專利名稱：碳青霉烯酶肺炎克雷伯氏菌的熒光檢測(cè)試劑盒及檢測(cè)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種碳青霉烯酶肺炎克雷伯氏菌的熒光檢測(cè)試劑盒及檢測(cè)方法。
背景技術(shù)：
抗藥性細(xì)菌KPC也就是碳青霉烯酶肺炎克雷伯氏菌(Klebsiellapneumoniae carbapenamase)，最早在一株亞胺培南耐藥的肺炎克雷伯菌中被發(fā)現(xiàn)，屬于Bush分類的2f 組，Ambler分類的A類，能夠水解碳青霉烯類、青霉素類、頭孢菌素類和氨曲南等抗生素。目 前已有5個(gè)KPC亞型被國(guó)內(nèi)外研究發(fā)現(xiàn)，碳青霉烯酶肺炎克雷伯氏菌屬于2型。碳青霉烯 類藥物通常用于對(duì)付其他抗生素?zé)o法應(yīng)付的細(xì)菌感染，具有非常廣泛的抗菌活性，因能抵 抗大多數(shù)內(nèi)酰胺酶的水解，故常用于產(chǎn)超廣譜-內(nèi)酰胺酶(ESBL)和/或去阻遏AmpC-內(nèi)酰 胺酶(AmpC)菌株引起嚴(yán)重感染的治療。但是碳青霉烯耐藥腸桿菌的出現(xiàn)，給臨床治療帶來(lái) 了極大困難。從2000年以后，KPC酶家族陸續(xù)在美國(guó)的新英格蘭和亞特蘭大地區(qū)被發(fā)現(xiàn)， 主要在克雷伯菌屬中，也在其他菌株中被發(fā)現(xiàn)。由于腸桿菌是臨床上重要的醫(yī)院感染菌，其 對(duì)碳青霉烯類抗菌藥物的耐藥給臨床抗感染治療帶來(lái)了極大困難。KPC細(xì)菌被視為突破了 臨床治療的最后一道防線碳青霉烯類抗生素的生物體，碳青霉烯類抗生素都對(duì)它起不了作 用。據(jù)報(bào)道，巴西衛(wèi)生部門(mén)2010年10月19日表示，截至10月15日，這種KPC超級(jí)細(xì) 菌已經(jīng)在首都巴西利亞造成15人死亡，另有135人被感染，發(fā)病數(shù)量在過(guò)去幾個(gè)星期以來(lái) 人數(shù)不斷激增。美國(guó)衛(wèi)生員說(shuō)，現(xiàn)有抗生素幾乎全都無(wú)法控制的一種超級(jí)細(xì)菌，已出現(xiàn)在美 國(guó)35州醫(yī)院，其中紐約和新澤西出現(xiàn)感染最多。這種具有新基因的超級(jí)細(xì)菌也在世界其他 地方擴(kuò)散。美國(guó)醫(yī)院發(fā)現(xiàn)的這些細(xì)菌尤其容易感染危重病人，而且4亡率高達(dá)30%至60%。 美國(guó)疾病預(yù)防控制中心說(shuō)，雖然KPC細(xì)菌在紐約和新澤西州最常見(jiàn)，可是美國(guó)一半以上的 州都發(fā)現(xiàn)其蹤影。10年前美國(guó)各地醫(yī)院發(fā)現(xiàn)的KPC細(xì)菌，只有對(duì)碳青霉烯類抗生素具 有抗藥性，現(xiàn)在比率已超過(guò)8%。我國(guó)KPC-2酶基因主要見(jiàn)于我國(guó)華東地區(qū)，而其它地區(qū)鮮 有報(bào)道。由于KPC細(xì)菌對(duì)臨床抗生素的使用產(chǎn)生極大影響，因此有必要建立一種碳青霉烯 酶肺炎克雷伯氏菌(KPC)快速、有效的診斷方法。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明目的是根據(jù)碳青霉烯酶肺炎克雷伯氏菌基因設(shè)計(jì)引物和TaqMan探針，提 供一種檢測(cè)碳青霉烯酶肺炎克雷伯氏菌的熒光檢測(cè)試劑盒及其檢測(cè)方法，可實(shí)現(xiàn)對(duì)碳青霉 烯酶肺炎克雷伯氏菌進(jìn)行快速、準(zhǔn)確、特異檢測(cè)。本發(fā)明采用的技術(shù)方案是一種碳青霉烯酶肺炎克雷伯氏菌的熒光檢測(cè)試劑盒，所述試劑盒主要包括特異性 引物和熒光探針、PCR緩沖液、脫氧三磷酸核苷混合物和DNA聚合酶，所述特異性引物和熒 光探針序列如下上游引物5‘ -ACTGGGCGCGCACCTA-3 ‘
3
下游引物5‘ -TCGCTGTGCTTGTCATCCTT-3 ‘熒光探針5'-FAM-CCGTCTACACCCGGGCGCC-TAMRA-3'其中FAM為熒光報(bào)告基團(tuán)，TAMRA為熒光淬滅基團(tuán)。本發(fā)明關(guān)鍵在于特異性引物和熒光探針序列的設(shè)計(jì)，試劑盒中其他組成，可按本 領(lǐng)域常規(guī)進(jìn)行選擇，該試劑盒可用作碳青霉烯酶肺炎克雷伯氏菌的定性檢測(cè)，也可加入標(biāo) 準(zhǔn)品進(jìn)行定量檢測(cè)。優(yōu)選的，所述試劑盒中還可包括碳青霉烯酶肺炎克雷伯氏菌基因標(biāo)準(zhǔn)品，所述標(biāo) 準(zhǔn)品序列如下 :ggcacggcaa atgactatgc cgtcgtctgg cccactgggcgcgcacctat tgtgttggcc gtctacaccc gggcgcctaa caaggatgac aagcacagcgaggccgtcat cgccgctgcg gctagactcg cgctcgaggg。以標(biāo)準(zhǔn)品的梯度濃度的DNA溶液進(jìn)行熒光PCR檢測(cè)，根據(jù)拷貝濃度的對(duì)數(shù)值 與標(biāo)準(zhǔn)品Ct值的關(guān)系可繪制得到標(biāo)準(zhǔn)曲線，測(cè)得樣品DNA的Ct值后，對(duì)照標(biāo)準(zhǔn)曲線即可獲 得樣品DNA的拷貝濃度。本發(fā)明還涉及一種碳青霉烯酶肺炎克雷伯氏菌的PCR檢測(cè)方法，所述方法包括(1)提取待測(cè)樣本DNA;(2)取特異性擴(kuò)增引物及特異性探針、PCR緩沖液、脫氧三磷酸核苷混合物和DNA 聚合酶，分別加入陰性對(duì)照品或待測(cè)樣品DNA配成PCR反應(yīng)體系，于同等條件下進(jìn)行PCR擴(kuò) 增反應(yīng)，反應(yīng)管置于定量熒光PCR儀進(jìn)行熒光檢測(cè)；所述特異性引物和熒光探針序列如下上游引物5‘ -ACTGGGCGCGCACCTA-3 ‘下游引物5'-TCGCTGTGCTTGTCATCCTT-3‘熒光探針5‘ -FAM-CCGTCTACACCCGGGCGCC-TAMRA-3 ‘其中FAM為熒光報(bào)告基團(tuán)，TAMRA為熒光淬滅基團(tuán)；所述陰性對(duì)照品可按本領(lǐng)域常規(guī)方法選擇，通常選擇非靶細(xì)菌，如副溶血性弧菌、 志賀菌、沙門(mén)菌、非耐藥肺炎克雷伯氏菌等。(3)選擇熒光檢測(cè)模式FAM熒光，基線調(diào)整取3 15個(gè)循環(huán)的熒光信號(hào)，以閾值線 剛好超過(guò)正常陰性對(duì)照的最高點(diǎn)設(shè)定閾值線；若待測(cè)樣品熒光增長(zhǎng)曲線超過(guò)閾值線，并呈 良好的對(duì)數(shù)增長(zhǎng)，則判斷為陽(yáng)性。為達(dá)到定量檢測(cè)的要求，所述方法可同時(shí)以梯度濃度的標(biāo)準(zhǔn)品DNA溶液在 與樣品DNA相同條件下進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)，以標(biāo)準(zhǔn)品DNA溶液拷貝濃度的對(duì)數(shù)值為 橫坐標(biāo)、標(biāo)準(zhǔn)品Ct值為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線；根據(jù)樣品DNA測(cè)得的Ct值，對(duì)照標(biāo)準(zhǔn) 曲線，獲得樣品DNA的拷貝濃度；所述標(biāo)準(zhǔn)品DNA序列如下ggcacggcaa atgactatgc cgtcgtctgg cccactgggcgcgcacctat tgtgttggcc gtctacaccc gggcgcctaa caaggatgac aagcacagcgaggccgtcat cgccgctgcg gctagactcg cgctcgaggg。所述PCR反應(yīng)條件可按參照本領(lǐng)域常規(guī)熒光定量PCR方法，優(yōu)選的，所述PCR擴(kuò)增 反應(yīng)條件如下95°C變性2分鐘，95°C 15秒、60°C 30秒進(jìn)行40個(gè)循環(huán)擴(kuò)增。PCR反應(yīng)液通常按如下組成配制(終濃度)PCR buffer終濃度為1Χ、0·3 0. 5 μ M的引物、0. 1 0. 3 μ M的熒光探針、1 2. 5U的DNA聚合酶、0. 2 0. 4mM的dNTPs， 通常取2 μ L (約50ng/ μ 1)的模板，反應(yīng)總體積通常為20 50 μ L。PCR buffer終濃度 為IX，是指緩沖液中各組分終濃度與IXPCR buffer相同，通常采用市購(gòu)2XPCR buffer,體積用量為PCR反應(yīng)液體系總體積的1/2。IXPCR buffer組成如下KC1 50mM, Tris-HCl IOmM, TritonX-1000. 1%, MgCl2L 5mM。本發(fā)明建立了利用TaqMan熒光定量PCR技術(shù)檢測(cè)碳青霉烯酶肺炎克雷伯氏菌的 方法，并經(jīng)檢測(cè)臨床樣本，表明該方法切實(shí)可行。由于本方法采用了 PCR擴(kuò)增技術(shù)，使得碳 青霉烯酶肺炎克雷伯氏菌檢測(cè)的敏感性大大提高，而且由于熒光探針的應(yīng)用，使得其特異 性亦大大提高，降低了常規(guī)PCR擴(kuò)增的假陽(yáng)性率，使得我們可以在極少的標(biāo)本中獲得足夠 的監(jiān)測(cè)信息。本發(fā)明采用了目前較先進(jìn)的特異性熒光探針雜交定量PCR檢測(cè)技術(shù)，在保持高敏 感性的前提下盡量減少假陽(yáng)性干擾。在實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)技術(shù)出現(xiàn)之前，人們對(duì)PCR 模板的定量不論是直接PCR還是競(jìng)爭(zhēng)性PCR，基本上都要通過(guò)PCR產(chǎn)物電泳，再將電泳結(jié)果 經(jīng)計(jì)算機(jī)圖像處理，根據(jù)電泳條帶的亮度來(lái)確定最終PCR產(chǎn)物量的多少，或?qū)?biāo)記的PCR 產(chǎn)物以ELISA的方式進(jìn)行檢測(cè)，再由此推測(cè)起始模板的量，但這些方法實(shí)際上都屬于半定 量水平，因?yàn)榧词筆CR條件已優(yōu)化到最佳程度，電泳及后續(xù)步驟的操作的不穩(wěn)定性仍會(huì)給 結(jié)果分析帶來(lái)影響，從而影響定量這的結(jié)果。隨著實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)的出現(xiàn)，人們可以 真正地做到對(duì)PCR模板的精確定量，這種定量不僅保持了常規(guī)PCR的高靈敏性，而且由于特 異性熒光探針雜交技術(shù)的應(yīng)用，使得被檢測(cè)基因的特異性大大提高。本發(fā)明的有益效果主要體現(xiàn)在碳青霉烯酶肺炎克雷伯氏菌的檢測(cè)敏感性高，特 異性好，降低了常規(guī)PCR擴(kuò)增的假陽(yáng)性率；可實(shí)現(xiàn)對(duì)碳青霉烯酶肺炎克雷伯氏菌快速、準(zhǔn) 確、特異檢測(cè)。


圖1為實(shí)時(shí)熒光定量PCR標(biāo)準(zhǔn)品檢測(cè)碳青霉烯酶肺炎克雷伯氏菌實(shí)時(shí)熒光定量 PCR標(biāo)準(zhǔn)品檢測(cè)結(jié)果，從左至右分別為ΙΟ7、ΙΟ6、ΙΟ5、ΙΟ4、103、IO2UO1Copies/ μ L標(biāo)準(zhǔn)品。圖2為實(shí)時(shí)熒光定量PCR標(biāo)準(zhǔn)曲線。標(biāo)準(zhǔn)曲線為Y =-3. 494XlgX+34. 916 ;Υ:對(duì) 應(yīng)的CT值；X 碳青霉烯酶肺炎克雷伯氏菌基因的copies。圖3為不同濃度的5例臨床標(biāo)本熒光定量PCR檢測(cè)結(jié)果，CT值分別為24. 32、 25. 09,28. 15,28. 91 和 32. 97，拷貝數(shù)分別為 6. 58 X IO4Copies/μ L、3. 09 X IO4Copies/μ L、 7. 41 X IO2Copies/μ L、2. 25 X 102copies/μ L 和 0. 003copies/μ L。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步描述，但本發(fā)明的保護(hù)范圍并不僅限于 此實(shí)施例1 1、材料細(xì)菌基因組DNA提取試劑購(gòu)自大連寶生物工程有限公司；限制性內(nèi)切酶購(gòu)自美國(guó) LTI/Gibco公司，pGEM-T-Easy克隆系統(tǒng)、Taq DNA聚合酶購(gòu)自美國(guó)Promega公司，測(cè)序試劑、 377 型測(cè)序儀、Bio-Rad icycler PCR 儀、Rotor Gene Q 5-plex 型定量 PCR 儀(Qiagen 公 司)。2、引物及探針設(shè)計(jì)與合成
以碳青霉烯酶肺炎克雷伯氏菌基因序列(注冊(cè)號(hào)為AY034847)為模板，使用 Primer Express (V2. 0，美國(guó)ABI公司)軟件分析TaqMan引物和探針位點(diǎn)，從中選擇最佳組合。標(biāo)準(zhǔn)品PCR序列上游引物5，-GGCACGGCAAATGACTATGC-3，，下游引物5，-CCCTCGAGCGCGAGTCTAGC-3，，檢測(cè)用PCR序列為上游引物5‘ -ACTGGGCGCGCACCTA-3 ‘下游引物5‘ -TCGCTGTGCTTGTCATCCTT-3 ‘熒光探針5'-FAM-CCGTCTACACCCGGGCGCC-TAMRA-3'其中FAM為熒光報(bào)告基團(tuán)，TAMRA為熒光淬滅基團(tuán)。均由上海輝睿生物科技有限公司合成。3、檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)品制備采用ABI 394寡核苷酸合成儀根據(jù)碳青霉烯酶肺炎克雷伯氏菌基因序列中標(biāo)準(zhǔn) 品PCR序列的位置，全基因合成140bp的寡核苷酸片段。用標(biāo)準(zhǔn)品上下游引物在Bio-Rad i eye Ier PCR儀上進(jìn)行PCR擴(kuò)增PCR反應(yīng)液組成如下2 X PCR buffer10. 0 μ L標(biāo)準(zhǔn)品上游引物(10 μ Μ)IuL標(biāo)準(zhǔn)品下游引物(10 μ Μ)IuLDNA 聚合酶(5U/ μ L)0. 2 μ LdNTPs (各 250mM)1· 6 μ L(dATP、dTTP、dCTP、dGTP 物質(zhì)的量比 1 1 1 1)模板 DNA (50ng/ μ L)1 μ L水補(bǔ)足至20 μ L。PCR條件為94°C 5分鐘變性，94°C 20秒、55°C 20秒、72°C 20秒進(jìn)行35個(gè)循環(huán)擴(kuò) 增，最后于72°C延伸5分鐘后置4°C。PCR產(chǎn)物經(jīng)電泳檢測(cè)后即用克隆系統(tǒng)插入pGEM-T-Easy克隆載體，并將陽(yáng)性克隆 經(jīng)測(cè)序驗(yàn)證。回收140bp片段，即為標(biāo)準(zhǔn)品，測(cè)定濃度并換算成(拷貝數(shù)/體積)。4、結(jié)果經(jīng)測(cè)序，上述設(shè)計(jì)標(biāo)準(zhǔn)品完全與預(yù)期相符，回收的標(biāo)準(zhǔn)品片段序列如下 ggcacggcaa atgactatgc cgtcgtctgg cccactgggc gcgcacctat tgtgttggccgtctacaccc gggcgcctaa caaggatgac aagcacagcg aggccgtcat cgccgctgcggctagactcg cgctcgaggg(SEQ ID No. 4)。實(shí)施例2 熒光定量PCR法檢測(cè)臨床樣本1、標(biāo)本檢測(cè)5例人工模擬標(biāo)本，采用基因組DNA提取試劑提取基因組DNA，分別取LOyL做模 板，用檢測(cè)用上下游引物在Rotor Gene Q 5-plex型定量PCR儀(Qiagen公司)上進(jìn)行PCR 擴(kuò)增。
6
PCR反應(yīng)液組成如下2 X PCR buffer10. 0 μ L檢測(cè)用上游引物(10 μ Μ)IuL檢測(cè)用下游引物(10 μ Μ)IuL檢測(cè)用熒光探針(10 μ Μ)0. 5uLDNA 聚合酶(5U/ μ L)0. 2 μ L

dNTPs (各 250mM)1· 60 μ L(dATP、dTTP、dCTP、dGTP 物質(zhì)的量比 1 1 1 1)模板DNA (50ng/ μ L)1 μ L水補(bǔ)足至20 μ L。PCR反應(yīng)條件為95°C預(yù)變性2分鐘，95°C 15秒、60°C 30秒進(jìn)行40個(gè)循環(huán)擴(kuò)增。以非耐藥肺炎克雷伯氏菌(ATCC 700603)為陰性對(duì)照于相同條件下進(jìn)行PCR檢 測(cè)，以閾值線剛好超過(guò)正常陰性對(duì)照的最高點(diǎn)設(shè)定閾值線；若待測(cè)樣品熒光增長(zhǎng)曲線超過(guò) 閾值線，并呈良好的對(duì)數(shù)增長(zhǎng)，則判斷為陽(yáng)性，否則判斷為陰性。同時(shí)在相同條件下以不同濃度標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行檢測(cè)，并繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。待測(cè)樣本的測(cè)定結(jié)果經(jīng)儀器處理根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出檢測(cè)樣本中的碳青霉烯酶 肺炎克雷伯氏菌基因的數(shù)量。以副溶血性弧菌(ATCC 17802)、志賀菌(ATCC 12022)、沙門(mén)菌(ATCC 50035)、金 黃色葡萄球菌(ATCC 25933)、非耐藥肺炎克雷伯氏菌(ATCC 13883)和空腸彎曲菌(ATCC 33560)菌株按照上述方法進(jìn)行PCR檢測(cè)，檢測(cè)結(jié)果均呈陰性，說(shuō)明本發(fā)明方法特異性好。2、樣品檢測(cè)結(jié)果標(biāo)準(zhǔn)品檢測(cè)結(jié)果參見(jiàn)圖1，標(biāo)準(zhǔn)曲線參見(jiàn)圖2。5例臨床標(biāo)本檢出碳青霉烯酶肺炎克雷伯氏菌陽(yáng)性，檢測(cè)結(jié)果參見(jiàn)圖3 :5例陽(yáng) 性臨床標(biāo)本熒光定量PCR檢測(cè)結(jié)果，CT值分別為24. 32、25. 09、28. 15、28. 91和32. 97， 拷貝數(shù)分別為 6· 58X IO4Copies/μ L、3. 09X IO4Copies/μ L、7. 41 X IO2Copies/μ L、 2. 25 X 102copies/ μ L 和 0. 003copies/ μ L。本發(fā)明是結(jié)合最佳實(shí)施例進(jìn)行描述的，然而在閱讀了本發(fā)明的上述內(nèi)容后，本領(lǐng) 域技術(shù)人員可以對(duì)本發(fā)明作各種改動(dòng)或修改，這些等價(jià)形式同樣落于本申請(qǐng)所附權(quán)利要求 書(shū)所限定的范圍。
權(quán)利要求
1. 一種碳青霉烯酶肺炎克雷伯氏菌的熒光檢測(cè)試劑盒，所述試劑盒主要包括特異性引 物和熒光探針、PCR緩沖液、脫氧三磷酸核苷混合物和DNA聚合酶，其特征在于所述特異性 引物和熒光探針序列如下上游引物5 ‘ -ACTGGGCGCGCACCTA-3 ‘ 下游引物5 ‘ -TCGCTGTGCTTGTCATCCTT-3 ‘ 熒光探針5 ‘ -FAM-CCGTCTACACCCGGGCGCC-TAMRA-3 ‘ 其中FAM為熒光報(bào)告基團(tuán)，TAMRA為熒光淬滅基團(tuán)。
2.如權(quán)利要求1所述的試劑盒，其特征在于所述試劑盒中還包括碳青霉烯酶肺 炎克雷伯氏菌基因標(biāo)準(zhǔn)品，所述標(biāo)準(zhǔn)品序列如下ggcacggcaaatgactatgc cgtcgtctgg cccactgggc gcgcacctat tgtgttggcc gtctacacccgggcgcctaa caaggatgac aagcacagcg aggccgtcat cgccgctgcg gctagactcgcgctcgaggg。
3. 一種碳青霉烯酶肺炎克雷伯氏菌的PCR檢測(cè)方法，所述方法包括(1)提取待測(cè)樣本DNA;(2)取特異性擴(kuò)增引物及特異性探針、PCR緩沖液、脫氧三磷酸核苷混合物和DNA聚合 酶，分別加入陰性對(duì)照品或待測(cè)樣品DNA配成PCR反應(yīng)體系，于同等條件下進(jìn)行PCR擴(kuò)增反 應(yīng)，反應(yīng)管置于定量熒光PCR儀進(jìn)行熒光檢測(cè)；所述特異性引物和熒光探針序列如下 上游引物5 ‘ -ACTGGGCGCGCACCTA-3 ‘ 下游引物5 ‘ -TCGCTGTGCTTGTCATCCTT-3 ‘ 熒光探針5 ‘ -FAM-CCGTCTACACCCGGGCGCC-TAMRA-3 ‘ 其中FAM為熒光報(bào)告基團(tuán)，TAMRA為熒光淬滅基團(tuán)；(3)選擇熒光檢測(cè)模式FAM熒光，基線調(diào)整取3 15個(gè)循環(huán)的熒光信號(hào)，以閾值線剛好 超過(guò)正常陰性對(duì)照的最高點(diǎn)設(shè)定閾值線；若待測(cè)樣品熒光增長(zhǎng)曲線超過(guò)閾值線，并呈良好 的對(duì)數(shù)增長(zhǎng)，則判斷為陽(yáng)性。
4.如權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于所述方法同時(shí)以梯度濃度的標(biāo)準(zhǔn)品DNA溶 液在與樣品DNA相同條件下進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)，以標(biāo)準(zhǔn)品DNA溶液拷貝濃度的對(duì)數(shù)值為橫 坐標(biāo)、標(biāo)準(zhǔn)品Ct值為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線；根據(jù)樣品DNA測(cè)得的Ct值，對(duì)照標(biāo)準(zhǔn)曲線，獲 得樣品DNA的拷貝濃度；所述標(biāo)準(zhǔn)品DNA序列如下ggcacggcaa atgactatgccgtcgtctgg cccactgggc gcgcacctat tgtgttggcc gtctacaccc gggcgcctaacaaggatgac aagcacagcg aggccgtcat cgccgctgcg gctagactcg cgctcgaggg。
5.如權(quán)利要求3或4所述的方法，其特征在于所述PCR擴(kuò)增反應(yīng)條件如下95°C變性2 分鐘，95°C 15秒、60°C 30秒進(jìn)行40個(gè)循環(huán)擴(kuò)增。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種碳青霉烯酶肺炎克雷伯氏菌的熒光檢測(cè)試劑盒及檢測(cè)方法。所述試劑盒中特異性引物和熒光探針序列如下上游引物5′-ACT GGG CGC GCACCTA-3′，下游引物5′-TCG CTGTGC TTG TCATCC TT-3′，熒光探針5′-FAM-CCG TCT ACACCCGGG CGC C-TAMRA-3′，其中FAM為熒光報(bào)告基團(tuán)，TAMRA為熒光淬滅基團(tuán)。本發(fā)明的有益效果主要體現(xiàn)在使用本發(fā)明檢測(cè)試劑盒，碳青霉烯酶肺炎克雷伯氏菌的檢測(cè)敏感性高，特異性好，降低了常規(guī)PCR擴(kuò)增的假陽(yáng)性率；可實(shí)現(xiàn)對(duì)碳青霉烯酶肺炎克雷伯氏菌的快速、準(zhǔn)確、特異檢測(cè)。
文檔編號(hào)G01N21/64GK102002529SQ20101055497
公開(kāi)日2011年4月6日 申請(qǐng)日期2010年11月22日 優(yōu)先權(quán)日2010年11月22日
發(fā)明者張政, 程蘇云, 羅蕓, 金大智, 韓建康 申請(qǐng)人:浙江省疾病預(yù)防控制中心