Virosaine A的哌嗪基和咪唑基衍生物的組合物在抗急性痛風(fēng)藥物中的應(yīng)用
【專利摘要】本發(fā)明涉及有機(jī)合成和藥物化學(xué)領(lǐng)域，具體涉及組合物、制備方法及其在制備抗急性痛風(fēng)藥物上的用途。本發(fā)明公開了一種組合物及其制備方法。藥理學(xué)實(shí)驗(yàn)表明，本發(fā)明的組合物具有抗急性痛風(fēng)的作用，具有開發(fā)抗急性痛風(fēng)藥物的價(jià)值。
【專利說明】
Vi rosa i ne A的哌嗪基和咪唑基衍生物的組合物在抗急性痛 風(fēng)藥物中的應(yīng)用
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明涉及有機(jī)合成和藥物化學(xué)領(lǐng)域，具體涉及組合物、制備方法及其用途。
【背景技術(shù)】
[0002] 痛風(fēng)（gouty)，又稱痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎（gouty arthritis)，是體內(nèi)噪呤代謝紊亂所致 的疾病，表現(xiàn)為血中尿酸過多，易于使尿酸鹽(MSU)在關(guān)節(jié)等組織析出結(jié)晶。痛風(fēng)的急性發(fā) 作是由于沉積在關(guān)節(jié)的MSU引起中性粒細(xì)胞局部浸潤(rùn)和炎性反應(yīng)。
[0003] 西藥在痛風(fēng)急性發(fā)作期選用三種藥:秋水仙堿、非留體抗炎藥和腎上腺皮質(zhì)激素。 秋水仙堿的作用機(jī)制是與中性粒細(xì)胞的微管蛋白結(jié)合，從而妨礙粒細(xì)胞的活動(dòng)，抑制粒細(xì) 胞浸潤(rùn)。非甾體抗炎藥如吲哚美辛，抑制環(huán)氧酶（C0X)活性而發(fā)揮抗炎作用，以及選擇性 C0X2抑制藥。它們雖然消炎止痛作用快，但毒副作用也相當(dāng)明顯，如秋水仙堿的有效劑量與 產(chǎn)生腹瀉等胃腸道癥狀的劑量相近，非留體抗炎藥在有活動(dòng)性消化性潰瘍、胃腸道出血情 況下絕對(duì)禁用，而保泰松用藥短至3周也可致嚴(yán)重的粒細(xì)胞減少癥或再生障礙性貧血。
[0004] 從天然產(chǎn)物中尋找化合物或先導(dǎo)化合物并進(jìn)行結(jié)構(gòu)修飾獲得其衍生物，從而得到 高效低毒的潛在藥物最有重要價(jià)值。
[0005] 本發(fā)明涉及的化合物I是一個(gè)2012年發(fā)表（Bing-Xin Zhao et al .， 2012.Virosaines A and B,Two New Birdcage-Shaped Securinega Alkaloids with an Unprecedented Skeleton from Flueggea virosa.Organic Letters 14(2012)3096-3099)的化合物，我們對(duì)化合物I進(jìn)行了結(jié)構(gòu)修飾，獲得了兩個(gè)新的衍生物即化合物III和化 合物IV，并用化合物III和化合物IV制備了組合物并對(duì)該組合物抗抗急性痛風(fēng)活性進(jìn)行了 評(píng)價(jià)，其具有抗急性痛風(fēng)活性。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明公開了一個(gè)新的組合物，該組合物由化合物III和化合物IV組成，該組合物 中化合物III和化合物IV的質(zhì)量百分?jǐn)?shù)分別為45%和55%。
[0008] 本發(fā)明公開的組合物可以制成藥學(xué)上可接受的鹽或藥學(xué)上可接受的載體。
[0009] 本發(fā)明用尿酸鈉(MSU)致人血管內(nèi)皮細(xì)胞(HUVEC)損傷的急性痛風(fēng)模型評(píng)價(jià)顯示， 本發(fā)明組合物對(duì)MSU致HUVEC損傷具有保護(hù)作用，并抑制ICAM-1表達(dá)，可用于制備治療急性 痛風(fēng)炎癥藥物。本發(fā)明的目的在于提供本發(fā)明組合物在醫(yī)學(xué)中的新用途，具體地說是涉及 本發(fā)明組合物在制備治療急性痛風(fēng)藥物中的應(yīng)用。
[0010] 本發(fā)明的目的是通過以下的技術(shù)方案來實(shí)現(xiàn)的：
[0011] 現(xiàn)代醫(yī)學(xué)病理研究說明，痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎是MSU引起中性粒細(xì)胞局部浸潤(rùn)和炎性反 應(yīng)，急性痛風(fēng)產(chǎn)生的本質(zhì)是中性粒細(xì)胞(PMN)-血管內(nèi)皮細(xì)胞(HUVEC)黏連增強(qiáng)(Terkeltaub R，et al.The murine homolog of the interleukin-8receptorcxcr-2is essential for the occurrence of neutrophilic inflammation in air pouch model of acute urate crystal-induced gouty synovitis.Arthritis Rheum，1998,41(5):900-909.)，HUVEC損 傷，其分子生物學(xué)基礎(chǔ)在于PMN與HUVEC表面黏附分子的相互作用（FujiwaraY，et al.Interleukin-8stimulates leukocyte migration across amonolayer of cultured rabbit NF_a，IL-10，IL-8，and IL-lrain Monosodium Urate Crystal induced rabbit arthritis.Labinvest，19998,78(5): 559-569.)，其中細(xì)胞間黏附分子-1(ICAM-1)與粘附 功能關(guān)系最密切，是急性痛風(fēng)炎癥的重要指標(biāo)之一(張春，唐怡，劉軍，等.痛風(fēng)靈方對(duì)尿酸 鈉致大鼠模型關(guān)節(jié)軟組織ICAM-1表達(dá)的影響，重慶醫(yī)學(xué)，2002,31(12): 1211-1213.)。
[0012 ] 因此，針對(duì)急性痛風(fēng)MSU致HUVEC損傷，I CAM-1表達(dá)增多的病理特征，本發(fā)明用MSU 致HUVEC損傷的體外急性痛風(fēng)模型(楊妍華，尹蓮，王明艷，等.尿酸鈉誘導(dǎo)HUVEC損傷的急性 痛風(fēng)模型研究，中華中醫(yī)藥學(xué)刊，2010,28(3):592-594.)，評(píng)價(jià)本發(fā)明組合物抗急性痛風(fēng)炎 癥活性。MSU致人血管內(nèi)皮細(xì)胞(HUVEC)損傷的急性痛風(fēng)模型評(píng)價(jià)顯示，本發(fā)明組合物對(duì)MSU 致HUVEC損傷具有保護(hù)作用，并抑制ICAM-1表達(dá)。
[0013]有益效果
[0014]研究結(jié)果表明，用MSU致HUVEC損傷的急性痛風(fēng)模型評(píng)價(jià)顯示，本發(fā)明組合物可保 護(hù)MSU致HUVEC損傷，減少細(xì)胞凋亡，提高細(xì)胞活性，抑制ICAM-1表達(dá)，具有抗急性痛風(fēng)炎癥 的活性，本發(fā)明組合物可用于制備治療急性痛風(fēng)炎癥藥物。
[0015]以下通過實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)的說明，但本發(fā)明的保護(hù)范圍不受具體實(shí) 施例的任何限制，而是由權(quán)利要求加以限定。
【具體實(shí)施方式】
[0016] 實(shí)施例1化合物Virosaine A的制備
[0017] 化合物Virosaine A(I)的制備方法參照Bing-Xin Zhao等人發(fā)表的文獻(xiàn)(Bing-Xin Zhao et al.,2012.Virosaines A and B,Two New Birdcage-Shaped Securinega Alkaloids with an Unprecedented Skeleton from Flueggea virosa.Organic Letters 14(2012)3096-3099)的方法。
[0019] 實(shí)施例2 Virosaine A的0-溴乙基衍生物（II)的合成
[0020] 將化合物I (235mg，1. OOmmo 1)溶于20mL苯，向溶液中加入四丁基溴化銨（TBAB) (0.088)，1，2-二溴乙烷(3.76(^，20.00臟〇1)和51^的50%氫氧化鈉溶液?；旌衔镌?5攝氏 度攪拌Shdh之后將反應(yīng)液倒入冰水中，立即用二氯甲烷萃取兩次，合并有機(jī)相溶液。然后 對(duì)有機(jī)相溶液依次用水和飽和食鹽水洗滌3次，再用無水硫酸鈉干燥，最后減壓濃縮去除溶 劑得到產(chǎn)物粗品。產(chǎn)物粗品用硅膠柱層析純化(流動(dòng)相為:石油醚/丙酮=100:1. 〇，v/V)，收 集棕色集中洗脫帶并揮去溶劑即得到化合物II的棕色粉末(26lmg，78% )。
[0021] 4 MMR(500MHz，DMS0-d6)S5.91(s，lH)，4.07(S，1H)，3.81(s，2H)，3.59(S，1H)， 3.43(s，2H)，3.33(s，lH)，2.26(s，lH)，1.58(d，J=9.8Hz，3H)，1.41(s，2H).
[0022] 13C 匪R(125MHz，DMS0-d6)Sl71.81(s),106.71(s)，79.95(s)，74.33(s),69.81 (s),66.68(s),44.21(s),35.56(s),33.28(s),25.85(s),21.88(s).
[0023] HRMS(ESI)m/z[M+H]+calcd for Ci4Hi7BrN〇4:342.0341 ；found 342.0343.
[0025] 實(shí)施例3 Virosaine A的0_(哌嗪基）乙基衍生物（III)的合成 [0026] 將化合物II(17lmg，0.5mmo 1)溶于20mL乙腈當(dāng)中，向其中加入無水碳酸鉀(690mg， 5.0mmol)，碘化鉀（168mg，1 .Ommol)和無水哌嗪（3446mg，40mmol)，混合物加熱回流3h。反應(yīng) 結(jié)束后將反應(yīng)液倒入冰水中，用等量二氯甲烷萃取2次，合并有機(jī)相。依次用水和飽和食鹽 水洗滌合并之后的有機(jī)相，再用無水硫酸鈉干燥，減壓濃縮去除溶劑得到產(chǎn)物粗品。產(chǎn)物粗 品用硅膠柱層析純化(流動(dòng)相為:石油醚/丙酮= 100: l.〇，v/v)，收集棕色集中洗脫帶并揮 去溶劑即得到化合物III的淡棕色固體(123.2mg，71 % )。
[0027] MMR(500MHz，DMS0-d6)S5.90(s，lH)，4.04(s，lH)，3.59(s，lH)，3.50(s，2H)， 3.40(d，J=65.9Hz，lH)，2.64(s，4H)，2.54(s，2H)，2.31(s，4H)，2.22(s，lH)，1.62(s，2H)， 1.56(s，lH)，1.43(s，2H)，0.97(s，lH).
[0028] 13C NMR(125MHz，DMS0-d6)Sl71.84(s)，106.72(s)，79.94(s)，74.33(s)，66.72(d， J=9.2Hz),54.45(s),54.16(s),45.25(s),44.20(s),35.56(s),25.86(s),21.87(s).
[0029] HRMS(ESI):m/z[M+H].calcd for Ci8H26N3〇4:348.1923;found:348.1927。
[0032] 實(shí)施例4 Virosaine A的0_(咪唑基）乙基衍生物（IV)的合成
[0033] 將化合物II(17lmg，0.5mmo 1)溶于25mL乙腈當(dāng)中，向其中加入無水碳酸鉀(690mg， 5 ? Ommo 1)，碘化鉀（2 5 2mg，1 ? 5mmo 1)和咪唑（8 7 Omg，1 Ommo 1)，混合物加熱回流2h。反應(yīng)結(jié)束 后將反應(yīng)液倒入25mL冰水中，用等量二氯甲烷萃取3次，合并有機(jī)相。依次用水和飽和食鹽 水洗滌合并之后的有機(jī)相，再用無水硫酸鈉干燥，減壓濃縮去除溶劑得到產(chǎn)物粗品。產(chǎn)物粗 品用硅膠柱層析純化(流動(dòng)相為:石油醚/丙酮= 100:0.3，v/v)，收集棕色集中洗脫帶并揮 去溶劑即得到化合物IV的淡棕色固體(144. lmg，71 % )。
[0034] XH NMR(500MHz,DMS0-d6)87.86(s,lH),7.12(s,lH),6.71(s,lH),5.99(s,lH), 4.09(s,lH),3.89(d,J=16.4Hz,2H),3.80(s,2H),3.58(s,lH),3.35(s,lH),2.31(s,lH), 1.68(s,lH),1.58(s,2H),1.44(s,2H).
[0035] 13C NMR(125MHz,DMS0-d6)13C 匪R(125MHz，Common 匪R Solvents)Sl71.82(s), 139.64(s),128.67(s),119.31(s),106.70(s),79.92(s),74.31(s),67.61(s),66.66(s), 44.20(s),43.75(s),35.52(s),25.85(s),21.86(s).
[0036] HRMS(ESI):m/z[M+H]+calcd for Ci7H2〇N3〇4:330.1454;found:330.1458。
[0038]實(shí)施例5組合物抗急性痛風(fēng)炎癥實(shí)驗(yàn) [0039] 1、溶液配制
[0040] 5g尿酸加1000ml蒸餾水煮沸，加5%NaOH溶液調(diào)PH 7.4，攪拌，冷卻析晶制成尿酸 鈉結(jié)晶(MSU)。將制好的MSU 10mg高壓滅菌，加不含血清的DMEM培養(yǎng)液10ml，研磨配成lmg/ ml的DMEM溶液。實(shí)驗(yàn)時(shí)，此溶液再加DMEM培養(yǎng)液配成不同濃度DMEM的MSU溶液。
[00411 組合物的制備：將研磨之后過200目網(wǎng)的45mg化合物III的粉末和研磨之后過200 目網(wǎng)的55mg化合物IV的粉末裝入帶蓋的小管中并用渦輪攪拌儀混合即得到100mg組合物， 使用時(shí)用水溶解這l00mg的組合物即得到組合物的溶液。
[0042] 組合物、化合物III或者化合物IV 2.5mg，用二甲基亞砜(DMS0)溶解，DMS0終濃度〈 0.02 %，再加無血清的DMEM培養(yǎng)液，配制成濃度25ug/ml。
[0043] 2、血管內(nèi)皮細(xì)胞的體外培養(yǎng)
[0044]人臍靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞HUVEC株由南京中醫(yī)藥大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院提供，細(xì)胞經(jīng)支原 體檢測(cè)，無支原體污染，細(xì)胞經(jīng)0.25%胰蛋白酶消化，含10 %小牛血清的DMEM培養(yǎng)液中和， 離心（1000r/min X 6min)，去上清液，加含10%小牛血清的DMEM培養(yǎng)液，移入細(xì)胞培養(yǎng)瓶中， 放37 °C、5 % C02培養(yǎng)箱中傳代培養(yǎng)。
[0045] 3、對(duì)MSU刺激HUVEC活力的影響
[0046] HUVEC在培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)，待生長(zhǎng)至70 %~80 %融合時(shí)，以0.25%胰蛋白酶消化、離 心，10 %小牛血清DMEM培養(yǎng)液洗滌3次，用10 %小牛血清DMEM培養(yǎng)液調(diào)成4 X 104/ml細(xì)胞懸 液，植入96孔板(每孔200ul)，培養(yǎng)24小時(shí)后輕吸出原培養(yǎng)液，進(jìn)行以下實(shí)驗(yàn)，每組各8孔，具 體分組及加液如下：對(duì)照組（200ul DMEM培養(yǎng)液）、模型組（100ug/ml MSU溶液）、干預(yù)組 (100ug/ml MSU溶液+25ug/ml的組合物或者化合物），加液后繼續(xù)放37 °C、5 % C02培養(yǎng)箱中 培養(yǎng)24小時(shí)，收集上清液，剩余的HUVEC用于測(cè)定細(xì)胞活性，每孔再加5mg/ml MTT液20ul，繼 續(xù)放37 °C、5 %⑶2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4小時(shí)后，棄MTT液，加入二甲基亞砜200ul溶解，震蕩，于酶 標(biāo)儀讀取吸光度值，波長(zhǎng)490nm〇
[0047] 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，細(xì)胞活力（％ )=實(shí)驗(yàn)組吸光度值/對(duì)照組吸光度值X 100 %，結(jié) 果見表1。
[0048]與對(duì)照組相比，模型組細(xì)胞活力顯著減小(P〈0.05)，組合物干預(yù)后細(xì)胞活力顯著 提高(P〈0.05)，并強(qiáng)于對(duì)照組，而化合物III和化合物IV無此活性。
[0049] 表1組合物對(duì)MSU刺激的血管內(nèi)皮細(xì)胞活力的影響（X)
[0052] 注:與模型組相比，*P〈0.05;與對(duì)照組相比，AP〈0.05
[0053] 4對(duì)ICAM-1表達(dá)影響
[0054]將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HUVEC用0.25 %的胰蛋白酶消化，輕輕吹打，制成細(xì)胞懸液， 調(diào)整細(xì)胞密度為5 X 109/L，接種于細(xì)胞培養(yǎng)瓶中。待細(xì)胞長(zhǎng)滿后(約24h)，棄去上清液，分為 下列組:對(duì)照組、模型組（l〇〇ug/ml MSU溶液）、干預(yù)組（100ug/ml MSU溶液+25ug/ml組合物 或者化合物），繼續(xù)培養(yǎng)24小時(shí)，PBS收集細(xì)胞，離心去上清，加入⑶54單克隆抗體，30min后， PBS洗滌，重懸細(xì)胞，應(yīng)用流式細(xì)胞儀檢測(cè)其陽性細(xì)胞百分率(n= 10000 )，重復(fù)3次，結(jié)果見 表2。
[0055] 表2組合物對(duì)MSU刺激的血管內(nèi)皮細(xì)胞ICAM-1表達(dá)的影響（歹）
[0057] 注:與模型組相比，*P〈0.05;與對(duì)照組相比，AP〈0.05
[0058] 結(jié)果顯示，空白組HUVEC幾乎無ICAM-1表達(dá)，模型組ICAM-1的表達(dá)最高，與模型組 相比，組合物對(duì)I CAM-1的表達(dá)有顯著的抑制作用，而化合物III和化合物IV無顯著的抑制作 用。
[0059] 結(jié)論：用MSU致HUVEC損傷的急性痛風(fēng)模型評(píng)價(jià)顯示，組合物可保護(hù)MSU致HUVEC損 傷，減少細(xì)胞凋亡，提高細(xì)胞活性，抑制ICAM-1表達(dá)，具有抗急性痛風(fēng)炎癥的活性，組合物可 用于制備治療急性痛風(fēng)炎癥藥物。而化合物III和化合物IV不能保護(hù)MSU致HUVEC損傷，不能 減少細(xì)胞凋亡，不能提高細(xì)胞活性，不能抑制ICAM-1表達(dá)，不具有抗急性痛風(fēng)炎癥的活性， 不能用于制備治療急性痛風(fēng)炎癥藥物。
[0060] 實(shí)施例6本發(fā)明所涉及組合物片劑的制備
[0061] 取2克組合物，加入制備片劑的常規(guī)輔料18克，混勻，常規(guī)壓片機(jī)制成100片。
[0062] 實(shí)施例7本發(fā)明所涉及組合物膠囊的制備
[0063] 取2克組合物，加入制備膠囊劑的常規(guī)輔料如淀粉18克，混勻，裝膠囊制成100粒。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種組合物，其特征為該組合物由化合物III和化合物IV組成，該組合物中化合物 III和化合物IV的質(zhì)量百分?jǐn)?shù)分別為45%和55%，2. 如權(quán)利要求1所述的組合物的制備方法，其特征為:將化合物III的粉末和化合物IV 的粉末按照質(zhì)量百分?jǐn)?shù)分別為45 %和55 %充分混合。3. 如權(quán)利要求1所述的一種組合物在治療急性痛風(fēng)藥物中的應(yīng)用。4. 如權(quán)利要求3所述的組合物在治療急性痛風(fēng)藥物中的應(yīng)用，其特征為:所述急性痛風(fēng) 是由尿酸鈉誘導(dǎo)的。5. 如權(quán)利要求3所述的組合物在治療急性痛風(fēng)藥物中的應(yīng)用，其特征為:組合物減少人 血管內(nèi)皮細(xì)胞的損傷，提高人血管內(nèi)皮細(xì)胞的活性。6. 如權(quán)利要求3所述的組合物在治療急性痛風(fēng)藥物中的應(yīng)用，其特征為:組合物減少急 性痛風(fēng)過程中ICAM-1的表達(dá)。
【文檔編號(hào)】A61P29/00GK105853428SQ201610278425
【公開日】2016年8月17日
【申請(qǐng)日】2016年4月28日
【發(fā)明人】蔣登旭
【申請(qǐng)人】鎮(zhèn)江瑪珂蕘生物醫(yī)藥科技有限公司