一種水基膠中異噻唑啉酮?dú)⒕鷦y(cè)定的液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及水基膠中殺菌防腐劑理化檢驗(yàn)技術(shù)領(lǐng)域，具體為一種水基膠中異噻唑 啉酮?dú)⒕鷦y(cè)定的液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法。
【背景技術(shù)】
[0002] [1] 2-甲基-4-異噻唑啉-3-酮（MI)、5-氯-2-甲基-4-異噻唑啉-3-酮（CMI) 和1，2-苯并異噻啉-3-酮（BIT)，屬于異噻唑啉酮及其衍生物類(lèi)，是一類(lèi)新型的高效廣譜防 腐殺菌劑，廣泛用于化妝品、涂料等行業(yè)防腐殺菌。異噻唑啉酮類(lèi)化合物具有細(xì)胞毒性和神 經(jīng)毒性，對(duì)皮膚有致敏反應(yīng)，會(huì)出現(xiàn)眼睛、皮膚接觸發(fā)生過(guò)敏或皮炎等癥狀，還可導(dǎo)致皮膚 灼傷或哮喘。因此，各國(guó)在玩具、食品、化妝品等領(lǐng)域?qū)ι鲜霎愢邕蜻?lèi)殺菌劑的用量、殘 留量和特定迀移量有嚴(yán)格的限制，如歐盟玩具協(xié)調(diào)標(biāo)準(zhǔn)EN71-9-2005 (MI、CMI和BIT限量分 別為10、10和5mg/kg，并且MI和BIT總限量為15mg/kg)、我國(guó)GB 9685-2008《食品容器、 包裝材料用添加劑使用衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)》(MI、CMI和BIT的特定迀移限量分別為0. 5mg/kg、不能檢 出和1. 2mg/kg)，我國(guó)和歐盟化妝品法規(guī)對(duì)MI和CMI的限量均分別為0. 01 %和0. 0015%。
[0003] [2]水基膠通常用于各種包裝紙的粘結(jié)部位，如果水基膠中含有異噻唑啉酮并長(zhǎng) 期接觸，存在因接觸包裝紙等而間接轉(zhuǎn)移至人體的風(fēng)險(xiǎn)，會(huì)對(duì)人體健康會(huì)造成安全隱患。因 此，建立快速、靈敏、準(zhǔn)確的分析方法來(lái)分析檢測(cè)水基膠中的異噻唑啉酮?dú)⒕鷦埩袅恐陵P(guān) 重要。
[0004] [3]近年來(lái)，液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜（LC-MS/MS)技術(shù)快速發(fā)展，已經(jīng)越來(lái)越多地被應(yīng) 用于化妝品、環(huán)境等領(lǐng)域樣本中MI、CMI和BIT等異噻唑啉酮類(lèi)防腐劑含量的檢測(cè)，與氣相 色譜-質(zhì)譜和液相色譜-紫外檢測(cè)相比，LC-MS/MS更加適合于復(fù)雜體系中異噻唑啉酮類(lèi)化 合物的測(cè)定，其抗干擾能力更強(qiáng)，具有更高的靈敏度和選擇性，可以大大減少假陽(yáng)性的檢測(cè) 結(jié)果，對(duì)樣品前處理的要求更低，而且分析時(shí)間短，靈敏度高，因此受到了廣泛的關(guān)注。
[0005] [4]目前報(bào)道的異噻唑啉酮?dú)⒕鷦↙C-MS/MS)法主要檢測(cè)對(duì)象有玩具、化妝品、 食品包裝紙等，未見(jiàn)有水基膠中異噻唑啉酮?dú)⒕鷦㎜C-MS/MS法的文獻(xiàn)報(bào)道。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明的目的在于提供一種利用LC-MS/MS來(lái)測(cè)定水基膠中異噻唑啉酮?dú)⒕鷦┑?定性定量測(cè)定方法，該方法具有操作簡(jiǎn)便、分析速度快、靈敏度高、準(zhǔn)確性和穩(wěn)定性好，特別 適用于批量樣品分析的水基膠中MI、CMI和BIT的檢測(cè)。
[0007] 本發(fā)明的目的是通過(guò)以下技術(shù)方案來(lái)實(shí)現(xiàn)的：稱(chēng)取水基膠，先加入一定體積的水 進(jìn)行分散，再加入甲醇振蕩萃取，離心、稀釋后，以Luna 3u PFP(2)色譜柱為分析柱，以甲醇 和水混合液作為流動(dòng)相，采用LC-MS/MS測(cè)定水基膠中MI、CMI和BIT的含量，以同位素內(nèi)標(biāo) 法定量。
[0008] 本發(fā)明提供的方法包括：稱(chēng)取水基膠，先加入一定體積的水進(jìn)行分散，再加入甲醇 振蕩萃取，離心、稀釋后，以Luna 3u PFP(2)色譜柱為分析柱，以甲醇和水混合液作為流動(dòng) 相，采用LC-MS/MS測(cè)定水基膠中MI、CMI和BIT的含量，以同位素內(nèi)標(biāo)法定量。
[0009] 優(yōu)選的方案為：①稱(chēng)取0. 2~0. 3g水基膠，先加入2~5mL的水進(jìn)行分散，再加入 甲醇振蕩萃取，取1~5ml溶液于離心管中，以10000~150000g離心10~20min，稀釋和 加入內(nèi)標(biāo)后，經(jīng)0.22 ym有機(jī)相濾膜過(guò)濾；②在測(cè)定水基膠的過(guò)程中以Luna 3u PFP (2)色 譜柱為分析柱，以甲醇和水混合液作為流動(dòng)相，流動(dòng)相流速0. 4~0. 6mL/min，采用LC-MS/ MS測(cè)定水基膠中MI、CMI和BIT的含量，以同位素內(nèi)標(biāo)法定量。
[0010] 更優(yōu)選的方案為：①稱(chēng)取〇. 3g水基膠，先加入5mL的水進(jìn)行分散，再加入20mL甲 醇振蕩萃取，轉(zhuǎn)速150r/min，時(shí)間30min，移取約1. 8mL萃取液于2mL離心管中離心10min， 轉(zhuǎn)速為l〇〇〇〇r/min ;準(zhǔn)確移取lmL上清液至10mL容量瓶中，加入100 y L濃度為10mg/L 的內(nèi)標(biāo)使用液，用甲醇定容，取約2mL過(guò)0. 22 ym有機(jī)相濾膜；②測(cè)定水基膠中MI、CMI和 BIT過(guò)程中，色譜柱為菲羅門(mén)公司生產(chǎn)的Luna 3u PFP(2)柱，規(guī)格為3ym，150mmX4.6mm， 柱溫30°C，流動(dòng)相流速0. 5mL/min，采用梯度洗脫，梯度洗脫程序見(jiàn)表1 ;③在測(cè)定水基膠中 MI、CMI和BIT過(guò)程中，采用的質(zhì)譜條件為：離子源：電噴霧離子源（ESI);掃描方式：正離 子掃描；檢測(cè)方式：多反應(yīng)監(jiān)測(cè)（MRM);離子源溫度：600°C ;離子對(duì)的駐留監(jiān)測(cè)時(shí)間（dwell time) :50ms ;輔助氣Gasl壓力：55Ps i ;輔助氣Gas2壓力：55Ps i ;各分析物的定量離子 對(duì)、定性離子對(duì)及去簇電壓（DP)、碰撞能量（CE)見(jiàn)表2 ;
[0011] 表1梯度洗脫程序
[0012]
[0013] 表2質(zhì)譜檢測(cè)參數(shù)表
[0014]
[0015] 注定量離子。
[0016] MI的內(nèi)標(biāo)為：d3-2-甲基-4-異噻唑啉-3-酮.鹽酸鹽（MI-d 3) ;CMI的內(nèi)標(biāo)為： d3-5-氯-2-甲基-4-異噻唑啉-3-酮（CMI-d3) ;BIT的內(nèi)標(biāo)為：13C6-1，2-苯并異噻啉-3-酮 (BIT-13C6)。
[0017] 所述的水基膠為接嘴膠、搭口膠、包裝膠、中線膠，質(zhì)譜采用美國(guó)應(yīng)用生物系統(tǒng)公 司的API4500QTRAP質(zhì)譜儀，液相色譜采用美國(guó)Thermo公司的DI0NEXU3000型高效液相色 譜儀，并配備有真空脫氣機(jī)、二元梯度泵、自動(dòng)進(jìn)樣器、恒溫柱箱和色譜質(zhì)譜工作站。
[0018] 本發(fā)明最優(yōu)選的步驟如下：
[0019] 1、提取
[0020] 稱(chēng)取水基膠0. 3g，精確至0. lmg，置于50mL具塞三角瓶中，用5mL水分散后加入 20mL甲醇，150r/min振蕩萃取30min，移取約1. 8mL萃取液于2mL離心管中離心10min，轉(zhuǎn) 速為 10000r/min。
[0021] 2、稀釋
[0022] 準(zhǔn)確移取lmL上清液至10mL容量瓶中，加入100 yL內(nèi)標(biāo)使用液，用甲醇定容，取 約2mL過(guò)0. 22 y m有機(jī)相濾膜，待LC-MS/MS檢測(cè)。
[0023] 3、內(nèi)標(biāo)溶液的制備
[0024] 準(zhǔn)確稱(chēng)取1.Omg的MI-d3、CMI-d#P BIT- 13C6,分別置于3只10mL容量瓶中，用甲醇 稀釋至刻度，配制成濃度均為l〇〇mg/L的內(nèi)標(biāo)儲(chǔ)備液。分別移取MI-d3、CMI-djP BIT- 13C6 的儲(chǔ)備液5.OmL至50mL容量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，配制成MI-d3、CMI-d# BIT- %濃 度為10mg/L的混合內(nèi)標(biāo)工作溶液。
[0025] 4、標(biāo)準(zhǔn)溶液的制備
[0026] 分別稱(chēng)取適量的3種異噻唑啉酮標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，用甲醇配制成濃度為1000mg/L的標(biāo)準(zhǔn) 儲(chǔ)備溶液。分別準(zhǔn)確移取lmL的MI、lmL的CMI、0. 25mL的BIT標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液于100mL容量瓶 中，用甲醇定容，配制濃度為MI、CMI濃度為10mg/L，BIT濃度為4mg/L的混合標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液。
[0027] 分別準(zhǔn)確移取 2 y L、10 y L、50 y L、100 y L、250 y L、500 y L、100 y L 混合標(biāo)準(zhǔn)溶液 至lOmL容量瓶中，加入100 yL內(nèi)標(biāo)工作溶液，用甲醇定容至刻度。
[0028] 5、測(cè)定
[0029] 移取以上配制好的不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)工作溶液和試樣溶液，注入液相色譜-串聯(lián)質(zhì) 譜儀；
[0030] 采用的液相色譜條件為：
[0031]--色譜柱：Luna3uPFP (2)，4. 6x150mm，3. 0ym;
[0032] 一一流動(dòng)相：甲醇和水，梯度洗脫，梯度見(jiàn)表1 ;
[0033] --流速：0? 5mL/min ；
[0034] --進(jìn)樣量：10 U L ;
[0035] --柱溫：30°C ;
[0036] 表1梯度洗脫程序
[0037]

[0038] 采用的質(zhì)譜條件為：
[0039] --離子源：電噴霧離子源（ESI);
[0040] --掃描方式：正離子掃描；
[0041] --檢測(cè)方式：多反應(yīng)監(jiān)測(cè)（MRM);
[0042] --離子源溫度：600°C ;
[0043] --離子對(duì)的駐留監(jiān)測(cè)時(shí)間（dwel 1 t ime) :50ms
[0044] --輔助氣Gasl壓力：55Psi;
[0045] --輔助氣Gas2壓力：55Psi;
[0046] 各分析物的定量離子對(duì)、定性離子對(duì)及去簇電壓（DP)、碰撞能量（CE)見(jiàn)表2。
[0047] 表2質(zhì)譜檢測(cè)參數(shù)表
[0048]
[0049] 注：*定量離子
[0050] 6、結(jié)果計(jì)算
[0051] 對(duì)混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液進(jìn)行LC-MS/MS分析，得到各定量離子的峰面積，然后計(jì)算各 目標(biāo)化合物與對(duì)應(yīng)內(nèi)標(biāo)的峰面積之比（MI與MI-d 3相比、CMI與CMI-d3相比、BIT與BIT-13C6 相比），擬合峰面積比與濃度成線性，且要求線性相關(guān)系數(shù)R2多0. 99。對(duì)試樣萃取液進(jìn)行 分析，依據(jù)內(nèi)標(biāo)法由混合標(biāo)準(zhǔn)工作曲線計(jì)算得到測(cè)定值。
[0052] 7、方法驗(yàn)證
[0053] 本發(fā)明的方法克服了現(xiàn)有技術(shù)的不足，針對(duì)水基膠樣品優(yōu)化了樣品前處理方法和 儀器檢測(cè)條件，與現(xiàn)有技術(shù)相比具有如下優(yōu)良效果：
[0054] 本發(fā)明選擇LC-MS/MS作為檢測(cè)手段，相對(duì)液相紫外檢測(cè)器，其抗干擾能力更強(qiáng)， 具有更高的靈敏度和選擇性，可以大大減少假陽(yáng)性的檢測(cè)結(jié)果，對(duì)樣品前處理的要求更低。
[0055] 通過(guò)選擇目標(biāo)物的同位素作為內(nèi)標(biāo)，顯著降低了LC-MS/MS基質(zhì)效應(yīng)，提高方法的 回收率，通過(guò)稀釋?zhuān)瑢?shí)現(xiàn)水基膠中異噻唑啉酮的準(zhǔn)確定量，并同時(shí)降低基質(zhì)效應(yīng)。本發(fā)明方 法首次基于使用液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)分析水基膠中3種異噻唑啉酮類(lèi)殺菌劑。
[0056] 本發(fā)明方法具有靈敏度高、準(zhǔn)確可靠及重復(fù)性好的優(yōu)點(diǎn)。
[0057] (1)標(biāo)準(zhǔn)曲線及方法檢測(cè)限：
[0058] 在優(yōu)化的儀器條件下，對(duì)質(zhì)量濃度MI和CMI為0. 002~1. Omg/L，BIT為0. 0008~ 0. 40mg/L的標(biāo)準(zhǔn)工作溶液進(jìn)行測(cè)定，以目標(biāo)物峰面積對(duì)標(biāo)準(zhǔn)工作溶液的質(zhì)量濃度進(jìn)行線性 回歸，得到線性回歸方程，呈良好的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)r多0.999。最低濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液 平行測(cè)定10次，所得測(cè)定結(jié)果標(biāo)準(zhǔn)偏差的3倍即為測(cè)定方法的檢出限，檢出限為0. 014~ 0. 018mg/kg，定量下限為0. 045~0. 059mg/kg，結(jié)果表明該方法能達(dá)到定量檢測(cè)的目的（表 3) 〇
[0059] 表3標(biāo)準(zhǔn)曲線及方法檢測(cè)限
[0060]
[0061] (2)重復(fù)性和加標(biāo)回收率：
[0062] 在水基膠樣品中加入一定量的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，然后進(jìn)行前處理和LC-MS/MS分析，并按 照加標(biāo)量和測(cè)定值計(jì)算其回收率，結(jié)果見(jiàn)表4。由表4可以看出，3種異噻唑