生產(chǎn)香紫蘇醇的方法
【專利說(shuō)明】
[0001] 本發(fā)明是2009年02月12日申請(qǐng)的發(fā)明名稱為"生產(chǎn)香紫蘇醇的方法"的第 200980104742. 6號(hào)發(fā)明專利申請(qǐng)的分案申請(qǐng)。
技術(shù)領(lǐng)域
[0002] 本發(fā)明提供了一種生產(chǎn)香紫蘇醇的方法，所述方法包括使至少一條多肽與焦磷酸 香葉基香葉酯（GGPP)接觸。具體而言，所述方法可以在體外或體內(nèi)進(jìn)行以生產(chǎn)香紫蘇醇， 這是一種在香料和調(diào)味料領(lǐng)域非常有用的化合物。本發(fā)明還提供在本發(fā)明方法中使用的多 肽的氨基酸序列。編碼本發(fā)明多肽的核酸以及含所述核酸的表達(dá)載體也是本發(fā)明的一部 分。經(jīng)轉(zhuǎn)化以在生產(chǎn)香紫蘇醇的方法中使用的非人宿主生物體或細(xì)胞也是本發(fā)明的一個(gè)目 的。
【背景技術(shù)】
[0003] 萜見于大多數(shù)生物體（微生物、動(dòng)物和植物）。這些化合物由稱為異戊二烯的五 碳單元構(gòu)成，并由其結(jié)構(gòu)中存在的這些單元的數(shù)目來(lái)劃分。因此，單萜、倍半萜和二萜分別 為含10、15和20個(gè)碳原子的萜。二萜例如可廣泛見于植物界，并且已描述了超過(guò)2500種 的二?構(gòu)造（Connolly and Hill, Dictionary of terpenoids, 1991, Chapman&Hall, Lond on)。萜分子由于其風(fēng)味和香味特性以及其化妝、醫(yī)藥和抗微生物效果，一直是數(shù)千年來(lái)的興 趣所在。由例如蒸汽蒸餾或溶劑提取等各種手段獲得的植物提取物被用于萜的來(lái)源。萜分 子通常原樣使用，但在某些情況下利用化學(xué)反應(yīng)來(lái)將萜轉(zhuǎn)化為其他高價(jià)值分子。
[0004] 萜的生物合成生產(chǎn)涉及被稱為萜合酶的酶。二萜的合成可通過(guò)單--種酶或通過(guò) 兩種或更多種酶來(lái)進(jìn)行。當(dāng)涉及兩種酶時(shí)，第一種酶催化二萜焦磷酸酯的合成，隨后該酯被 第二種酶轉(zhuǎn)化為最終產(chǎn)物。
[0005]自然界存在兩種類型的環(huán)化機(jī)理，它們與可分為I類二萜合酶和II類二萜合酶的 兩種類型的二貓合酶有關(guān)（Wendt and Schulz, 1998, Structure. 6 (2): 127-33)。對(duì)于某些 二萜來(lái)說(shuō)，其環(huán)化機(jī)理自GGPP的焦磷酸酯的酯官能的離子化起始，接著是所得碳陽(yáng)離子與 內(nèi)部雙鍵的反應(yīng)。催化這種類型環(huán)化的二萜合酶為I類二萜合酶。二萜的生物合成中由II 類二萜合酶催化的第二種環(huán)化模式由GGPP的端末雙鍵的質(zhì)子化起始，并在內(nèi)部重排和質(zhì) 子消除之后，產(chǎn)生環(huán)狀二萜焦磷酸酯中間體。
[0006] 編碼來(lái)自兩類中每類二萜合酶的基因和CDNA已被克隆出，并且重組酶也已鑒定 出來(lái)。編碼不同類型二萜合酶的基因的可獲性為酶的一級(jí)結(jié)構(gòu)提供了信息。某些氨基酸基 序在二萜合酶中保留下來(lái)，并且要么與依賴質(zhì)子化的環(huán)化相關(guān)，要么與依賴離子化的環(huán)化 相關(guān)。DDxxD基序（其中x代表任何氨基酸）見于一些I類二萜合酶。所述基序很可能參 與焦磷酸酯部分的連接和離子化。在II類合酶中發(fā)現(xiàn)了保守的DxDD基序（其中x代表任 何氨基酸），其中涉及第二天冬氨酸殘基作為質(zhì)子供體。
[0007] 香紫蘇醇是天然產(chǎn)生的二萜分子，其廣泛用作用于合成帶有龍涎香香調(diào)的芳香 分子的起始材料。開發(fā)這類合成用于提供龍涎香一一由抹香鯨的腸分泌的一種蠟狀物 質(zhì)一一的代用品。龍涎香由于其令人愉快的氣味而備受賞識(shí)，并且在歷史上已被用作加香 成分。由于龍涎香高昂的價(jià)格以及日益增長(zhǎng)的需求，并且特別是由于對(duì)鯨類的保護(hù)，已經(jīng)開 發(fā)了帶有龍涎香特征的龍涎香成分和分子的化學(xué)合成。在這些分子中，Ambrox Ki (瑞士 Firmenich SA的注冊(cè)商標(biāo)）是最受大多數(shù)人賞識(shí)的龍涎香的代用品。用于Ambrox@合 成的最廣泛使用的起始材料是二萜二醇香紫蘇醇。
[0008] 通常，植物天然提取物的價(jià)格和可獲性取決于該植物的豐度、油的收率以及地理 來(lái)源。此外，天然提取物的可獲性和品質(zhì)極大地依賴于導(dǎo)致每年差異化的氣候和其他地區(qū) 條件，使得在某些年份在高品質(zhì)香料中使用這些成分非常困難，甚至于不可能。因此，提供 極少受可獲性和品質(zhì)的波動(dòng)影響的香紫蘇醇來(lái)源是有利的?；瘜W(xué)合成似乎是制備香紫蘇醇 的顯然選擇。但是，考慮到其高度復(fù)雜的結(jié)構(gòu)，制備香紫蘇醇的經(jīng)濟(jì)的合成方法依舊是困難 的。由此，能夠合成香紫蘇醇的生物化學(xué)路徑將引起極大的興趣。
[0009] 在植物和其他生物體中進(jìn)行的萜的生物合成早已有廣泛研宄，在此不贅述，但可 參考Dewick，Nat. Prod. R印?，2002, 19, 181-222,其回顧了萜的生物合成路徑的現(xiàn)有技術(shù)狀 況。
[0010] 一些二萜合酶早已被鑒定出。特別是與本發(fā)明的序列具有一定百分比的序列同一 性的萜合酶也早已見于序列數(shù)據(jù)庫(kù)。盡管如此，已知的二萜合酶與本發(fā)明的多肽之間的同 一性百分比非常低。
[0011] 與本發(fā)明的LPP合酶最接近的合酶是兩種焦磷酸柯巴酯合酶（一種來(lái)自番茄 (Solanum lycopersicum) (BAA84918)，另一種來(lái)自輿瓜（Cucurbita maxima) (AAD04293 和 AAD04292))--一種來(lái)自野甘草（Scoparia dulcis) (BAD91286)的推定的焦磷酸柯巴醋合 酶以及一種來(lái)自葡萄（Vitis vinifera)的假定蛋白質(zhì)。這些蛋白質(zhì)的序列與本發(fā)明的LPP 合酶僅有41%的同一性，并且沒(méi)有記載表明這些序列中的任一種能用于香紫蘇醇的生產(chǎn)， 也未描述它們具有LPP合酶活性。
[0012] 與本發(fā)明的香紫蘇醇合酶最接近的合酶為與本發(fā)明的多肽具有36%同一性的 不確定功能的類萜環(huán)化酶（編號(hào)從^14八598912)，與本發(fā)明的多肽具有32%同一性的黃 瓜（Cucumis sativus)的對(duì)映體貝殼杉烯合酶（編號(hào)BAB19275)，與本發(fā)明的多肽具有 32 %同一性的來(lái)自水稻（Oryza sativa)的對(duì)映體咖薩二稀（ent-cassadiene)合酶（編 號(hào) ABH10734，公布于Xu, Wilderman，Morrone，Xu, Roy, Margis-Pinheiro, Upadhyaya，Coat es and Peters, Functional characterization of the rice kaurene synthase-like gene family, Phytochemistry,68(3)，2007, 312-326)以及與本發(fā)明所提供的香紫蘇 醇合酶具有32 %同一性的來(lái)自水稻（Oryza sativa)的對(duì)映體貝殼杉稀合酶（編號(hào) AAQ72559，公布于Margis-Pinheiro, Zhou, Zhu, Dennis and Upadhyaya, Isolation and characterization of a DS-tagged rice(Oryza sativa L.)GA-responsive dwarf mutant defective in an early step of the gibberellins biosynthesis pathway, Plant Cell R印.，23(12)，2005, 819-833)。此外，沒(méi)有記載表明這些序列中的任一種能用于香紫蘇醇的 生產(chǎn)，特別是沒(méi)有記載它們能催化由LPP至香紫蘇醇的轉(zhuǎn)化。
[0013] 除序列本身之間的區(qū)別外，還需要指出的是，由上述酶合成的產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)和性質(zhì) 與香紫蘇醇和LPP極為不同。焦磷酸柯巴酯的性質(zhì)與焦磷酸賴百當(dāng)烯二醇酯（LPP)極為不 同。具體而言，與LPP不同，焦磷酸柯巴酯不能在香紫蘇醇的生物合成中作為中間產(chǎn)物使 用。對(duì)映體貝殼杉烯和對(duì)映體咖薩二烯與香紫蘇醇也極為不同。對(duì)映體貝殼杉烯是一種三 環(huán)二萜，其不含任何醇官能團(tuán)，這與香紫蘇醇不同，后者為雙環(huán)二醇。此外，對(duì)映體貝殼杉烯 為用于調(diào)節(jié)生長(zhǎng)的植物激素的前體，其在香料和調(diào)味料領(lǐng)域中沒(méi)有任何用途，而如上所述， 香紫蘇醇在這些技術(shù)領(lǐng)域中備受關(guān)注。
[0014] 現(xiàn)有技術(shù)的一篇文獻(xiàn)與香紫蘇醇合酶特別相關(guān)（Banthorpe, Brown and Morris,Partial purification of farnesyl pyrophosphate:Drimenol cyclase and geranylgeranyl pyrophosphate:Sclareol cyclase, using cell culture as a source of material，Phytochemistry 31，1992, 3391-3395)。在該文獻(xiàn)中，一種來(lái)自粘毛煙草 (Nicotiana glutinosa)的部分純化的蛋白質(zhì)被鑒定為香紫蘇醇合酶，但是對(duì)于該蛋白質(zhì) 的氨基酸序列、編碼它的核酸的核苷酸序列以及該蛋白質(zhì)在香紫蘇醇的體外或體內(nèi)生物合 成的方法中的用途沒(méi)有給出任何啟示。此外，該文獻(xiàn)既沒(méi)有教導(dǎo)也沒(méi)有暗示兩種蛋白質(zhì)（I 類和II類二萜合酶）參與對(duì)由GGPP至香紫蘇醇的轉(zhuǎn)化的催化。相反，其教導(dǎo)了一種單一 的部分純化蛋白質(zhì)負(fù)責(zé)香紫蘇醇的合成。
[0015] W02008/007031公開了一種具有焦磷酸順式柯巴基-8-醇酯合酶的蛋白質(zhì)，編碼 所述蛋白質(zhì)的核苷酸序列，以及包含所述核酸的載體和轉(zhuǎn)基因非人生物體。然而，這種焦磷 酸順式柯巴基-8-醇酯合酶與本發(fā)明的多肽極為不同，這是因?yàn)樗_的蛋白質(zhì)與本發(fā)明 融合多肽中的本發(fā)明方法中使用的LPP合酶僅有44%的氨基酸序列同一性。
[0016] 本發(fā)明的一個(gè)目的是提供如上所述以經(jīng)濟(jì)的方式制造香紫蘇醇的方法。因此，本 發(fā)明的目的是生產(chǎn)香紫蘇醇同時(shí)具有很少的浪費(fèi)，這是一種更加節(jié)能并且節(jié)約資源的方 法，同時(shí)降低對(duì)化石燃料的依賴。本發(fā)明的另一目的是提供一種能合成用作香料和/或芳 香成分的香紫蘇醇的酶。
[0017] 現(xiàn)有技術(shù)文獻(xiàn)均未公開由非環(huán)狀二萜前體GGPP來(lái)生物合成生產(chǎn)香紫蘇醇的方 法。
[0018] 伸用的縮寫
[0019] bp 堿基對(duì)
[0020] kb 千堿基
[0021] BSA 牛血清白蛋白
[0022] DMAPP 焦磷酸二甲基烯丙酯
[0023] DNA 脫氧核糖核酸
[0024] cDNA 互補(bǔ) DNA
[0025] dT 脫氧胸腺嘧啶
[0026] dNTP 脫氧核苷酸三磷酸
[0027] DTT 二硫蘇糖醇
[0028] FPP 焦磷酸法呢酯
[0029] GC 氣相色譜
[0030] GGPP 焦磷酸香葉基香葉酯
[0031] idi 焦磷酸異戊烯酯異構(gòu)酶
[0032]IPP 焦磷酸異戊烯酯
[0033] IPTG 異丙基-D-硫代半乳糖苷
[0034] LB 溶菌肉湯
[0035] LPP 焦磷酸賴百當(dāng)烯二醇酯
[0036] M0PS0 3- (N-嗎啉代）-2-羥基丙磺酸
[0037] MS 質(zhì)譜
[0038] mvaKl 甲羥戊酸激酶
[0039] mvaK2 甲羥戊酸焦磷酸激酶
[0040] PCR 聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)
[0041] 3' _/5' -RACE 3' 和 5' cDNA 末端快速擴(kuò)增
[0042] RMCE 重組酶介導(dǎo)的盒式交換
[0043] RT-PCR 逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)
[0044] RNA 核糖核酸
[0045] mRNA 信使核糖核酸
[0046] RuBisCO 核酮糖-1，5-焦磷酸羧化酶
[0047] SDS-PAGE SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳
[0048] SsLPPs 快樂(lè)鼠尾草焦磷酸賴百當(dāng)烯二醇酯合酶

【發(fā)明內(nèi)容】

[0049] 本發(fā)明提供一種以經(jīng)濟(jì)、可靠并且可再現(xiàn)的方式通過(guò)生物合成來(lái)生產(chǎn)香紫蘇醇的 方法。
[0050] 在本發(fā)明中，香紫蘇醇、GGPP、LPP以及本申請(qǐng)中引用的其他所有化合物均由圖1 所示的它們的結(jié)構(gòu)式定義。
[0051] 對(duì)于本申請(qǐng)的目的而言，"二萜合酶"或"具有二萜合酶活性的多肽"指的是能催化 由非環(huán)狀萜前體GGPP起始或由二萜焦磷酸酯如LPP起始的萜分子合成的多肽，或是能催化 由非環(huán)狀二萜前體GGPP起始的二萜焦磷酸酯合成的多肽。
[0052] 對(duì)于"LPP合酶"或"具有LPP合酶活性的多肽"，這里我們指的是能催化由GGPP起 始的LPP合成的多肽。
[0053] 對(duì)于"香紫蘇醇合酶"或"具有香紫蘇醇合酶活性的多肽"，這里我們指的是能催化 由LPP起始的香紫蘇醇合成的多肽。
[0054] 對(duì)于"能催化由GGPP至香紫蘇醇的轉(zhuǎn)化的多肽"，這里我們指的是能催化所述轉(zhuǎn) 化的任何多肽，特別是催化兩步機(jī)理--其中LPP作為中間產(chǎn)物而被合成--的多肽。
[0055] 多肽催化特定二萜（例如香紫蘇醇）和/或特定二萜焦磷酸酯（例如LPP)的合 成的能力可通過(guò)進(jìn)行實(shí)施例3中詳述的酶活性測(cè)定而容易地確認(rèn)。
[0056] 根據(jù)本發(fā)明，多肽還表示包括截短的多肽，條件是它們要保持如上任意實(shí)施方案 中所定義的二萜合酶活性，并且與SEQ ID NO: 1或SEQ ID N0:2的相應(yīng)片段，或者與SEQ ID N0:3的相應(yīng)片段有至少所定義百分比的同一性。特別有用的截短的多肽是那些N末端缺失 了質(zhì)體定位信號(hào)的多肽。
[0057] 兩條肽序列或核苷酸序列之間的同一性的百分比是當(dāng)進(jìn)行這兩條序列的比對(duì)時(shí)， 在兩條序列中相同的氨基酸或核酸殘基的數(shù)目的函數(shù)。相同的殘基定義為在兩條序列中在 給定比對(duì)位置上的同樣的殘基。這里所用的序列同一性的百分比是由最優(yōu)比對(duì)，通過(guò)將兩 條序列中相同的殘基數(shù)目除以最短的序列的殘基總數(shù)再乘以100而計(jì)算得到的。最優(yōu)比對(duì) 是這樣一種比對(duì)，其中同一性百分比可能為最高。在一條或兩條序列的一個(gè)或多個(gè)比對(duì)位 置可引入間隙以獲得最優(yōu)比對(duì)。在序列同一性的百分比計(jì)算中將這些間隙作為不相同的殘 基來(lái)考慮。
[0058] 以確定氨基酸或核酸序列同一性為目的的比對(duì)可使用計(jì)算機(jī)程序（例如為 萬(wàn)維網(wǎng)上可得的公用計(jì)算機(jī)程序）以各種方式來(lái)實(shí)現(xiàn)。優(yōu)選可使用來(lái)自National Center for Biotechnology Information(NCBI)的地址為 http://www. ncbi. nlm. nih. gov/BLAST/bl2seq/wblast2. cgi 的 BLAST 程序（Tatiana 等的 FEMS Microbiol Lett.，1999, 174:247-250, 1999)，其參數(shù)設(shè)為默認(rèn)，以獲得肽序列或核苷酸序列的最優(yōu)比 對(duì)，并計(jì)算序列同一性的百分比。
[0059] 因此，本發(fā)明的一個(gè)目的是一種生產(chǎn)香紫蘇醇的方法，包括：
[0060] (a)將GGPP與至少一條具有LPP合酶活性的多肽接觸，該多肽包含與SEQ ID NO: 1 或SEQ ID NO: 2有至少50%同一性的氨基酸序列；
[0061] (b)將步驟（a)中生產(chǎn)的中間產(chǎn)物與至少一條具有香紫蘇醇合酶活性的多肽接 觸，該多肽包含與SEQ ID N0:3有至少50%同一性的氨基酸序列；并且
[0062] (c)非強(qiáng)制性選擇地將步驟（b)中生產(chǎn)的香紫蘇醇分離。
[0063] 根據(jù)一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案，通過(guò)將GGPP與所述至少一條具有LPP合酶活性的多 肽和所述至少一條具有香紫蘇醇合酶活性的多肽一起接觸，該生產(chǎn)香紫蘇醇的方法的步驟 (a)和（b)同時(shí)進(jìn)行。
[0064] 對(duì)于本申請(qǐng)的目的而言，在說(shuō)步驟（a)和（b)同時(shí)進(jìn)行時(shí)，我們指的是，僅有一個(gè) 動(dòng)作對(duì)于想進(jìn)行本發(fā)明而獲得兩步驟結(jié)果的人來(lái)說(shuō)是必需的，即將GGPP與至少兩條多肽 接觸，或與至少一條下面所描述的融合多肽接觸。然而，香紫蘇醇的生產(chǎn)仍然以兩步機(jī)理進(jìn) 行，如圖2所示。首先，通過(guò)LPP合酶或通過(guò)具有LPP合酶序列的融合多肽的一部分，在香 紫蘇醇合酶的存在下，由GGPP原位合成出LPP。所生產(chǎn)的LPP直接與香紫蘇醇合酶直接接 觸，或與具有香紫蘇醇合酶序列的融合多肽的一部分直接接觸，該前體一產(chǎn)生，所述酶就催 化該前體至香紫蘇醇的轉(zhuǎn)化。
[0065] 根據(jù)一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案，生產(chǎn)香紫蘇醇的方法的步驟（a)和