3，4-二羥基苯甲醛制備治療或/和預(yù)防腦缺血再灌注損傷的藥物的用圖
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及3,4_二羥基苯甲醛用于制備治療或/和預(yù)防腦缺血再灌注損傷的藥 物的用途，屬于醫(yī)藥領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002] 腦缺血一定時(shí)間恢復(fù)血液供應(yīng)后，其功能不但未能恢復(fù)，卻出現(xiàn)了更加嚴(yán)重的腦 功能障礙，稱為腦缺血再灌注（cerebral ischemia-reperfusion，CIR)損傷。目前，抑制再 灌注損傷已成為治療缺血性腦血管病的重要環(huán)節(jié)。
[0003] 腦缺血再灌注損傷是一種復(fù)雜的病理生理過(guò)程，主要與自由基過(guò)度形成、興奮性 氨基酸毒性作用、細(xì)胞內(nèi)鈣超載、炎性反應(yīng)等多種機(jī)制有關(guān)。近年來(lái)針對(duì)腦缺血再灌注損傷 的治療研究已取得一定成效，臨床上往往采用亞低溫治療、抗炎治療、抑制細(xì)胞凋亡等手段 聯(lián)合治療，共同減輕腦損傷（陳玉敏等，腦缺血再灌注損傷機(jī)制與治療現(xiàn)狀[J]，醫(yī)學(xué)研究 與教育，2012, 29:47-54)。然而，由于病因較多、發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，防治腦缺血再灌注損傷尚缺 乏有效的藥物和方法，研制有效的藥物迫在眉睫。
[0004] 3,4_二羥基苯甲醛（又名原兒茶醛）是一種重要的醫(yī)藥中間體，可用于合成多種 抗菌素和消炎藥物，廣泛存在于天然產(chǎn)物中（如天麻、丹參等），并且可以通過(guò)簡(jiǎn)單的工藝 步驟制備得到。近年來(lái)對(duì)原兒茶醛藥理活性及其作用機(jī)制等方面的研究表明，它具有抗動(dòng) 脈粥樣硬化、保護(hù)心肌、抗血栓形成、神經(jīng)保護(hù)、抗膿血、抗病毒、抗纖維化等廣泛的藥理活 性（張翠英等，原兒茶醛的藥理研究進(jìn)展[J]，中國(guó)實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志，2014,19 (23) :338~ 342) 〇
[0005] 然而，迄今尚未有關(guān)于3,4_二羥基苯甲醛具有防治腦缺血再灌注損傷藥理作用 的公開(kāi)報(bào)道。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明的目的在于提供3,4-二羥基苯甲醛用于制備治療或/和預(yù)防腦缺血再灌 注損傷的藥物的用途。
[0007] 本發(fā)明提供了 3,4-二羥基苯甲醛用于制備治療或/和預(yù)防腦缺血再灌注損傷的 藥物的用途。
[0008] 進(jìn)一步的，所述的藥物是治療或/和預(yù)防神經(jīng)功能損傷、血腦屏障損傷或一氧化 氮（N0)毒性反應(yīng)中一種或幾種疾病的藥物。
[0009] 更進(jìn)一步的，所述的藥物是下調(diào)腦組織Caspase-3、Caspase-9、AQP-4或MMP-3中 一種或幾種蛋白表達(dá)的藥物；所述的藥物是升高腦組織Occludin、Claudin-5或GFAP中一 種或幾種蛋白表達(dá)的藥物；所述的藥物是降低腦組織中N0含量的藥物；所述的藥物是抑制 神經(jīng)型一氧化氮合酶（nNOS)、誘導(dǎo)型一氧化氮合酶（iNOS)中一種或兩種酶活性的藥物。
[0010] 進(jìn)一步的，所述的藥物是由有效量的3,4_二羥基苯甲醛為活性成分，加入藥學(xué)上 可接受的輔料或輔助性成分制備而成的制劑。
[0011] 優(yōu)選的，所述的制劑為口服制劑。
[0012] 優(yōu)選的，所述的制劑為膠囊劑、顆粒劑或片劑。
[0013] 本發(fā)明還提供了一種治療或/和預(yù)防腦缺血再灌注損傷的藥物組合物，它是以3， 4-二羥基苯甲醛為活性成分，加上藥學(xué)上可接受的輔料制備而成的制劑。
[0014] 進(jìn)一步的，所述制劑為口服制劑。
[0015] 更進(jìn)一步的，所述口服制劑為膠囊劑、顆粒劑或片劑。
[0016] 本發(fā)明提供了 3,4_二羥基苯甲醛用于制備治療或/和預(yù)防腦缺血再灌注損傷的 藥物的用途。藥效實(shí)驗(yàn)表明，該化合物具有顯著的保護(hù)血腦屏障、保護(hù)神經(jīng)功能及抑制N0 毒性反應(yīng)發(fā)生的作用，從而達(dá)到治療或/和預(yù)防腦缺血再灌注損傷的效果。相較于目前臨 床上常用的同類藥物和治療手段，3,4-二羥基苯甲醛來(lái)源廣泛、價(jià)格低廉、療效顯著，具有 良好的臨床應(yīng)用前景。
[0017] 顯然，根據(jù)本發(fā)明的上述內(nèi)容，按照本領(lǐng)域的普通技術(shù)知識(shí)和慣用手段，在不脫離 本發(fā)明上述基本技術(shù)思想前提下，還可以做出其它多種形式的修改、替換或變更。
[0018] 以下通過(guò)實(shí)施例形式的【具體實(shí)施方式】，對(duì)本發(fā)明的上述內(nèi)容再作進(jìn)一步的詳細(xì)說(shuō) 明。但不應(yīng)將此理解為本發(fā)明上述主題的范圍僅限于以下的實(shí)例。凡基于本發(fā)明上述內(nèi)容 所實(shí)現(xiàn)的技術(shù)均屬于本發(fā)明的范圍。
【附圖說(shuō)明】
[0019] 圖1EB標(biāo)準(zhǔn)曲線。
[0020] 圖2 BCA法測(cè)定蛋白濃度的標(biāo)準(zhǔn)曲線
[0021] 圖3 nNOS試劑盒的標(biāo)準(zhǔn)曲線
[0022] 圖4 iNOS試劑盒的標(biāo)準(zhǔn)曲線
[0023] 圖5 3, 4-二羥基苯甲醛對(duì)大鼠腦組織EB含量的影響
[0024] 圖6 3, 4-二羥基苯甲醛對(duì)大鼠腦組織EB滲出情況的影響
[0025] 圖7 3, 4-二羥基苯甲醛對(duì)大鼠缺血側(cè)腦組織AQP-4表達(dá)的影響
[0026] 圖8 3, 4-二羥基苯甲醛對(duì)大鼠缺血側(cè)腦組織Occludin表達(dá)的影響
[0027] 圖9 3,4-二羥基苯甲醛對(duì)大鼠缺血側(cè)腦組織(：1 &11乜11-5表達(dá)的影響
[0028] 圖10 3, 4-二羥基苯甲醛對(duì)大鼠缺血側(cè)腦組織MMP-3表達(dá)的影響
[0029] 圖11 3, 4-二羥基苯甲醛對(duì)大鼠缺血側(cè)腦組織GFAP表達(dá)的影響
[0030] 圖12 3, 4-二羥基苯甲醛對(duì)大鼠神經(jīng)病學(xué)評(píng)分的影響
[0031] 圖13 3, 4-二羥基苯甲醛對(duì)大鼠缺血側(cè)腦組織Caspase-3表達(dá)的影響
[0032] 圖14 3, 4-二羥基苯甲醛對(duì)大鼠缺血側(cè)腦組織Caspase-9表達(dá)的影響
[0033] 圖15 3, 4-二羥基苯甲醛對(duì)大鼠腦組織N0含量及N0S活性的影響
【具體實(shí)施方式】
[0034] 本發(fā)明【具體實(shí)施方式】中使用的原料、試劑及設(shè)備均為已知產(chǎn)品，通過(guò)購(gòu)買(mǎi)市售產(chǎn) 品獲得。
[0035] 以下通過(guò)實(shí)驗(yàn)例證明本發(fā)明的有益效果。
[0036] 1.實(shí)驗(yàn)材料
[0037] 1· 1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物
[0038] 成年健康雄性SD大鼠，體重250_300g，SPF級(jí)，由四川省醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究 所提供，生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK(川）2008-24,合格證號(hào)：0017670。
[0039] 1.2實(shí)驗(yàn)藥品
[0040] 3,4_二羥基苯甲醛，由中科院昆明植物研究所從天麻EtOAc層提取物中分離精制 而得的透明狀的固體結(jié)晶，結(jié)構(gòu)確定后本實(shí)驗(yàn)所用的是購(gòu)自美國(guó)Sigma公司的單體成分。
[0041] 此外，也可以采用文獻(xiàn)報(bào)道的其他方法從含有3,4_二羥基苯甲醛的植物（如丹 參）中提取3,4-二羥基苯甲醛；或者直接購(gòu)買(mǎi)市售產(chǎn)品（CAS號(hào)：139-85-5)。
[0042] 1. 3主要試劑配制
[0043] 1.3.10.9%生理鹽水的配制：氯化鈉4.58，加雙蒸水至50〇1^，充分搖勻放4°(：冰 箱備用。
[0044] 1. 3. 2生理鹽水（0. 9% )加肝素（5單位/ml)溶液的配制：量取0. 9%生理鹽水 1000mL，滴加2500U肝素800uL，充分搖勻放4°C冰箱備用。
[0045] 1. 3. 3 2% EB溶液的配制：精密稱取EB2g，加入生理鹽水容量瓶中定容至100mL， 攪拌至完全溶解。
[0046] 1. 3. 4肝素化生理鹽水灌注液：氯化鈉（分析純）9g，注射用肝素鈉25000U以蒸餾 水800mL完全混溶后以定容瓶定容至1000mL，分裝于500mL無(wú)菌瓶中備用。
[0047] 1. 3. 5電鏡心臟灌流固定液的配制（4%多聚甲醛+0. 5%戊二醛）：溶解2g多聚甲 醛于25mL雙蒸水中，80°C水浴，搖動(dòng)使之溶化后加1-3滴NaOH(lM)，使溶液澄清。冷卻后加 lmL 25 %戊二醛（電鏡專用），再加24mL的PBS (0· 2M)，調(diào)pH備用。
[0048] 1. 3. 6Western_Blot實(shí)驗(yàn)中所需配制的試劑
[0049] 1. 3. 6. 1 10 %過(guò)硫酸胺（AP)
[0050] 過(guò)硫酸胺0· lg
[0051] 蒸餾水lmL
[0052] 現(xiàn)用現(xiàn)配，可先將過(guò)硫酸胺干粉稱好分量后放在1. 5mL離心管中（一次性多稱幾 管-20°C保存?zhèn)溆茫尤胝麴s水溶解即可，1周內(nèi)可以用完的放入4°C保存，將剩余的分裝， 放入-20°C冰箱保存。
[0053] 1. 3. 6. 2 4X 上樣緩沖液（Loading buffer)
[0054] 1.0 moL/L TrisMICLipUB. 8) 2mL· SDS 0.8g 溴酚藍(lán) 0.04g 甘油 4mL
[0055] 去離子水定容至10mL?；旃春?，分裝于1. 5mL離心管中，每個(gè)lmL，4°C保存。使用 時(shí)稀釋成IX。
[0056] 1. 3. 6. 3 1. 0moL/L 二硫蘇糖醇（DTT) (10X)
[0057] 用20mL 0. 01moL/L乙酸鈉溶液（pH5. 2)溶解3. 09g DTT，分裝成lmL小份儲(chǔ)存 于-20 °C，使用時(shí)稀釋成IX。
[0058] 例如：上樣量20 μ L-4X上樣緩沖液5 μ L+DTT 2 μ L+樣本蛋白13 μ L
[0059] 1· 3· 6· 4 5X電泳液緩沖液
[0060] Tris (Ml21. 14) 15. lg 甘氨酸(MW75. 07) 94g SDS 5g 蒸饋水.午：