使用質譜檢測至少一種碳青霉烯抗性機制的方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及通過質譜檢測樣品中至少一種微生物針對至少一種抗菌劑的至少一種抗性標記的方法，其特征在于抗菌劑是碳青霉烯，且所述抗性標記是蛋白質或肽。優(yōu)選地，所述蛋白質或肽是來自所述微生物的蛋白質。
【專利說明】使用質譜檢測至少一種碳青霉烯抗性機制的方法
[0001]本發(fā)明涉及微生物學領域。更精確地說，本發(fā)明涉及用質譜檢測樣品中至少一種微生物對碳青霉烯抗性的至少一種機制的方法。
[0002]自從巴斯德發(fā)現(xiàn)了微生物以來，微生物體以顯微鏡和生化分析來研究。這些傳統(tǒng)的方法通常冗長乏味，因此很久以來一直在尋找其他分析方法。這就是為什么J.Anhalt和C.Fenselau從1975年起發(fā)起了以質譜分析細菌[I]。
[0003]隨著這一初步工作，氣相色譜與質譜聯(lián)用的方法被用于微生物細胞壁中脂肪酸的研究[2]。這項技術廣泛采用的英語術語是FAME,即脂肪酸甲酯(Fatty Acid MethylEster) 0現(xiàn)在成為一種分類學研究的參考方法。盡管如此，它的應用局限于某些特定的以皂化、水解和分離的方法處理樣品的實驗室。
[0004]在1996 年，M.Claydon 等[3]以及 T.Krishnamurthy 和 P.Ross [4]的工作證明可以用MALD1-T0F(矩陣輔助的激光解吸離子化-渡越時間，Matrix Assisted LaserDesorption 1nization - Time Of Flight)質譜鑒別不同的細菌種。該分析結合了獲取質譜和解釋專業(yè)軟件。十分簡單并且可以在幾分鐘內得出結果。盡管如此，現(xiàn)在還只是應用在藥物分析的實驗室[5]。其臨床應用現(xiàn)在還局限于鑒別細菌和酵母的種類，還沒有常規(guī)應用于鑒別抗菌劑抗性。
[0005]為了保證最優(yōu)化的病患護理，對諸如抗生素等抗菌劑的抗性的鑒別是重要的要素。
[0006]推薦其他質譜方法，特別是串聯(lián)質譜，以滿足這些需要。例如，可以引用C.Fenselau等關于用四極子-TOF(Q-TOF)鑒別β -內酰胺酶的工作[6]。
[0007]盡管如此，這些研究結果是通過通過研究儀器獲得的，要求高素質的人員，無法應用于日常臨床。通常大于I小時/樣品的分析時間與微生物分析實驗室的工作量是不相容的。
[0008]最近，S.Hofstadler等[7]提出了一種結合PCR擴增微生物基因組和電噴射-TOF(ES1-TOF)檢測PCR產物的方法。這種方法現(xiàn)在是全自動的[8]。盡管如此，它要求PCR擴增，其具有分子生物學固有的瑕疵，即提取產量，探針成本等問題。
[0009]在這一背景下，本發(fā)明的目的在于提出一種檢測碳青霉烯抗性機制的方法，以克服現(xiàn)有技術的不足，也就是提供一種廉價的方法，特別是與分子生物學相比，不使用每個種特異的試劑，在短時間內(少于I小時)得出結果，不要求高素質人員而能夠應用于日常臨床。
[0010]為了這個目的，本發(fā)明提出了一種通過質譜檢測樣品中至少一種微生物對至少一種抗菌劑的至少一種抗性機制的新方法，其特征在于:抗菌劑是碳青霉烯；以及檢測針對至少一類碳青霉烯抗生素的所述抗性機制的標記是蛋白質和/或多肽。
[0011]優(yōu)選地，抗性標記是來自于所述至少一種微生物的蛋白質。有利的是，幾種不同抗菌劑的抗性標記可以同時檢測。
[0012]如PCT/FR2010/052181中所示，在檢測抗性機制標記之前或同時，所述微生物的類型和/或毒力標記能夠通過質譜以相同的方法檢測。[0013]至少一種碳青霉烯類抗菌劑的抗性標記理解為以所述性質為特征的蛋白質來源的分子。碳青霉烯是屬于β_內酰胺家族的抗生素，其主要代表是亞胺培南、美羅培南、厄他培南和多利培南。這些分子被Bush和Jacoby分類的β -內酰胺酶2df、2f和3a分解([9], Antimicrobial Agents and Chemotherapy, 2010 ；54 (3):969-976)。
[0014]確定對至少一種抗菌劑的抗性理解為確定微生物被抗菌劑殺死的敏感性。當科和種不同時抗性機制涉及的蛋白也將不同。
[0015]β -內酰胺酶一β -內酰胺抗性細菌酶一的命名法未標準化。既根據(jù)一級結構分為四類(Α到D)，也按照靶底物和對抑制劑的抗性功能性分組(作為概述，見前述Bushand Jacoby[9]) 0對分子分類，測序技術使更精確的分類成為可能:例如，已經(jīng)描述了 TEM蛋白的183種變體(標記為TEM-1, i從I到183)。對于功能性分類,前述Bush and Jacoby提出了新的功能性亞組:
[0016]-第一組酶是屬于C類分子的頭孢菌素酶。CMY和FOX是質粒攜帶的酶，屬于這個亞組。
[0017]-第二組酶屬于A類和D類分子。這個組自我再分為亞組2b、2be、2br、2ber、2d、2de、2df、2f等。CTX-M(2be)和TEM(包括2be、2br)是屬于這個亞組的酶。2b亞組對應被克拉維酸、sulfobactam或三唑巴坦抑制的廣譜的β_內酰胺酶。2be亞組對應同樣也被克拉維酸、sulfobactam或三唑巴坦抑制的超廣譜的β -內酰胺酶(ESBL)。2br亞組對應2b亞組中對克拉維酸、sulfobactam或三唑巴坦的抑制不敏感的β_內酰胺酶。2bf亞組包括對碳青霉烯超廣譜的0ΧΑ。2f組對應碳青霉烯酶β -內酰胺酶，例如KPC。
[0018]-第三組包含水解碳青霉烯的金屬-β-內酰胺酶，例如MP、VIM, SPM、GIM, SM、AM、KHM、D頂或 NDM。
[0019]NDM-1 β -內酸胺酶于 2010 年被描述(Kumarasamy et al., 2010, Lancet Infect.Dis.，10:597-602)。相當于一種金屬-β -內酰胺酶，賦予對除氨曲南外所有β _內酰胺的抗性。
[0020]KPCP -內酰胺酶于 2001 年在美國被描述(Yigit et al., 2001, Antimicrobi0.Agents Chemother.，45:1151-1161),隨后遍及世界。相當于A類β -內酰胺酶,賦予對頭
孢菌素和碳青霉烯的抗性，尤其是對亞胺培南和美羅培南。
[0021]IMP β -內酸胺酶于 1994 年在日本被描述(Osano et al., 1994, Antimicrobi0.Agents Chemother.，38:71-78),隨后遍及世界。相當于金屬-β -內酰胺酶,賦予對頭孢菌素和碳青霉烯的抗性，但是對替莫西林和氨曲南無效。
[0022]VIM β -內酰胺酶與1999年在歐洲被描述(Lauretti etal., 1999, Antimicrobi0.Agents Chemother., 43:1584-1590)，隨后遍及世界。相當于金屬-β -內酰胺酶，賦予對頭孢菌素和碳青霉烯的抗性，但是對氨曲南無效。
[0023]第一個GES β -內酰胺酶與1998年在法屬圭亞那被分離(Poirel etal., 2000, Antimicrobi0.Agents Chemother.，43:622-632)。這種酶(GES-1)賦予 ESBL抗性。從耐受GESi1-內酰胺酶的細菌的第二次分離于2000年在南非完成(Poirel etal., 2001, Antimicrobi0.Agents Chemother.，45:2598-2603)。這種酶(GES-2)賦予對諸如亞胺培南的頭孢菌素和碳青霉烯的抗性。
[0024]INDP -內酰胺酶首次描述于 1999 年(Bellais et al.，1999，F(xiàn)EMS Microbi0.Lett., 171:127-132)。相當于金屬-β-內酰胺酶，賦予對頭孢菌素和碳青霉烯的抗性。
[0025]SME β -內酸胺酶首次描述于 1994 年(Naas et al., 1994, Antimicrobi0.AgentsChemother.，38:1262-1270)。相當于A類β -內酰胺酶,賦予對頭孢菌素和碳青霉烯的抗性。
[0026]OXAβ -內酰胺酶(或oxacillinases)對應D類β -內酰胺酶。根據(jù)其的初級序列，其能夠賦予對頭孢菌素或對頭孢菌素和碳青霉烯的抗性(Poirel etal., 2010, Antimicrobi0.Agents Chemother., 54:24-38)。
[0027]本發(fā)明的方法可以用于檢測細菌中對于碳青霉烯的抗性機制。因此，例如，可以根據(jù)本發(fā)明的方法在其中找到對碳青霉烯的抗性機制的細菌的非窮舉性實例有:大腸桿菌(Escherichia coli)、肺炎克雷伯菌(Klebsiella pneumoniae)、綠膿假單胞菌(Pseudomonas aeruginosa)、鮑氏不動桿菌(Acinetobacter baumannii)、芽抱桿菌(Bacillus spp)、嗜麥芽寡養(yǎng)單胞菌(Stenotrophomonas maltophilia)、氣單胞菌(Aeromonas spp)、脆弱擬桿菌(Bacteroides fragilis)、假單胞菌(Pseudomonasotitidis)以及陰溝腸桿菌(Enterobacter cloacae),更廣泛地說，攜帶blaNDM-Ι或blaKPC抗性基因的腸桿菌科(Enterobacteriaceae)微生物。應該進一步注意的是已知抗碳青霉烯的菌株也對頭孢菌素和青霉素有抗性。
[0028]因此，根據(jù)本發(fā)明的方法也使檢測對所述抗生素的抗性機制成為可能。
[0029]本發(fā)明的方法可以應用的樣品是任何容許含有靶微生物的樣品。樣品可以是生物學來源的，無論是動物，蔬菜還是人。在這個實施方式中，相當于生物流體樣品(例如全血、血清、血漿、尿液、腦脊液、組織分泌物)、組織樣品或者分離的細胞。在細菌β -內酰胺抗性機制的標記能夠用于檢測或者在分析前可以進行富集、提取、濃縮、純化、培養(yǎng)等根據(jù)本領域技術人員已知的方法制備的樣品可以使用。
[0030]樣品可以是工業(yè)來源或者根據(jù)非窮舉的列表可以是空氣樣品、水樣品、表面樣品、制成品的一部分或者食物產品。在食物樣品中，簡單來說，可以包括乳制品(酸奶、奶酪)樣品、肉、魚、蛋、水果、蔬菜、水、飲料(牛奶、果汁、蘇打水等)。這些食物樣品還可以來自醬或即食餐。最后，食物樣品可以來自動物飼料，例如動物膳食。
[0031]在質譜檢測的上游，優(yōu)選地，待分析的樣品經(jīng)過預處理使樣品中存在的完整蛋白質片段化而產生多肽，例如用蛋白酶消化或化學試劑反應。事實上，裂解蛋白質可以通過物理化學、生物學或者兩者結合處理來實現(xiàn)。在可用的處理中，可以提及以羥自由基處理，特別是H2O2。羥自由基處理導致肽鍵的切開在任何蛋白質的肽鍵位置隨機發(fā)生。羥自由基濃度決定裂解數(shù)，以及所得到的肽段的長度。還可以用其他化學處理，例如特異性在甲硫氨酰殘基羧基處切開肽鍵的溴化氰(CNBr)處理。也可以在三氟乙酸中加熱蛋白質溶液到1000°C進行天冬氨酰殘基上的部分酸裂解。
[0032]盡管如此，酶解處理蛋白優(yōu)先于物理化學處理，因為其更能保護蛋白結構并且更易控制?！懊附狻币馕吨粋€或者多個酶在正確的條件下單獨或聯(lián)合的反應。實施蛋白水解的酶，即蛋白酶在特定位置切割蛋白。每種蛋白酶一般識別一種氨基酸序列，并總是進行同樣的切割。某些蛋白酶識別一個氨基酸或兩個氨基酸的序列并在其間裂解，而其他蛋白酶只識別更長的序列。這些蛋白酶可以是內切蛋白酶或外切蛋白酶。在已知的蛋白酶中，包括如在W02005/098071中描述的:[0033]-特異性酶,例如胰蛋白酶(trypsin)在Arg和Lys的羧基處切斷肽鍵,細胞內溶素(endolysin)在賴氨酸羰基處裂解肽鍵,糜蛋白酶(chymotrypsin)在芳香殘基(Phe、Tyr和Trp)羧基處水解肽鍵，胃蛋白酶(pepsin)在芳香殘基(Phe、Tyr和Trp)氨基處切割,來源于Staphylococcus aureus V8菌株的蛋白酶V8在Glu殘基羧基處裂解肽鍵；
[0034]-非特異性酶，例如來自細菌Bacillusthermoproteolyticus的嗜熱菌蛋白酶(thermolysin)在疏水氨基酸(Xaa_The、Xaa-1Ie> Xaa-Phe)氨基端水解肽鍵，屬于細菌蛋白酶的枯草桿菌蛋白酶(subtilisin)和鏈霉蛋白酶(pronase)實際上水解所有肽鍵并能在控制的反應條件(酶濃度和反應時間)下把蛋白轉化成寡肽。
[0035]如果反應模式可以兼容，有些蛋白酶可以同時或相繼使用。在本發(fā)明范圍內，樣品的消化優(yōu)選的由蛋白酶執(zhí)行，例如胰蛋白酶。
[0036]用化學試劑或蛋白酶產生多肽能通過溶液中簡單反應的方法實現(xiàn)。還可以通過微波爐[10]或高壓[11]，甚至使用超聲儀器[12]實現(xiàn)。在后面的三個實施方式中，方案快了很多。
[0037]在如此獲得的多肽中，蛋白特異性的多肽被稱為蛋白質代表性(proteotypic)肽，也就是將要被質譜分析的。
[0038]根據(jù)本發(fā)明細菌對碳青霉烯的抗性機制標記是來自可以在其中找到抗碳青霉烯機制的細菌的蛋白。尤其是，所述蛋白被優(yōu)選地使用酶，更優(yōu)選地使用胰蛋白酶消化成多肽。
[0039]相似的是，含有細菌抗碳青霉烯機制特征性蛋白標記的樣品可以預處理以達到純化的目的。純化預處理可以在如上所述的多肽產生步驟之前或之后進行。
[0040]樣品純化處理在本領域技術人員中是眾所周知的，尤其是采用離心、過濾、電泳或層析技術。這些分離技術可以單獨使用或者彼此聯(lián)用以獲得多維的分離。例如，多維層析可以如T.Fortin等[13]或H.Keshishian等[14]所述,通過離子交換層析和反相層析的聯(lián)用來實現(xiàn)。在這些文章中，層析介質可以是柱或者筒(固相萃取)。蛋白質代表性肽的電泳或層析級份(或一維或多維層析的保留時間)是每種肽的特征，因此采用這些技術使選擇蛋白質代表性肽或多肽進行分析成為可能。這樣區(qū)別產生的多肽可以增加后續(xù)質譜分析的特異性。
[0041]目的在于分離多肽的電泳或層析技術的一個變形在于特異性純化N-糖肽([15]以及專利申請W02008/066629)。盡管如此，這樣的純化只可以定量進行了 N-糖基化的翻譯后修飾的多肽。不是所有的蛋白都會糖基化，這限制了其應用。
[0042]作為分析和檢測不同類型分子的有力工具，用于本發(fā)明方法的質譜是本領域技術人員所共知的。一般來說，任何可以被電離的分子都可以根據(jù)其分子量由質譜儀檢測。根據(jù)被測分子的自然狀態(tài)，無論蛋白還是代謝源，某些質譜技術會更合適。然而，無論用質譜方法檢測什么，后面都包括把靶分子電離為所謂分子離子的步驟，即本實施方式中，電離特征標記的步驟和分離質譜獲得的分子離子的步驟。
[0043]因此，所有的質譜包含:
[0044]-用于電離待分析樣品中存在的標記的電離源，即給予這些標記正或負電荷；
[0045]-用于根據(jù)其荷質比分離電離標記或分子離子質量分析儀；
[0046]-用于測量分子離子直接產生的信號或以后述方法自分子離子產生的離子的檢測儀。
[0047]電離步驟(采用質譜所必需的)可以通過任何本領域技術人員已知的方法進行。電離源可以使待分析分子轉化成氣態(tài)的并且電離的狀態(tài)。電離源可以用正電荷模式研究陽離子，或者負電荷模式研究陰離子。存在幾種類型的電離源，可基于要尋找的結果和要分析的分子使用這些電離源。尤其是包括:
[0048]-電子電離(EI)、化學電離(Cl)和解吸化學電離(DCI)；
[0049]-快原子轟擊(FAB)、亞穩(wěn)態(tài)原子轟擊(MAB)或離子轟擊(SMS，LSMS)；
[0050]-電感耦合等離子體(ICP)；
[0051]-大氣壓化學電離(APCI)和大氣壓光電離(APPI)；
[0052]-Electronebulisation 或點噴射(ESI)；
[0053]-矩陣輔助激光解吸/電離(MALDI)、表面活化激光解吸/電離(SELDI)或硅解吸/ 電離(DIOS)；
[0054]-與亞穩(wěn)態(tài)種相互作用的電離/解吸(DART)。
[0055]具體而言，電離進行如下:把含有靶分子的樣品導入電離源，在此分子在氣態(tài)下被離子化并轉化成對應最初分子的分子離子。電噴射電離(ESI)源可以通過使分子從液態(tài)逐漸變氣態(tài)而電離。在正電荷模式中，如此得到的存在于液相中的對應于分子的有1、2甚至3或者更多的額外質子的分子離子帶有1、2甚至3或者更多的電荷。例如，當靶分子是一種蛋白，分離靶蛋白后獲得的蛋白質代表性肽使用電噴射源在正電荷模式的電離產生氣相的帶1、2甚至3或者更多的額外質子多肽離子，其帶有1、2甚至3或者更多的電荷，并可以從液相移動到氣相[16]。這類源尤其適合先用反相液相色譜分離獲得的靶分子或蛋白質代表性肽。然而，樣品中存在的分子的電離得率(ionisation yield)會隨著濃度和存在的不同物種的天然狀態(tài)而改變。這一現(xiàn)象導致了本領域技術人員所周知的矩陣效應。
[0056]MALDI電離源可以使來自固態(tài)樣品的分子電離。
[0057]根據(jù)荷質比分離離子化標記的步驟在質量分析器中進行，本領域技術人員公知的任何質量分析器都適用。其可以由低分辨率分析器、四極子(quadripole或quadrupole (Q))、3D 離子陷講(iron trap, IT)或線性離子陷講(linear iron trap、LIT)也稱離子陷阱、高分辨率分析器組成，高分辨率分析器使其可以測量被分析物的確切質量，并且特別使用了連接于扇形電場的扇形磁場、渡越時間(TOF)、傅里葉變換離子回旋加速(FT-1CR)、軌道阱。
[0058]依靠其荷質比的分子離子的分離可以只進行一次(單質譜或MS)，或者可以進行幾次連續(xù)的分離。當執(zhí)行了兩次連續(xù)的MS分離時，該分析被稱為MS/MS或MS2。當執(zhí)行了三次連續(xù)的MS分離時，該分析被稱為MS/MS/MS或MS3，一般地說，當執(zhí)行了 η次連續(xù)的MS分尚時，該分析被稱為MSn。
[0059]在使用了幾次連續(xù)的分離的技術之中，檢測或分析單一靶分子的選擇反應監(jiān)測(Selected Reaction Monitoring, SRM)模式,或者檢測或分析數(shù)種祀分子的多反應監(jiān)測(Multiple Reaction Monitoring, MRM)模式是MS2分離的具體應用。近似地,MRM3模式是MS/MS/MS分離的具體應用。這就稱為靶向質譜。
[0060]在單MS模式檢測的情況下，所得到的的分子離子的荷質比與待檢測的分子有關。在MS/MS模式檢測的情況下，與MS分析相比，基本上要添加兩步:[0061]-分子離子(后稱為前體離子，precursorions)的破碎，以產生所謂第一代碎片離子(fragment ions),以及
[0062]-根據(jù)其與前體離子荷質比(m/z)相應的質量(m/z)2、比例(m/zh分離所謂的第一代碎片離子。
[0063]因此，這樣獲得的第一代碎片離子的荷質比與待測的靶分子有關。第一代碎片離子是來源于前體離子，經(jīng)過破碎步驟，并且其荷質比m/z不同于前體離子的一種離子。
[0064](111/2)2和(m/zh對被稱為轉換(transitions),代表待測的典型離子。
[0065]待測的與靶分子有關的典型離子的選擇是由本領域技術人員根據(jù)標注方法進行的。在再現(xiàn)性和可靠性方面，其選擇有利于帶來最敏感、最特異以及最有魯棒性的實驗可能性。在所發(fā)展的用于選擇蛋白質代表性肽(m/z) i的方法中，選擇基本上是基于響應強度的。更具體地說，可以參考V.Fusaro et al.[17]。本領域技術人員使用諸如來自AppliedBiosystems或MRMaid的MIDAS和MRM Pilot軟件[18]的市場上可以買到的軟件可以預測所有可能的轉換對。還可以使用F Desiere et al.[19]構建的稱為PeptideAtlas的數(shù)據(jù)庫編輯科學界所描述的所有肽的MRM轉換。P印tideAtlas數(shù)據(jù)庫可以在因特網(wǎng)上免費使用。對于非蛋白質分子，也可以使用數(shù)據(jù)庫，例如可通過Applied Biosystems公司(美國)的Cliquid軟件進入的數(shù)據(jù)庫。
[0066]—種選擇蛋白質代表性肽的(m/z)2和(HiA)1的替換方法在于使用在其他研究中得到的MS/MS破碎光譜。例如，該研究可以是蛋白質組分析發(fā)現(xiàn)和堅定生物標記的各階段。這一方法是由Thermo Scientific在用戶會議中提出的[18]。這使得從通過SIEVE軟件(Thermo Scientific )檢測而鑒定的肽產生候選轉換清單成為可能。J.Mead等[18]詳細說明了選擇離子的(111/2)2和(m/zh確定標準如下:
[0067]-必須避免有內部裂解位點的肽，即內部有賴氨酸和精氨酸的肽，除非賴氨酸或精氨酸后是脯氨酸；
[0068]-必須避免有天冬酰胺或谷氨酰胺的肽，因為會脫氨基；
[0069]-必須避免N端有谷氨酰胺或谷氨酸的肽，因為會自發(fā)環(huán)化；
[0070]-必須避免有甲硫氨酸的肽，因為會被氧化；
[0071]-必須避免有半胱氨酸的肽，因為會在潛在的變性、還原和封閉硫醇功能的步驟中被不可逆轉的修飾；
[0072]-有脯氨酸的肽被認為是有利的，因為會產生在MS/MS中非常強烈單峰的集中片段。然而，非常強烈的單峰片段并不能證實復雜混合物中轉換的同一性。事實上，只有同時出現(xiàn)幾個特征碎片才可以證明所找的前體離子確實被檢測到；
[0073]-必須避免在臨近C端的位置(位置η-1)或相對于C端的第二位(位置n_2)為脯氨酸的肽，因為在這種情況下一般認為第一代肽片段太小而不具備充分特異性；
[0074]-優(yōu)選地選擇比前體(m/z)!更大的片段以增強特異性。為了這一目的，必須選擇雙電荷前體離子和最集中的(m/z) i大于前體的第一代離子片段，即單電荷第一代碎片離子。
[0075]對所選的前體離子的破碎是在破碎單元中進行的，例如三連四極子模型、離子陷阱模型或渡越時間模型，這些也能分離離子。破碎的進行照例是在電場中與惰性氣體(例如IS氣和氮氣)碰撞，用強光源進行光激發(fā)或者光分解，與電子或放射物碰撞，應用潛在的差異(例如在渡越時間管中)，或者其他的活化模式。電場的性質決定了破碎的強度和性質。因此，在由惰性氣體存在時應用的電場，例如在四極子中，決定了提供給離子的碰撞能。本領域技術人員將優(yōu)化碰撞能以提高待測的轉換的敏感性。舉例來說，在ABSCIEX OTRAP.K,: 5500質譜(Applied Biosystems公司，美國福斯特城)的q2中，可以于5到ISOe-V之間改變碰撞能。相似地，本領域技術人員將優(yōu)化碰撞步驟的持續(xù)時間和激發(fā)能(例如在離子陷阱中)以進行最敏感的實驗。舉例來說，在AB SCIEX QTRAP(R) 5500質譜(Applied Biosystems公司)的Q3中，持續(xù)時間(稱為激發(fā)時間)在0.010到50ms之間，激發(fā)能在O到I (任意單位)之間可以進行改變。
[0076]最后，在常規(guī)儀器中檢測所選典型離子，特別是使用探測器和處理系統(tǒng)的方法。探測器收集離子并產生電信號，其強度取決于收集的離子的數(shù)量。得到的信號隨后被放大以使其可以被計算機處理。計算機數(shù)據(jù)處理可以集合地轉換質譜探測器得到的信息。
[0077]SRM模式甚或MRM模式的原理是特別地選擇一個前體離子，將其破碎，然后特別地選擇一個碎片離子。對于這些應用，三連四極子或偶聯(lián)的三連四極子/離子陷阱儀器被普遍使用。
[0078]在用于MS2模式的三連四極子(Qlq2Q3)的個案中，以分析或檢查靶蛋白為目的，第一個四極子(Ql)可以根據(jù)荷質比(m/z)過濾在較早的消化步驟中獲得的待測蛋白質特有的蛋白質代表性肽相應的分子離子。只有與要找的蛋白質代表性肽荷質比相同的肽才被散發(fā)到第二個四極子(q2)并作為接下來破碎的前體離子，這里的荷質比被稱為(m/zh。q2分析器能夠使荷質比為的肽破碎成為第一代碎片離子。破碎一般通過前體肽與諸如氮氣或氬氣的惰性氣體在q2中碰撞獲得。第一代碎片離子散發(fā)到第三個四極子(Q3)中，其根據(jù)特定的稱為(m/z)2的荷質比過濾第一代碎片離子。只有荷質比與要找的蛋白質代表性肽的(m/z)2相同的碎片離子被散發(fā)到探測器中以檢測甚或定量。
[0079]當本發(fā)明的方法采用的質譜是串聯(lián)質譜(MS/MS spectrometry) (MS2、MS3、MS4或MS5)時，可以將幾個質量分析器連在另一個上。例如，第一個分析器分離離子，碰撞單元使其可以破碎離子，第二個分析器分離碎片離子。諸如離子陷阱和FT-1CR的某些分析器把幾個分析器組合成一個，使其可以破碎離子并直接分析碎片。
[0080]根據(jù)本發(fā)明優(yōu)選的實施方式，本發(fā)明的方法包括以下特征中的一個或幾個:
[0081]-為得到至少一種抗菌劑的潛在抗性的屬性而采用的質譜是MS/MS譜，其有利于產生待檢測或定量的分子特異的碎片，因而有利于向試驗方法提供極大的特異性；
[0082]-MS/MS譜是MRM，這有利于利用質譜儀的幾十毫秒的分析循環(huán)時間，使其能夠以高度的敏感性以多路復用方式檢測或定量大量不同的分子。
[0083]-同時優(yōu)選地，在適用的情況下，類型屬性和毒力因子的確定和對至少一種抗菌劑的抗性的標記的確定是在同一個質譜設備中進行的，這有利于減少分析時間和設備的花費，還會促進結果的處理和產出。
[0084]除確定抗菌劑的抗性外，還需要鑒別待測樣品中的微生物。
[0085]鑒別微生物的方法是本領域技術人員公知的，例如Murray P.R.等在臨床微生物學手冊(Manual of Clinical Microbiology) 2007年第九版中所描述的那樣,尤其是在第一卷第三部分第十五和十六章關于細菌和酵母、第二卷第六部分第八十二章關于病毒、第二卷第十部分第一百三十五章關于原生動物的內容中。作為常規(guī)鑒別方法的例子，上述內容可以包括生物屬性的確定，例如，用Vitek2(bi0M6rieuX)鑒別卡，甚或以基于某些基因的存在和其序列的研究的鑒別標準，使用分子生物學技術。
[0086]鑒別可以從鑒別的樣品直接進行，或者可以通過本領域技術人員公知的方法用為要找的微生物種量身定做的最適培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件培養(yǎng)樣品中含有的微生物，如MurrayP.R.等在臨床微生物學手冊(Manual of Clinical Microbiology) 2007年第九版第一卷第三部分第十四章所描述的，特別是在第一卷第四部分第二十一章中關于細菌、第二卷第六部分第八十一張關于病毒、第二卷第八部分第一百一十七章關于酵母和第二卷第十部分第一百三十四章關于原生動物的內容中。
[0087]因此，一般來說，在使用生物化學方法鑒別樣品中細菌的情況下，首先需要獲得純培養(yǎng)物形式的細菌，例如在接種于瓊脂之后。在特定情況下分子生物學(PCR)可以直接用于待分析樣品。
[0088]除了培養(yǎng)微生物，還可以用活化表面的方法直接從樣品中捕獲以濃縮微生物。W.-J.Chen等[10]描述了這樣一種方法，他們以添加有活化表面的磁珠Fe304/Ti02捕獲了不同種的細菌。還可以用其他方法進行捕獲，例如用凝集素(lectin)，或者抗體，或者萬古霉素捕獲。捕獲可以濃縮微生物，從而減少甚至排除培養(yǎng)步驟。這相當大的節(jié)省了時間。
[0089]鑒別還可以用質譜進行，根據(jù)前面描述的技術，優(yōu)選用MS、MS/MS甚或用構成本發(fā)明一個【具體實施方式】的連接了 MS/MS譜的MS。在這種情況下，樣品也可以經(jīng)受培養(yǎng)的步驟，例如接種到瓊脂上。
[0090]MS鑒別方法的使用的進步在于可以在幾分鐘內得以實現(xiàn)，而且要求單分析器的質譜儀，也就是說比串聯(lián)質譜MS/MS的設備簡單。。
[0091]通過連接了 MS/MS譜的MS鑒別方法的使用也是更進步的?？梢詸z查MS所發(fā)現(xiàn)的離子的同一性，這樣就提高了分析的特異性。
`[0092]MRM型MS/MS鑒別方法的使用的好處在于比常規(guī)的連接了 MS/MS譜的MS方法更敏感更簡單。這種方法既不要求高性能軟件以處理獲得MS譜和MS/MS譜之間的信息，也不要求在設置連接MS和MS/MS譜的機器參數(shù)時做改變。
[0093]如S.Vaidyanathan等[26]或者R.Everley等[27]描述的那樣,用MS鑒別的方法可以和電噴射源一起用于層析分離后的粗樣品。這樣，不同的m/z范圍可以鑒別微生物。
S.Vaidyanathan 等使用了 200 到 2000Th 之間的范圍，而 R.Everley 等使用了 620 到 2450Th之間的范圍。質譜還可以去卷積以獲取蛋白的質量而不依靠其電荷狀態(tài)。因此R.Everley等使用大約5,000到50，OOODa之間的質量?；蛘?，使用MS的鑒別方法也可以如Claydon等[3]和T.Krishnamurthy與P.Ross [4]所描述的那樣采用添加MALD1-T0F。分析結合了質譜的獲取和專業(yè)軟件的翻譯。非常簡單且能夠在幾分鐘內得以實現(xiàn)。這種鑒別方法在醫(yī)學分析實驗室中越來越廣泛傳播。
[0094]通過樣品中存在的其蛋白采用連接MS/MS的MS鑒別細菌被很多團隊廣泛應用。舉例來說，上述包括Manes N.等[29]最近的工作，他們研究腸道沙門氏菌(Salmonellaenterica)的妝組(peptidome),或者 R.Nandakumar 等[30]或 L.Hernychova 等[31]的工作，他們了細菌的以胰蛋白酶進行蛋白消化后的蛋白質組。傳統(tǒng)的方法包括i )獲得質譜，? )依次選擇質譜中獲得的有強烈信號的每個前體離子，iii)依次破碎每個前體離子并獲得其 MS/MS 譜，iv )通過諸如 Mascot (Matrix Science、London、United Kingdom)或 SEQUEST (Thermo Scientific、Waltham、United States of America)的軟件查詢諸如SffISS-PROT或NCBI的蛋白質數(shù)據(jù)庫，以鑒別有很大可能性與MS/MS譜發(fā)現(xiàn)的肽相匹配的肽。如果鑒別出種特征的蛋白質或多肽，這種方法就可以導致微生物的鑒別。
[0095]使用質譜的一個優(yōu)勢在于，在細菌對內酰胺抗性機制的標記的實施方式中，其對定量分子尤其有效。有鑒于此，使用了電流強度檢測，其與靶分子的量是成比例的。因此，測量的電流強度可以作為定量方法使確定存在的靶分子的量成為可能，這個量的特征在于以國際標準單位mol/m3或kg/m3、或者這些單位的倍數(shù)或分數(shù)、或者國際標準單位的通常的派生物(其中包括倍數(shù)或分數(shù))表達。舉一個非限制性的例子，定量方法的特征單位諸如 ng/ml 或 fmol/L.[0096]然而，必須進行標定以使相當于檢測的離子所引發(fā)的電流強度的測量的峰面積與待測的靶分子的量相關聯(lián)。為了這個目的，在本發(fā)明的架構中，采用質樸中常用的標定。MRM實驗通常以添加外參或者優(yōu)選地添加內參(例如T.Fortin等[13]所描述的)來標定。如果靶分子是使分析感興趣的分子成為可能的蛋白質代表性肽，定量方法和靶蛋白質代表性肽(繼而是感興趣的蛋白)的量的關聯(lián)是通過相對于其檢測的量已知的標準信號標定測量到的信號而獲得的。標定可以用標定曲線進行，例如以連續(xù)的注射不同濃度的標準蛋白質代表性肽(外標定)，或者優(yōu)選的用重肽(heavy peptide)作為內參進行內標定，例如根據(jù)如下所述的AQUA、QconCAT或PSAQ法?！爸仉摹崩斫鉃榈鞍踪|代表性肽相應的肽，但是其中的一或幾個碳12原子(12C)被碳13 (13C)取代，并且/或者一或幾個氮14原子(14N)被氮15 (15N)取代。
[0097]在美國專利申請2004/0229283中也提出將重肽用作內參(AQUA)。原理是以含有較天然的同位素更重的同位素的氨基酸人工合成蛋白質代表性肽。例如，這些氨基酸是通過以碳13(13C)取代碳12原子(12C),或者以氮15 (15N)取代氮14原子(14N)獲得的。如此合成的人工肽(AQUA)具有與天然肽嚴格相同的物理化學性質(除了更大的質量)。通常在質譜分析的上游，例如在引起感興趣的蛋白的裂解的處理和處理后獲得的肽的分餾步驟之間，人工肽以給定濃度添加到樣品。這樣，AQUA肽與待分析的天然肽在肽分餾期間共純化。于是，這兩種肽被同時注入質譜儀以檢測。然后它們在電離源中經(jīng)歷同樣的電離得率。天然肽和已知濃度的AQUA肽的峰面積的比較，可以計算天然肽的濃度，從而得到待測蛋白的濃度。AQUA技術的一個變型由J.-M.Pratt等[32]以QconCAT的名稱提出。這個變型在專利申請W02006/128492中也進行了描述。它由連接各種AQUA肽和產生重重組蛋白形式的人工多肽組成。重組蛋白以含有重同位素的氨基酸合成。用這種方法可以以較低的開銷獲得標定同時進行的幾個蛋白的檢測的參照。QconCAT參照一開始即被加入，在引起蛋白的裂解的處理上游，如果存在蛋白質分餾、變性、還原和封閉蛋白硫醇功能的步驟，則在其之前。因此，QconCAT參照與天然蛋白經(jīng)歷同樣的引發(fā)蛋白裂解的處理周期，這使其可以從引發(fā)蛋白裂解的步驟開始顧及得率。事實上，天然蛋白的處理，尤其是消化可能并不完全。在這種情況下，使用AQUA參照會導致低估天然蛋白的量。因此為了完全的檢測，可能從引發(fā)蛋白裂解的步驟開始顧及得率是重要的。然而，V.Brun等[33]表示QconCAT參照有時不能完全再現(xiàn)處理的得率，尤其是消化天然蛋白，無疑是因為與QconCAT蛋白的三維構象不同。
[0098]在此之后，V.Brun等[33]提出使用被稱為PSAQ的方法，并在專利申請W02008/145763中進行描述。在這個實施方式中，內參是與天然蛋白的序列相同的重組蛋白，但以中氨基酸合成。合成實在體外以重氨基酸進行的。這一參照具有與天然肽嚴格相同的物理化學性質(除了更大的質量)。參照一開始即被加入，當存在蛋白分餾步驟時，則在其之前。PSAQ展現(xiàn)出與天然蛋白同樣的處理得率，尤其是消化處理。如果進行肽分餾步驟，裂解后獲得的重肽也與天然肽共純化。于是，兩種肽同時被注入質譜儀以定量分析。然后，它們在電離源中經(jīng)歷相同的電離得率。PSAQ方法中比較天然肽和參照肽可以顧及分析方法中所有步驟地計算待測蛋白的濃度。[0099]所有這些名為AQUA、QconCAT或PSAQ或其他標定技術，用于質譜分析尤其是MRM或MS分析的技術可以用于在本發(fā)明構架范圍內進行標定。
[0100]優(yōu)選地，根據(jù)本發(fā)明，檢測方法中所用的質譜是MS/MS。更加優(yōu)選地，質譜是MRM。
[0101]本發(fā)明的方法可以檢測對碳青霉烯的抗性，其特征在于檢測至少一種肽作為抗性標記。優(yōu)選地，所述抗性標記肽從蛋白質NDM、KPC、GES、IMP, IND、SME, VIM或OXA中選擇。
[0102]具體而言，檢測一種由NDM蛋白的表達引發(fā)的抗碳青霉烯的機制，其特征在于檢測至少一種選自NDM蛋白及其不同序列變體SEQ ID N0.1和SEQ ID N0.1078到SEQ IDN0.1080 的肽。
[0103]SEQ ID N0.1:
[0104]MELPNMHPVAKLSTALAAALMLSGCMPGEIRPTIGQQMETGDQRF ⑶ LVFRQLAPNVWQHTSYLDMPGFGAVASNGLIVRDGGRVLVVDTAWTDDQTAQILNWIKQEINLPVALAVVTHAHQDKMGGMDALHAAGIATYANALSNQLAPQEGMVAAQHSLTFAANGWVEPATAPNFGPLKVFYPGPGHTSDNITVGIDGTDIAFGGCLIKDSKAKSLGNLGDADTEHYAASARAFGAAFPKASMIVMSHSAPDSRAAITHTARMADKLR
[0105]SEQ ID N0.1078
[0106]MELPNMHPVAKLSTALAAALMLSGCMAGEIRPTIGQQMETGDQRF ⑶ LVFRQLAPNVWQHTSYLDMPGFGAVASNGLIVRDGGRVLVVDTAWTDDQTAQILNWIKQEINLPVALAVVTHAHQDKMGGMDALHAAGIATYANALSNQLAPQEGMVAAQHSLTFAANGWVEPATAPNFGPLKVFYPGPGHTSDNITVGIDGTDIAFGGCLIKDSKAKSLGNL⑶ADTEHYAASARAFGAAFPKASMIVMSHSAPDSRAAITHTARMADKLR
[0107]SEQ ID N0.1079
[0108]MELPNMHPVAKLSTALAAALMLSGCMPGEIRPTIGQQMEIODQRFGDLVFRQLAPNVWQHTSYLDMPGFGAVASNGLIVRDGGRVLLVDTAWTDDQTAQILNWIKQEINLPVALAVVTHAHQDKMGGMDALHAAGIATYANALSNQLAPQEGLVAAQHSLTFAANGWVEPATAPNFGPLKVFYPGPGHTSDNITVGIDGTDIAFGGCLIKDSKAKSLGNLGDADTEHYAASARAFGAAFPKASMIVMSHSAPDSRAAITHTARMADKLR
[0109]SEQ ID N0.1080
[0110]MELPNMHPVAKLSTALAAALMLSGCMPGEIRPTIGQQMETGDQRF ⑶ LVFRQLAPNVWQHTSYLDMPGFGAVASNGLIVRDGGRVLVVDTAWTDDQTAQILNWIKQEINLPVALAVVTHAHQDKMGGMDALHAAGIATYANALSNQLAPQEGMVAAQHSLTFAANGWVEPATAPNFGPLKVFYPGPGHTSDNITVGIDGTDIAFGGCLIKDSKAKSLGNLGDADTEHYAASARAFGAAFPKASMIVMSHSAPDSRAAITHTARMADKLR
[0111]優(yōu)選地，所述從序列為SEQ ID N0.2到SEQ ID N0.9和SEQ ID N0.1083的肽中選
擇的肽定義如下:
[0112]
【權利要求】
1.一種通過質譜檢測樣品中至少一種微生物針對至少一種抗菌劑的至少一種抗性標記的方法，其特征在于: a)抗菌劑是碳青霉烯；以及 b)所述抗性標記是蛋白質或肽。
2.權利要求1的檢測方法，其中所述質譜是串聯(lián)質譜。
3.權利要求2的檢測方法，其中所述串聯(lián)質譜是多反應監(jiān)測。
4.權利要求1-3中任一項的檢測方法，其中所述抗性標記是來源于所述至少一種微生物的蛋白質。
5.權利要求4的檢測方法，其中來源于所述微生物的蛋白質被消化成肽。
6.權利要求5的檢測方法，其中用酶進行所述消化。
7.權利要求6的檢測方法，其中所述酶是胰蛋白酶。
8.權利要求1-7中任一項的檢測方法，其中所述抗性標記是NDM、KPC、GES、IMP,IND、SME、VIM或OXA型的蛋白質或肽。
9.權利要求1-8中任一項的檢測方法，其中所述抗性標記是選自序列為SEQID N0.2到 SEQ ID N0.9 以及 SEQ ID N0.1083 的肽的 NDM 肽。
10.權利要求9的檢測方法，其中所述抗性標記是選自序列為SEQID N0.2、SEQ IDN0.3、SEQ ID N0.5 或 SEQ ID N0.7 的肽的 NDM 標記。
11.權利要求1-8中任一項的檢測方法，其中所述抗性標記是選自序列為SEQIDN0.20 到 SEQ ID N0.33、SEQ ID N0.1094、SEQ ID N0.1096 和 SEQ ID N0.1097 的肽的 KPC肽。
12.權利要求11的檢測方法，其中所述抗性標記是選自序列為SEQID N0.20、SEQ IDN0.21、SEQ ID N0.23、SEQ ID N0.25、SEQ ID N0.28、SEQ ID N0.29、SEQ ID N0.31 或者 SEQID N0.32的肽的KPC標記。
13.權利要求1-8中任一項的檢測方法，其中所述抗性標記是選自序列為SEQIDN0.51、SEQ ID N0.52、SEQ ID N0.54到SEQ ID N0.58、SEQ ID N0.61到SEQ ID N0.75、SEQID N0.77 到 SEQ ID N0.79 的肽的 GES 標記。
14.權利要求13的方法，其中所述抗性標記是選自序列為SEQID N0.51、61、64、70、73、74、79的肽的GES標記。
15.權利要求13的方法，其中所述抗性標記是選自序列為SEQID N0.54、55、66、67、68、69、71、77、78 的肽的 GES 標記。
16.權利要求1-8的檢測方法，其中所述抗性標記是選自序列為SEQID N0.106、SEQID N0.108 到 SEQ ID N0.130,SEQ ID N0.133 到 SEQ ID N0.173,SEQ ID N0.175 到 SEQ IDN0.180的肽的IMP標記。
17.權利要求16的檢測方法，其中所述抗性標記是選自序列為SEQID N0.106,SEQ IDN0.108、SEQ ID N0.109、SEQ ID N0.110、SEQ ID N0.112、SEQ ID N0.113、SEQ ID N0.115、SEQ ID N0.116、SEQ ID N0.117、SEQ ID N0.118、SEQ ID N0.121、SEQ ID N0.124、SEQ IDN0.126、SEQ ID N0.127、SEQ ID N0.128、SEQ ID N0.129、SEQ ID N0.130、SEQ ID N0.133、SEQ ID N0.134、SEQ ID N0.135、SEQ ID N0.136、SEQ ID N0.137、SEQ ID N0.138、SEQ IDN0.139、SEQ ID N0.140、SEQ ID N0.141、SEQ ID N0.142、SEQ ID N0.143、SEQ ID N0.144、SEQ ID N0.145、SEQ ID N0.146、SEQ ID N0.147、SEQ ID N0.148、SEQ ID N0.149、SEQ IDN0.150、SEQ ID N0.151、SEQ ID N0.152、SEQ ID N0.153、SEQ ID N0.154、SEQ ID N0.155、SEQ ID N0.156、SEQ ID N0.157、SEQ ID N0.158、SEQ ID N0.159、SEQ ID N0.160、SEQ IDN0.161、SEQ ID N0.162、SEQ ID N0.163、SEQ ID N0.164、SEQ ID N0.165、SEQ ID N0.166、SEQ ID N0.167、SEQ ID N0.168、SEQ ID N0.169、SEQ ID N0.170、SEQ ID N0.171、SEQ IDN0.172、SEQ ID N0.173、SEQ ID N0.175、SEQ ID N0.176、SEQ ID N0.177、SEQ ID N0.179、SEQ ID N0.180的肽的MP標記。
18.權利要求16的檢測方法，其中所述抗性標記是選自序列為SEQID N0.109,SEQ IDN0.143、SEQ ID N0.144、SEQ ID N0.148、SEQ ID N0.149、SEQ ID N0.150、SEQ ID N0.151、SEQ ID N0.154、SEQ ID N0.155、SEQ ID N0.156、SEQ ID N0.159、SEQ ID N0.165、SEQ IDN0.169,SEQ ID N0.170,SEQ ID N0.17USEQ ID N0.172,SEQ ID N0.173 的肽的 MP 標記。
19.權利要求1-8中任一項的檢測方法，其中所述抗性標記是選自序列為SEQIDN0.188 到 SEQ ID N0.197,SEQ ID N0.200、SEQ ID N0.20KSEQ ID N0.203 到 SEQ ID N0.262的肽的I ND標記。
20.權利要求19的檢測方法，其中所述抗性標記是選自序列為SEQID N0.188,SEQ IDN0.189、SEQ ID N0.190、SEQ ID N0.191、SEQ ID N0.192、SEQ ID N0.193、SEQ ID N0.194、SEQ ID N0.195、SEQ ID N0.197、SEQ ID N0.201、SEQ ID N0.203、SEQ ID N0.204、SEQ IDN0.205,SEQ ID N0.206,SEQ ID N0.207,SEQ ID N0.208,SEQ ID N0.209,SEQ ID N0.210、SEQ ID N0.211、SEQ ID N0.212、SEQ ID N0.213、SEQ ID N0.215、SEQ ID N0.216、SEQ IDN0.218,SEQ ID N0.219,SEQ ID N0.220,SEQ ID N0.221,SEQ ID N0.222,SEQ ID N0.225、SEQ ID N0.226、SEQ ID N0.227、SEQ ID N0.228、SEQ ID N0.233、SEQ ID N0.234、SEQ IDN0.235,SEQ ID N0.236,SEQ ID N0.237,SEQ ID N0.238,SEQ ID N0.239,SEQ ID N0.240、SEQ ID N0.241、SEQ ID N0.242、SEQ ID N0.243、SEQ ID N0.244、SEQ ID N0.245、SEQ IDN0.246、SEQ ID N0.247、SEQ ID N0.248、SEQ ID N0.249、SEQ ID N0.250、SEQ ID N0.251、SEQ ID N0.252、SEQ ID N0.253、SEQ ID N0.254、SEQ ID N0.255、SEQ ID N0.256、SEQ IDN0.257、SEQ ID N0.258、SEQ ID N0.259、SEQ ID N0.260、SEQ ID N0.261、SEQ ID N0.262的肽的IND標記。
21.權利要求19的檢測方法，其中所述抗性標記是選自序列為SEQID N0.188,SEQ IDN0.193,SEQ ID N0.207,SEQ ID N0.242,SEQ ID N0.243,SEQ ID N0.246,SEQ ID N0.256、SEQ ID N0.260的肽的IND標記。
22.權利要求1-8中任一項的檢測方法，其中所述抗性標記是選自序列為SEQIDN0.266 到 SEQ ID N0.281 以及 SEQ ID N0.283 到 SEQ ID N0.287 的肽的 SME 標記。
23.權利要求22的檢測方法，其中所述抗性標記是選自序列為SEQID N0.266、SEQ IDN0.268,SEQ ID N0.269,SEQ ID N0.270,SEQ ID N0.273,SEQ ID N0.274,SEQ ID N0.277、SEQ ID N0.279、SEQ ID N0.281 的肽的 SME 標記。
24.權利要求1-8中任一項的檢測方法，其中所述抗性標記是選自序列為SEQIDN0.314 到 SEQ ID N0.318 以及 SEQ ID N0.320 到 SEQ ID N0.346 的肽的 VM 標記。
25.權利要求24的檢測方法，其中所述抗性標記是選自序列為SEQID N0.316、SEQ IDN0.318、SEQ ID N0.321、SEQ ID N0.341、SEQ ID N0.342、SEQ ID N0.344、SEQ ID N0.346的肽的VM標記。
26.權利要求1-8中任一項的檢測方法，其中所述抗性標記是選自序列為SEQIDN0.509 到 SEQ ID N0.523、SEQ ID N0.525 到 SEQ ID N0.572、SEQ ID N0.574 到 SEQ IDN0.604,SEQ ID N0.606 到 SEQ ID N0.618,SEQ ID N0.620 到 SEQ ID N0.696、SEQ ID N0.698到 SEQ ID N0.1077 以及 SEQ ID N0.1098 到 SEQ ID N0.1109 的肽的 OXA 標記。
27.權利要求26的檢測方法，其中所述抗性標記是選自序列為SEQID N0.509、SEQID N0.510、SEQ ID N0.512、SEQ ID N0.513、SEQ ID N0.514、SEQ ID N0.515、SEQ IDN0.516,SEQ ID N0.517,SEQ ID N0.518,SEQ ID N0.519,SEQ ID N0.520,SEQ ID N0.521、SEQ ID N0.522、SEQ ID N0.523、SEQ ID N0.525、SEQ ID N0.526、SEQ ID N0.528、SEQ IDN0.530,SEQ ID N0.531,SEQ ID N0.532,SEQ ID N0.533,SEQ ID N0.534,SEQ ID N0.535、SEQ ID N0.536、SEQ ID N0.537、SEQ ID N0.538、SEQ ID N0.539、SEQ ID N0.540、SEQ IDN0.541,SEQ ID N0.542,SEQ ID N0.543,SEQ ID N0.544,SEQ ID N0.545,SEQ ID N0.546、SEQ ID N0.547、SEQ ID N0.548、SEQ ID N0.549、SEQ ID N0.550、SEQ ID N0.551、SEQ IDN0.552,SEQ ID N0.553,SEQ ID N0.554,SEQ ID N0.555,SEQ ID N0.556,SEQ ID N0.557、SEQ ID N0.558、SEQ ID N0.559、SEQ ID N0.560、SEQ ID N0.561、SEQ ID N0.562、SEQ IDN0.563,SEQ ID N0.564,SE Q ID N0.565,SEQ ID N0.566,SEQ ID N0.567,SEQ ID N0.571、SEQ ID N0.572、SEQ ID N0.574、SEQ ID N0.575、SEQ ID N0.576、SEQ ID N0.577、SEQ IDN0.578,SEQ ID N0.580,SEQ ID N0.58KSEQ ID N0.583,SEQ ID N0.584,SEQ ID N0.586、SEQ ID N0.587、SEQ ID N0.588、SEQ ID N0.589、SEQ ID N0.590、SEQ ID N0.591、SEQ IDN0.593,SEQ ID N0.594,SEQ ID N0.595,SEQ ID N0.596,SEQ ID N0.597,SEQ ID N0.598、SEQ ID N0.599、SEQ ID N0.600、SEQ ID N0.601、SEQ ID N0.602、SEQ ID N0.604、SEQ IDN0.606,SEQ ID N0.607,SEQ ID N0.609,SEQ ID N0.611,SEQ ID N0.612,SEQ ID N0.613、SEQ ID N0.614、SEQ ID N0.615、SEQ ID N0.616、SEQ ID N0.618、SEQ ID N0.620、SEQ IDN0.622,SEQ ID N0.623,SEQ ID N0.624,SEQ ID N0.625,SEQ ID N0.626,SEQ ID N0.627、SEQ ID N0.632、SEQ ID N0.633、SEQ ID N0.635、SEQ ID N0.636、SEQ ID N0.637、SEQ IDN0.638,SEQ ID N0.639,SEQ ID N0.640,SEQ ID N0.641,SEQ ID N0.642,SEQ ID N0.643、SEQ ID N0.645、SEQ ID N0.648、SEQ ID N0.649、SEQ ID N0.651、SEQ ID N0.652、SEQ IDN0.653,SEQ ID N0.654,SEQ ID N0.655,SEQ ID N0.656,SEQ ID N0.659,SEQ ID N0.660、SEQ ID N0.664、SEQ ID N0.665、SEQ ID N0.666、SEQ ID N0.667、SEQ ID N0.669、SEQ IDN0.670,SEQ ID N0.672,SEQ ID N0.673,SEQ ID N0.674,SEQ ID N0.675,SEQ ID N0.676、SEQ ID N0.677、SEQ ID N0.678、SEQ ID N0.679、SEQ ID N0.680、SEQ ID N0.681、SEQ IDN0.685、SEQ ID N0.686、SEQ ID N0.687、SEQ ID N0.688、SEQ ID N0.689、SEQ ID N0.690、SEQ ID N0.691、SEQ ID N0.692、SEQ ID N0.693、SEQ ID N0.694、SEQ ID N0.696、SEQ IDN0.698、SEQ ID N0.699、SEQ ID N0.700、SEQ ID N0.701、SEQ ID N0.702、SEQ ID N0.703、SEQ ID N0.706、SEQ ID N0.707、SEQ ID N0.710、SEQ ID N0.714、SEQ ID N0.717、SEQ IDN0.719,SEQ ID N0.720,SEQ ID N0.722,SEQ ID N0.725,SEQ ID N0.726,SEQ ID N0.727、SEQ ID N0.728、SEQ ID N0.729、SEQ ID N0.732、SEQ ID N0.735、SEQ ID N0.736、SEQ IDN0.737,SEQ ID N0.738,SEQ ID N0.740,SEQ ID N0.741,SEQ ID N0.743,SEQ ID N0.744、SEQ ID N0.745、SEQ ID N0.746、SEQ ID N0.747、SEQ ID N0.748、SEQ ID N0.749、SEQ IDQI 53S ,8ε6.0Ν S 5MS ,Ζε6.0Ν S 5MS ,9ε6.0Ν S 5MS ,9ε6.0Ν S 5MS ,Ζε6.0Ν S σΜοοοε6.ΟΝ S 53s,8s.0Ν S 5MS ,S6.0Ν S Ssds.0N S 5MS 二 S.0Ν S 5MS0S.0ΝQI 53S ,816.0Ν S 5MS ,Η6.0Ν S 5MS ,Π6.0Ν S 5MS ,ΖΤ6.0Ν S 5300,26.0Ν Sσ.35,606.0Ν S 5300,806.0Ν S 5MS ,Ζ06.0Ν S 5MS ,906.0Ν S 5MS ,906.0Ν S 5MS,S6.0ΝCl 53S ,CO06.0Ν ωηηSg ,Sg.?=曰 Sg ,Sg.?藝 Qi sgoog.?=曰 sg ,ggg.?=曰 σΜοο,868.ΟΝ S 5MS,Z68.ΟΝ S 5MS ,968.ΟΝ S 5MS ,968.ΟΝ S 1-l.0^ QI Sg ,Sg.差Cl 53S ,S8.ΟΝ ωηη1.0^ Qi sgogg.?=曰 Sg ,ggg.?=曰 sg ,000000.?=曰 σΜοο,Ζ88.0Ν QH ss,988.0Ν QHafMs ,Looooo_QN QHafMs^oooo_QN QHafMs ,εοοοο_QN QH ss ,S8.0ΝCl 53S 二 88.0Ν ωηηsgogg.?=曰 1.0^ Ξ Sgvgfc=曰 1.0^ Ξ σΜοο,9Ζ8.0Ν S 53s,loz8.0Ν S ss^zo0.0Ν S 5MS,U00.0Ν S 5MS ,698.0Ν S 5MS ,898.0ΝCl 53S ,Ζ98.0Ν ωηηSg ,ggg.?=曰 Sg ,Sg.?=曰 Sgdggg 曰 1.0^ Ξ 53Sο98.ΟΝ S 5300,698.0Ν S 5MS ,898.0Ν S 5MS ,ZLO00.0Ν S 5MS ,998.0Ν S 5MS ,998.0ΝCl 53S ,S8.0Ν ωηηSgvsggqhh1- S?.0^ Ξ 53S0900.0Ν ΩΗΗSg ?οο.?=QHHσΜοο,ι.ΟΝ QHaf3s,zs _QN QHafMs ?οο_QN QHafMs ?οο.0Ν QH Ss,蕁8.0Ν QHafMs ?οο_QNCl 53S 二寸8.0Ν ωηηsgoig.?=曰 Sg vgcog.?=曰 1.0^ Qi sg vgcog.?=曰 σΜοο,9ε8.ΟΝ S ss^coo0.0Ν S 5MS ,εεοο.0Ν S 53s,zco8.0Ν S 5MS ,?εοο.0Ν S 5MS0CO8.0ΝQI 53S ,6S.0Ν S 5MS ,8S.0Ν S 5MS ,Zs.0Ν S 5MS ,9S.0Ν S 5MS ,LOS.0Ν S σΜοο,藝8.0Ν QH Ssds.0Ν QH Ss 二 S.0Ν QH Ss ,818.0Ν QH Ss ?οο.0Ν QH Ss ,Η8.0ΝQI 53S ,Π8.0Ν S 5MS ?οο.0Ν S 5MS ,ποο.0Ν S 5MS0T00.0Ν S 5MS ,608.0Ν Sσ.35,Ζ08.ΟΝ ωη η1-1.0^ Ξ sg,LOog.?=qhh1-l.0^ Ξ sg ,Sg.?=曰 sg,so0.0ΝQI 53S008.0Ν S 5MS ,66Ζ.0Ν S 5MS ,86Ζ.0Ν S 5MS ,Ζ6Ζ.0Ν S 5MS ,96Ζ.0Ν S σΜοο,96ζ.ΟΝ S 5MS^6Z.0Ν S 5MS ,CO6Z.0Ν S 5MS ,Sz.0Ν S 5MS06Z.0Ν S 53s,68z.0ΝQI 53S ,88Ζ.0Ν S 5MS ,Ζ8Ζ.0Ν S 5MS ,98Ζ.0Ν S 5MS ,LO00Z.0Ν S 5MS ,εοοζ.0Ν S σΜοο,Ζ8Ζ.0Ν S 5MS,T00Z.0Ν S 5MS000Z.0Ν S 5MS ,6ΖΖ.0Ν S 5MS ,8ΖΖ.0Ν S 5MS,ZZZ.0Να? 53S ,9ΖΖ.0Ν ωηηi Jp.0^ <Π i Jp.0^ αι 1.0^ <Π 53S ,Uz.0Ν ωηησΜοοοζζ.ΟΝ S 5MS,69Z.0Ν S 5MS ,89Ζ.0Ν S 5MS ,Ζ9Ζ.0Ν S 5MS ,99Ζ.0Ν S 5Ms,co9z.0ΝQI 53S ,Sz.0Ν S 53S09Z.0Ν S 5MS ,Sz.0Ν S 5MS ,ZLOZ.0Ν S 5MS ,9LOZ.0Ν S σΜοο,LOLOZ.0Ν S 5MS,SZ.0Ν S 5MS,SZ.0Ν S 5MS,SZ.0Ν S 5MS ,TLOZ.0Ν S SSOLOZ.0Νstloa ο.玲狀 r-ψ V 9TS9ZS0T ZoSEQ ID N0.1015、SEQ ID N0.1018、SEQ ID N0.1019、SEQ ID N0.1020、SEQ ID N0.1022、SEQ ID N0.1024、SEQ ID N0.1025、SEQ ID N0.1026、SEQ ID N0.1027、SEQ ID N0.1028、SEQ ID N0.1030、SEQ ID N0.1031、SEQ ID N0.1034、SEQ ID N0.1036、SEQ ID N0.1041、SEQ ID N0.1042、SEQ ID N0.1044、SEQ ID N0.1045、SEQ ID N0.1046、SEQ ID N0.1048、SEQ ID N0.1049、SEQ ID N0.1050、SEQ ID N0.1052、SEQ ID N0.1053、SEQ ID N0.1054、SEQ ID N0.1058、SEQ ID N0.1059、SEQ ID N0.1060、SEQ ID N0.1062、SEQ ID N0.1063、SEQ ID N0.1064、SEQ ID N0.1067、SEQ ID N0.1068、SEQ ID N0.1069、SEQ ID N0.1070、SEQ ID N0.1071、SEQ ID N0.1072、SEQ ID N0.1073、SEQ ID N0.1074、SEQ ID N0.1075、SEQ ID N0.1076,SEQ ID N0.1098,SEQ ID N0.1099,SEQ ID N0.1100,SEQ ID N0.110USEQID N0.1102、SEQ ID N0.1103、SEQ ID N0.1104、SEQ ID N0.1105、SEQ ID N0.1106、SEQ IDN0.1107、SEQ ID N0.1108、SEQ ID N0.1109 的肽的 OXA 標記。
28.權利要求26的檢測方法，其中所述抗性標記是選自序列為SEQID N0.510,512,513、514、520、521、522、523、525、530、532、537、541、542、543、544、545、546、547、548、549、550、551、552、556、557、558、559、560、561、562、574、581、582、583、584、596、597、598、599、600、601、602、607、609、632、633、635、636、649、655、656、667、674、675、689、690、698、714、719、720、722、727、729、741、746、748、750、751、752、755、756、757、763、767、768、772、775、781、782、790、792、793、794、795、796、797、798、801、809、811、812、813、814、824、832、834、837、838、847、851、853、854、855、856、857、858、859、860、862、868、869、870、874、875、876、877、879、880、881、882、894、895、898、902、903、904、906、907、908、912、913、914、920、922、923、937、938、939、945、946、948、949、950、951、954、956、962、964、967、969、971、972、974、975、979、980、985、988、990、993、994、995、996、997、1000、1001、1003、1004、1005、1011、1013、1015、1018、1019、1027、1030、1034、1035、1036、1042、1048、1052、1058、1060、1070、1098、1099、1100、1101、1102、1103、1104、1105、1106、1107、1108、1109 的肽的 OXA 標記。
29.權利要求26的檢測 方法，其中所述抗性標記是選自序列為SEQID N0.1098、SEQID N0.1100、SEQ ID N0.1102、SEQ ID N0.1103、SEQ ID N0.1104、SEQ ID N0.1105、SEQ IDN0.1107、SEQ ID N0.1108、SEQ ID N0.1109 的肽的 OXA 標記。
【文檔編號】G01N33/68GK103765216SQ201280030179
【公開日】2014年4月30日 申請日期:2012年4月20日 優(yōu)先權日:2011年4月21日
【發(fā)明者】Y·沙勒捷, J-P·沙里耶, C·弗蘭切斯基, G·贊巴爾迪, T·切基尼, E·德古沙爾梅特 申請人:生物梅里埃公司