一種制備(2s,3r)-2-苯甲酰氨甲基-3-羥基丁酸甲酯的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及生物制藥技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種制備（2S，3R)-2-苯甲酰氨甲 基-3-羥基丁酸甲酯的方法。
【背景技術(shù)】
[0002] (2S，3R)-2_苯甲酰氨甲基-3-羥基丁酸甲酯是一種具有光學(xué)活性的羥基酯類 物質(zhì)，也是手性醇的一種，其化學(xué)結(jié)構(gòu)式如式（II)所示。（2S，3R)-2-苯甲酰氨甲基-3-羥 基丁酸甲酯是合成（3R，4R)-3-[(R)-1-叔丁基二甲基硅氧乙基]-4-乙酰氧基-2-氮雜環(huán) 丁酮（簡稱為4-AA，化學(xué)結(jié)構(gòu)式如式（III)所示）的關(guān)鍵起始原料，4-AA是一種重要的醫(yī) 藥精細(xì)化學(xué)品，主要用于合成各類培南類的抗生素，如亞胺培南、比阿培南、美羅培南和法 羅培南等。這些藥物用途廣泛，對革蘭陰性和陽性菌、需氧菌、厭氧菌等均具有廣譜強(qiáng)效抗 菌作用，因而受到人們極大重視。目前，在4-AA的合成工藝方面，以外消旋的2-苯甲酰氨 甲基-3-羰基丁酸甲酯為原料的合成路線是相對較為優(yōu)越的，因此，如何通過反應(yīng)高選擇 性地建立手性中心是反應(yīng)過程的關(guān)鍵所在。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種制備（2S，3R)-2-苯甲酰氨甲基-3-羥基丁酸甲酯的方法，其特征在于，包括： (1) 制備含羰基還原酶基因的工程菌和含葡萄糖脫氫酶基因的工程菌； (2) 分別制備兩種工程菌的靜息細(xì)胞懸液； (3) 將兩種靜息細(xì)胞懸液混合后，再與底物外消旋2-苯甲酰氨甲基-3-羰基丁酸甲酯、 氫供體和輔因子混合，進(jìn)行不對稱還原反應(yīng)，制得（2S，3R) -2-苯甲酰氨甲基-3-羥基丁酸 甲酯； 所述羰基還原酶基因的堿基序列如SEQ ID NO. 1所示，所述葡萄糖脫氫酶基因的堿基 序列如SEQ ID NO. 2所示。
2. 如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述的工程菌含有表達(dá)載體pET-30a (+)，宿 主細(xì)胞為大腸桿菌BL21 (DE3)。
3. 如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述的氫供體為葡萄糖，所述的輔因子為 NADPVNADPHo
4. 如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，兩種靜息細(xì)胞懸液的混合液中，含羰基還原 酶的靜息細(xì)胞與含葡萄糖脫氫酶的靜息細(xì)胞的質(zhì)量比為4 : 1~1 : 2。
5. 如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，不對稱還原反應(yīng)中，所述底物濃度為2. 5~ 500g/L，含羰基還原酶的靜息細(xì)胞的濃度為0. lgTS /L~25gTS /L，含葡萄糖脫氫酶的靜息 細(xì)胞的濃度為〇? Ig干H /L~25g干J1 /L，氫供體的濃度為5~750g/L，輔因子的濃度為0~ 0? 5mM〇
6. 如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述不對稱還原反應(yīng)的溫度為25~40°C， 反應(yīng)緩沖液pH為6.0~8.0。
7. 如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，靜息細(xì)胞懸液的制備方法，包括：將所述的 工程菌接種到含卡納霉素的培養(yǎng)基中，搖床活化后，擴(kuò)大培養(yǎng)至0D600值達(dá)到0. 8~1. 2 時，加入誘導(dǎo)劑，繼續(xù)培養(yǎng)，離心收集細(xì)胞，用緩沖液重懸，獲得所述的靜息細(xì)胞懸液。
8. 如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述的誘導(dǎo)劑為IPTG，誘導(dǎo)劑的濃度為 0. 5 ~0. 8mM。
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種制備(2S，3R)-2-苯甲酰氨甲基-3-羥基丁酸甲酯的方法，該方法包括：制備含羰基還原酶基因的工程菌和含葡萄糖脫氫酶基因的工程菌；分別制備兩種工程菌的靜息細(xì)胞懸液；將兩種靜息細(xì)胞懸液混合后，再與底物外消旋2-苯甲酰氨甲基-3-羰基丁酸甲酯、氫供體和輔因子混合，進(jìn)行不對稱還原反應(yīng)，制得(2S，3R)-2-苯甲酰氨甲基-3-羥基丁酸甲酯；羰基還原酶基因的堿基序列如SEQ ID NO.1所示，所述葡萄糖脫氫酶基因的堿基序列如SEQ ID NO.2所示。該方法可催化底物外消旋2-苯甲酰氨甲基-3-羰基丁酸甲酯反應(yīng)生成(2S，3R)-2-苯甲酰氨甲基-3-羥基丁酸甲酯，提高了產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化率和純度。
【IPC分類】C12R1-19, C12P13-02
【公開號】CN104846025
【申請?zhí)枴緾N201510149171
【發(fā)明人】吳堅(jiān)平, 徐佳, 李洪明, 黃光東, 徐丹萍, 龔偉中, 徐剛, 楊立榮
【申請人】浙江大學(xué), 浙江海翔藥業(yè)股份有限公司
【公開日】2015年8月19日
【申請日】2015年3月31日