本發(fā)明涉及有機合成和藥物化學(xué)領(lǐng)域，具體涉及組合物、制備方法及其用途。
背景技術(shù)：
胰腺纖維化是各種原因所致慢性胰腺炎的共同特征,同時也是與其伴隨的組織病理學(xué)特點,表現(xiàn)為大量成纖維細(xì)胞增生和富含連接組織的細(xì)胞外基質(zhì)。是多種原因?qū)е乱认贀p傷修復(fù)的結(jié)果，近期發(fā)現(xiàn)胰腺星狀細(xì)胞和多種細(xì)胞因子與胰腺纖維化有關(guān)，胰腺纖維化目前發(fā)病率愈來愈高，急需研發(fā)高效低毒的抗胰腺纖維化藥物。
胰腺纖維化的治療目前已有的藥物存在毒性大、安全性低的問題，從天然產(chǎn)物中尋找化合物或先導(dǎo)化合物并進行結(jié)構(gòu)修飾獲得其衍生物，從而得到高效低毒的潛在藥物最有重要價值。
本發(fā)明涉及的化合物I是一個2009年發(fā)表(Pei Tang et al.,2009.Atropurpuran,a novel diterpene with an unprecedented pentacyclic cage skeleton,from Aconitum hemsleyanum var.atropurpureum.Tetrahedron Letters 50(2009)460–462)的化合物，我們對化合物I進行了結(jié)構(gòu)修飾，獲得了兩個新的衍生物即化合物III和化合物IV，并用化合物III和化合物IV制備了組合物并對該組合物抗胰腺纖維化活性進行了評價，其具有抗胰腺纖維化活性。
技術(shù)實現(xiàn)要素：
本發(fā)明公開了一個新的組合物，該組合物由化合物III和化合物IV組成，該組合物中化合物III和化合物IV的質(zhì)量百分?jǐn)?shù)分別為70％和30％。
本發(fā)明公開的組合物可以制成藥學(xué)上可接受的鹽或藥學(xué)上可接受的載體。
藥效學(xué)實驗表明，本發(fā)明的組合物具有較好的抗胰腺纖維化作用。本發(fā)明的藥學(xué)上可接受的鹽具有同樣的藥效。
以下通過實施例對本發(fā)明作進一步詳細(xì)的說明，但本發(fā)明的保護范圍不受具體實施例的任何限制，而是由權(quán)利要求加以限定。
具體實施方式
實施例1 化合物Atropurpuran的制備
化合物Atropurpuran(I)的制備方法參照Pei Tang等人發(fā)表的文獻(Pei Tang et al.,2009.Atropurpuran,a novel diterpene with an unprecedented pentacyclic cage skeleton,from Aconitum hemsleyanum var.atropurpureum.Tetrahedron Letters 50(2009)460–462)的方法。
實施例2 Atropurpuran的O-溴乙基衍生物(II)的合成
將化合物I(312mg，1.00mmol)溶于10mL苯，向溶液中加入四丁基溴化銨(TBAB)(0.08g)，1,2-二溴乙烷(3.760g，20.00mmol)和6mL的50％氫氧化鈉溶液?；旌衔镌?5攝氏度攪拌6h。6h之后將反應(yīng)液倒入冰水中，立即用二氯甲烷萃取兩次，合并有機相溶液。然后對有機相溶液依次用水和飽和食鹽水洗滌3次，再用無水硫酸鈉干燥，最后減壓濃縮去除溶劑得到產(chǎn)物粗品。產(chǎn)物粗品用硅膠柱層析純化(流動相為：石油醚/丙酮＝100:1.0，v/v)，收集棕色集中洗脫帶并揮去溶劑即得到化合物II的黃色粉末(309mg，74％)。
1H NMR(500MHz,DMSO-d6)δ9.86(s,1H),5.23(s,1H),4.87(s,1H),4.83(s,1H),4.39(s,1H),4.00(s,2H),3.91(s,1H),3.58(s,2H),3.01(s,1H),2.27(s,1H),2.15(d,J＝6.3Hz,2H),2.09–2.00(m,5H),1.78(dd,J＝35.2,19.2Hz,2H),1.71–1.65(m,1H),1.41(s,2H),0.99(s,3H).
13C NMR(125MHz,DMSO-d6)δ208.55(s),203.16(s),150.94(s),125.16(s),111.66(s),78.63(s),71.39(s),57.77(s),47.73(s),40.79(s),34.58(s),33.01(s),32.69(s),29.25(s),29.34(s),26.52(s),24.23(s),22.30(s),20.64(s).
HRMS(ESI)m/z[M+H]+calcd for C22H28BrO3:419.1222；found 419.1226.
實施例3 Atropurpuran的O-(苯并咪唑基)乙基衍生物(III)的合成
將化合物II(209mg，0.5mmol)溶于12mL乙腈當(dāng)中，向其中加入無水碳酸鉀(345mg，2.5mmol)，碘化鉀(84mg，0.5mmol)和苯并咪唑(4720mg，40mmol)，混合物加熱回流4h。反應(yīng)結(jié)束后將反應(yīng)液倒入冰水中，用等量二氯甲烷萃取3次，合并有機相。依次用水和飽和食鹽水洗滌合并之后的有機相，再用無水硫酸鈉干燥，減壓濃縮去除溶劑得到產(chǎn)物粗品。產(chǎn)物粗品用硅膠柱層析純化(流動相為：石油醚/丙酮＝100:0.7，v/v)，收集棕色集中洗脫帶，濃縮即得到化合物III的棕色固體(162mg,71％)。
1H NMR(500MHz,DMSO-d6)δ10.05(s,1H),8.21(s,1H),7.61(d,J＝25.0Hz,2H),7.23(s,1H),7.15(s,1H),5.14(s,1H),4.65(d,J＝10.5Hz,2H),4.39(s,1H),4.04(d,J＝5.5Hz,2H),3.86(s,2H),3.80(s,1H),2.94(s,1H),2.18(s,1H),2.06(s,1H),1.97(dd,J＝21.9,12.5Hz,4H),1.78–1.69(m,4H),1.66(s,1H),1.32(s,2H),0.90(s,3H).
13C NMR(125MHz,DMSO-d6)δ208.60(s),203.32(s),150.99(s),146.33(s),139.68(s),133.53(s),125.32(s),123.98(s),123.41(s),118.59(s),111.71(s),110.90(s),78.79(s),67.99(s),57.93(s),47.78(s),44.99(s),40.95(s),34.63(s),32.74(s),29.41(s),29.17(s),26.57(s),24.39(s),22.52(s),20.80(s).
HRMS(ESI):m/z[M+H]+calcd for C29H33N2O3:457.2491；found:457.2484。
實施例4 Atropurpuran的O-(嗎啉基)乙基衍生物的合成
將化合物II(209mg，0.5mmol)溶于15mL乙腈當(dāng)中，向其中加入無水碳酸鉀(345mg，2.5mmol)，碘化鉀(84mg，0.5mmol)和嗎啉(3484mg，40mmol)，混合物加熱回流1h。反應(yīng)結(jié)束后將反應(yīng)液倒入15mL冰水中，用等量二氯甲烷萃取2次，合并有機相。依次用水和飽和食鹽水洗滌合并之后的有機相，再用無水硫酸鈉干燥，減壓濃縮去除溶劑得到產(chǎn)物粗品。產(chǎn)物粗品用硅膠柱層析純化(流動相為：石油醚/丙酮＝100:0.5，v/v)，收集淺棕色集中洗脫帶，濃縮即得到化合物III的黃色固體(157.3mg,74％)。
1H NMR(500MHz,DMSO-d6)δ9.76(s,1H),5.13(s,1H),4.59(d,J＝10.5Hz,2H),4.30(s,1H),4.02(s,1H),3.52(d,J＝14.0Hz,6H),2.92(s,1H),2.51(s,2H),2.44(s,4H),2.10(t,J＝29.7Hz,3H),1.99–1.90(m,3H),1.72(d,J＝4.2Hz,2H),1.67(s,2H),1.62(s,1H),1.29(s,2H),0.89(s,3H).
13C NMR(125MHz,DMSO-d6)δ208.61(s),203.33(s),151.00(s),125.33(s),111.72(s),78.80(s),67.16(s),66.64(s),57.94(s),54.34(s),52.79(s),47.79(s),40.96(s),34.64(s),32.75(s),29.42(s),29.18(s),26.58(s),24.40(s),22.36(s),20.81(s).
HRMS(ESI):m/z[M+H]+calcd for C26H36N1O4:426.2644；found:426.2641。
實施例5 組合物抗胰腺纖維化活性
1材料
1.1動物Wistar大鼠，雄性，體重180-200g。
1.2組合物劑量：0.9mg/kg。
組合物的制備：將研磨之后過200目網(wǎng)的70mg化合物III的粉末和研磨之后過200目網(wǎng)的30mg化合物IV的粉末裝入帶蓋的小管中并用渦輪攪拌儀混合即得到100mg組合物，使用時用水溶解這100mg的組合物即得到組合物的溶液。
2實驗方法
2.1造模方法：Wistar大鼠以腹腔注射dl-乙硫氨酸250mg/天，連續(xù)2個月，可出現(xiàn)胰臟腺細(xì)胞減少，間質(zhì)內(nèi)脂肪及結(jié)締組織的增生。
2.2分組及給藥方法
模型大鼠隨機分為模型組，組合物0.9mg/kg組、化合物III 0.9mg/kg組和化合物IV 0.9mg/kg組，另設(shè)空白對照組。給藥組于造模開始后給藥，口服連續(xù)30天；60天時解剖動物。
2.3檢測指標(biāo)
2.3.1實驗結(jié)束時取胰臟稱重。
2.3.2胰臟羥脯氨酸含量測定取100mg樣本在水中勻漿，110℃10N HCl中水解20小時。HCl用氮氣揮發(fā)，水解產(chǎn)物用雙蒸水溶解后過濾。取0.5ml液體與3ml枸櫞酸磷酸緩沖液(0.15M枸櫞酸加0.6M磷酸氫二鈉)和0.5ml溶于9M磷酸的1M過碘酸混合。加1.75ml提取緩沖液(5份甲苯：5份2-甲基-1-丙醇：2份1-丙醇)，震蕩30min，離心。組織相(0.6ml)與Ehrlich,s試劑混合放置15min。在565nm測定吸收度，用4-羥-1-脯氨酸制作標(biāo)準(zhǔn)曲線計算濃度，含量以ug/g組織表示。
2.3.3組織學(xué)檢查胰臟組織用10％福爾馬林固定，石蠟包埋，染色后鏡檢。對纖維化情況評分(0-3分)。
3結(jié)果
3.1組合物對大鼠胰臟臟器系數(shù)的影響
實驗結(jié)束時，將大鼠處死、解剖，稱量體重和胰臟重并計算其與體重的比值(胰臟臟器系數(shù))，結(jié)果見表1。組合物對胰臟臟器系數(shù)的影響，與模型組比較有顯著性差異。化合物III和化合物IV對胰臟臟器系數(shù)的影響，與模型組比較無顯著性差異。
表1
*表示p<0.05，與模型組比較
3.2胰臟羥脯氨酸含量測定
實驗結(jié)束時，對各組大鼠進行肺部羥脯氨酸含量測定，結(jié)果如表2。組合物對羥脯氨酸含量的影響，與模型組比較有顯著性差異。化合物III和化合物IV對羥脯氨酸含量的影響，與模型組比較無顯著性差異。
表2
*表示p<0.05，與模型組比較
3.3組織學(xué)檢查
實驗結(jié)束時，將大鼠處死、解剖；標(biāo)本常規(guī)包埋、固定、HE染色，鏡檢。
結(jié)果：模型組第60天可見胰導(dǎo)管周圍嚴(yán)重炎癥反應(yīng)；嗜中粒細(xì)胞核淋巴細(xì)胞浸潤，間質(zhì)水腫，出血以及偶見胰泡細(xì)胞壞死；胰泡細(xì)胞消失位置及胰泡間出現(xiàn)纖維化。
組合物可減少炎癥反應(yīng)和纖維化。評分結(jié)果見表3。組合物對評分的影響，與模型組比較有顯著性差異。
表3
*表示p<0.05，與模型組比較；空白對照組的炎癥細(xì)胞浸潤和纖維化評分都為0.
結(jié)論：本發(fā)明通過組合物對大鼠胰腺纖維化的影響，證實了組合物具有抗胰腺纖維化的作用。因此，組合物可作為活性成分用于制備抗胰腺纖維化的藥物。而化合物III和化合物IV無此活性，不能用于制備抗胰腺纖維化的藥物。
實施例6 本發(fā)明所涉及組合物片劑的制備
取2克組合物，加入制備片劑的常規(guī)輔料18克，混勻，常規(guī)壓片機制成100片。
實施例7 本發(fā)明所涉及組合物膠囊的制備
取2克組合物，加入制備膠囊劑的常規(guī)輔料如淀粉18克，混勻，裝膠囊制成100粒。