架以及空白培養(yǎng)板3次，以此除去未揮發(fā)的酒精蒸汽。雪旺細(xì)胞的種植密度為每孔8×10³個(gè)，再將配好的DMEM培養(yǎng)基(89％DMEM，10％胎牛血清，1％雙抗)依次加入各孔中，放入37℃和5％CO₂的培養(yǎng)箱內(nèi)孵育，以上操作步驟均在超凈臺內(nèi)完成。培養(yǎng)3天后進(jìn)行羅丹和4′，6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)染料染色，其結(jié)果如圖6所示，表明相比于蓋玻片和對比例，實(shí)施例3，5-7中的樣品更有利于細(xì)胞粘附鋪展，細(xì)胞形貌較好，且實(shí)施例5所述樣品更顯著。