本發(fā)明屬于發(fā)酵工程領(lǐng)域，涉及一種利用微生物發(fā)酵生產(chǎn)DHA的方法，具體地，涉及利用裂殖壺菌菌株工業(yè)化發(fā)酵生產(chǎn)含二十二碳六稀酸(DHA)混合油脂的方法。
背景技術(shù)：
：DHA，全名二十二碳六烯酸(cis-4,7,10,13,16,19-docosahexaenoicacid,DHA)，是一種多元不飽和脂肪酸。人體自身難以合成，必須從外界攝取。DHA屬于人體必需脂肪酸之一，有重要的生理調(diào)節(jié)功能和保健作用，缺乏時會引發(fā)一系列病癥，包括生長發(fā)育遲緩、皮膚異常、鱗屑、不育、智力障礙等，另外還對心血管疾病有特殊的預(yù)防和治療效果。有關(guān)研究還表明，DHA能作用于許多不同類型的組織和細胞，具有抑制炎癥及免疫作用，包括減少炎癥因子的產(chǎn)生、抑制淋巴細胞增殖等，DHA還具有預(yù)防老年癡呆、神經(jīng)性疾病等多重功效。目前DHA的商業(yè)來源主要是魚油和微藻。傳統(tǒng)深海魚油提取的DHA受魚的品種、季節(jié)及地理位置的影響而不穩(wěn)定，且膽固醇和其他不飽和脂肪酸含量高，脂肪酸鏈的長度和不飽和度差異均較大，導(dǎo)致DHA產(chǎn)量有限、含量不高、分離純化困難，成本較高等問題。隨著魚油原料來源日漸緊缺，難以實現(xiàn)DHA這種高附加值產(chǎn)品在食品和醫(yī)藥等行業(yè)中的廣泛應(yīng)用。微生物發(fā)酵法生產(chǎn)DHA可克服傳統(tǒng)魚油提取的缺陷，可用于大量生產(chǎn)DHA，不斷滿足人們的需求，具有廣闊的應(yīng)用前景，備受國內(nèi)外學(xué)者關(guān)注。微生物發(fā)酵法采用真菌及微藻等產(chǎn)油微生物發(fā)酵生產(chǎn)含DHA藻油，經(jīng)精制提取得DHA含量高的精油。國家衛(wèi)生部許可的DHA生產(chǎn)菌種包括裂殖壺菌(Schizochytriumsp.)、吾肯氏壺藻(Ulkeniaamoeboida)和寇氏隱甲藻(Crypthecodiniumcohnii)。微生物發(fā)酵法生產(chǎn)DHA的市場份額在逐年快速上升，有取代魚油DHA的趨勢，提高微藻DHA生產(chǎn)技術(shù)及品質(zhì)，進軍微藻DHA市場前景廣闊。公開號為CN103882072A的專利公開了一種利用裂殖壺菌生產(chǎn)二十二碳六烯酸的方法，其所公開的最高產(chǎn)量為細胞干重61.2g/L、DHA含量55.07％、DHA產(chǎn)量22.17g/L。公開號為CN101812484A的專利公開了一種高密度培養(yǎng)裂殖壺菌發(fā)酵生產(chǎn)DHA的方法，其所公開的產(chǎn)量為細胞干重120－150g/L、DHA產(chǎn)量26－30g/L，這也是目前報道的采用裂殖壺菌(Schizochytriumsp.)生產(chǎn)DHA的最高生產(chǎn)水平。雖然其DHA生產(chǎn)率較之前的研究有了較大提高，但對于利用微藻進行工業(yè)化生產(chǎn)二十二碳六烯酸，大大降低其生產(chǎn)成本，提高單位產(chǎn)量，使微生物發(fā)酵產(chǎn)DHA的方法能夠得到大力推廣和普及使用還是遠遠不夠的?，F(xiàn)有從裂殖壺菌發(fā)酵液中提取DHA的方法主要有三種，一是離心法，二是有機溶劑萃取法，三是超臨界萃取法。離心法如公開號為CN101817738B的專利公開了一種從藻類和真菌細胞中破壁提取DHA的方法：將發(fā)酵結(jié)束后的微藻或真菌發(fā)酵液通過分離系統(tǒng)分離收集細胞，用酸調(diào)節(jié)菌泥pH2.0－4.0，然后控制菌泥溫度在10℃－20℃，在菌泥中加入抗氧化劑后通過高壓均質(zhì)機進行高壓均質(zhì)破壁；將破壁后的菌泥加入水，攪拌后將料液通過三相分離機分離得到DHA油脂。該發(fā)明采用物理的破壁和物理提取方法，工藝簡單，細胞破壁高效，對菌泥的低溫和抗氧化劑處理，可有效的保護藻類和真菌細胞內(nèi)物質(zhì)的生物活性，且產(chǎn)品綠色無毒無殘留。但該發(fā)明離心后的油層品質(zhì)較差，除含油脂外，還含有水分、培養(yǎng)基成分和細胞碎片等雜質(zhì)，不利于后續(xù)的精煉，另外離心后的廢水層含有大量菌渣，COD很高，難以處理或處理成本極高。有機溶劑萃取法如公開號為CN101824363B的專利公開了一種提取二十二碳六烯酸油脂的方法：將含有二十二碳六烯酸的發(fā)酵液經(jīng)酶法破壁后，先采用有機溶劑進行一級分水，對菌體進行富集，再用有機溶劑進行二級萃取，得到粗油。該方法操作簡單，設(shè)備投入低，但該方法使用到有機溶劑進行萃取，最終產(chǎn)品可能會有溶劑殘留，且萃取過程存在易燃易爆等安全隱患。超臨界萃取方法如公開號為CN102181320B的專利公開了一種生物發(fā)酵DHA藻油的提取方法，包括以下步驟：a)將微藻發(fā)酵液固液分離后得到的固體物干燥，得到干燥菌體；b)以超臨界二氧化碳為萃取劑對所述干燥菌體進行萃取，得到二氧化碳流體；c)對所述二氧化碳流體進行減壓分離，得到DHA藻油。實驗表明，采用本發(fā)明提供的方法得到的DHA藻油中，DHA的含量大于40％，提取收率最高僅為85.23％，且需要加入乙醇作為助萃取劑，存在一定的安全風險，同時超臨界設(shè)備價格昂貴，萃取收率也不高?，F(xiàn)有技術(shù)中DHA毛油的精煉多采用化學(xué)精煉技術(shù)，DHA毛油經(jīng)過脫膠、堿煉、脫色、脫臭后得到DHA精油。該工藝技術(shù)不可避免地存在一些問題，如：堿煉為了達到控制酸價低的要求，通常都會加入過量堿，部分甘油三酯不可避免會被皂化；堿煉產(chǎn)生的高COD廢水會污染環(huán)境；堿煉需要高溫處理時間長，容易造成產(chǎn)品過氧化值、茴香胺值升高；脫臭溫度高、時間長易產(chǎn)生反式脂肪酸等缺點。目前，尚需要開發(fā)新的DHA生產(chǎn)工藝。技術(shù)實現(xiàn)要素：本發(fā)明人經(jīng)過深入的研究和創(chuàng)造性的勞動，得到了一種培養(yǎng)用于生產(chǎn)DHA的微生物的方法。本發(fā)明人驚奇地發(fā)現(xiàn)，所述培養(yǎng)方法能夠大幅度地提高生物量及DHA產(chǎn)量。進一步地，本發(fā)明人還發(fā)現(xiàn)了一種提取DHA毛油的方法，所述提取方法能夠提高DHA毛油的提取收率。進一步地，本發(fā)明人還發(fā)現(xiàn)了一種純化DHA毛油的方法，其能夠提升DHA成品油的各項技術(shù)指標和純化收率。本發(fā)明顯著地提高了含DHA的粗油脂產(chǎn)量、DHA產(chǎn)量及DHA生產(chǎn)率。由此提供了下述發(fā)明：本發(fā)明的一個方面涉及一種培養(yǎng)用于生產(chǎn)DHA(二十二碳六烯酸)的微生物的方法，其中：從發(fā)酵罐培養(yǎng)的36－60小時開始(優(yōu)選地，直至發(fā)酵結(jié)束)，將溶解氧飽和度(DO)控制在5％－10％(例如5％、5.5％、6％、6.5％、7％、7.5％、8％、8.5％、9％、9.5％或10％)；和/或從發(fā)酵罐培養(yǎng)的36－60小時開始(優(yōu)選地，直至發(fā)酵結(jié)束)，不再加入氮源或者將氮源的加入量減少50％以上(例如55％以上、60％以上、65％以上、70％以上、75％以上、80％以上、85％以上、90％以上或95％以上)。在本發(fā)明的一些實施方式中，所述的培養(yǎng)方法，其中：從發(fā)酵罐培養(yǎng)的40－56小時(例如40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55或56小時)、44－52小時、46－50小時或者48小時開始，將溶解氧控制在5％－10％，和/或從發(fā)酵罐培養(yǎng)的40－56小時(例如40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55或56小時)、44－52小時、46－50小時或者48小時開始，不再加入氮源。在本發(fā)明的一些實施方式中，所述的培養(yǎng)方法，其中，在控制溶解氧飽和度為5％－10％之前，溶解氧飽和度為30％－50％(例如30％－45％、35％－45％、40％－45％、40％－50％、35％、36％、37％、38％、39％、40％、41％、42％、43％、44％或45％)。在本發(fā)明的一些實施方式中，所述的培養(yǎng)方法，其中，所述發(fā)酵液的pH為6.0－7.0。在本發(fā)明的一些實施方式中，所述的培養(yǎng)方法，其中，發(fā)酵液中葡萄糖的濃度保持1－5g/L(例如1、1.5、2、2.5、3、3.5、4、4.5或5g/L)。在本發(fā)明的一些實施方式中，所述的培養(yǎng)方法，其中，所述氮源為氨水，優(yōu)選為25％－45％的氨水，更優(yōu)選為35％－45％或38％－42％的氨水，特別優(yōu)選為40％的氨水。在本發(fā)明的一些實施方式中，所述的培養(yǎng)方法，其中，所述發(fā)酵罐培養(yǎng)還包括在發(fā)酵罐培養(yǎng)起始的12－36小時(例如16－32小時、18－30小時、20－28小時、22－26小時、24小時)，進行分罐培養(yǎng)的步驟；例如，分為兩個或更多個發(fā)酵罐進行發(fā)酵罐培養(yǎng)。在本發(fā)明的一些實施方式中，所述的培養(yǎng)方法，其在發(fā)酵罐培養(yǎng)之前，還包括接種和種子擴大培養(yǎng)的步驟；優(yōu)選地，所述種子擴大培養(yǎng)包括一級種子擴大培養(yǎng)和二級種子擴大培養(yǎng)；優(yōu)選地，所述一級種子擴大培養(yǎng)包括下述步驟：按照0.4％－1％的接種量將搖瓶種子液接入裝有滅菌后培養(yǎng)基的一級種子罐中，培養(yǎng)溫度25℃－32℃，通氣量1－2vvm，罐壓0.02－0.05MPa，攪拌轉(zhuǎn)速50－100rpm，培養(yǎng)30－35h，完成一級種子擴大培養(yǎng)；優(yōu)選地，所述二級種子擴大培養(yǎng)包括下述步驟：按照1％－3％的接種量將一級種子罐的種子液接入裝有滅菌后培養(yǎng)基的二級種子罐中，培養(yǎng)溫度25℃－32℃，通氣量1－2vvm，罐壓0.02－0.05MPa，攪拌轉(zhuǎn)速50－100rpm，培養(yǎng)20－25h，完成二級種子擴大培養(yǎng)。在本發(fā)明的一些實施方式中，所述的培養(yǎng)方法，還包括在接種之前和擴大培養(yǎng)之前，進行活化培養(yǎng)的步驟；優(yōu)選地，所述活化培養(yǎng)的溫度為25℃－32℃，時間為20－25h。在本發(fā)明的一些實施方式中，所述的培養(yǎng)方法，其中，所述發(fā)酵罐培養(yǎng)包括下述步驟：按照1％－3％的接種量將二級種子罐的種子液接入裝有滅菌后培養(yǎng)基的發(fā)酵罐中，培養(yǎng)溫度25℃－32℃，通氣量1－2vvm，罐壓0.02－0.05MPa，攪拌轉(zhuǎn)速50－100rpm，進行發(fā)酵罐培養(yǎng)。在本發(fā)明的一些實施方式中，所述的培養(yǎng)方法，其中用于生產(chǎn)DHA的微生物為裂殖壺菌(Schizochytriumsp.)；優(yōu)選地，所述裂殖壺菌選自保藏號為CGMCCNo.6843、ATCCNo.20888、ATCCNo.20889、ATCCNo.28209或ATCCMYA-1381的菌株。在本發(fā)明一個具體的實施方案中，所述的培養(yǎng)方法，包括下述步驟：1)將裂殖壺菌(Schizochytriumsp.)斜面保藏菌株接入裝有400mL種子培養(yǎng)基的2L搖瓶，在25℃－32℃的溫度下以200rpm的轉(zhuǎn)速培養(yǎng)20－25h，完成菌株活化培養(yǎng)；2)按照0.4－1％的接種量將搖瓶種子液接入裝有滅菌后種子培養(yǎng)基的一級種子罐中，培養(yǎng)溫度25℃－32℃，通氣量1－2vvm，罐壓0.02－0.05MPa，攪拌轉(zhuǎn)速50－100rpm，培養(yǎng)30－35h，完成一級種子擴大培養(yǎng)；3)按照1％－3％的接種量將一級種子罐的種子液接入裝有滅菌后種子培養(yǎng)基的二級種子罐中，培養(yǎng)溫度25℃－32℃，通氣量1－2vvm，罐壓0.02－0.05MPa，攪拌轉(zhuǎn)速50－100rpm，培養(yǎng)20－25h，完成二級種子擴大培養(yǎng)；4)按照1％－3％的接種量將二級種子罐的種子液接入裝有滅菌后發(fā)酵培養(yǎng)基的發(fā)酵罐中，培養(yǎng)溫度25℃－32℃，通氣量1－2vvm，罐壓0.02－0.05MPa，攪拌轉(zhuǎn)速50－100rpm，進行發(fā)酵罐培養(yǎng)；5)通過溶氧調(diào)控策略將發(fā)酵48h前DO控制在30％－50％，48h及之后DO控制在5％－10％，過程中以DO為控制指標，調(diào)整通氣量、罐壓及攪拌轉(zhuǎn)速，并適當補入滅菌后新鮮培養(yǎng)基或無菌水；6)發(fā)酵48h前流加40％的氨水控制發(fā)酵液pH在6.0－7.0，流加氨水補充氮源的同時可以控制發(fā)酵液pH穩(wěn)定，48h后停止流加氨水，進行缺氮培養(yǎng)，pH不再作控制；7)發(fā)酵至24h將發(fā)酵罐中發(fā)酵液按體積一分為二培養(yǎng)，一半發(fā)酵液留在主罐中繼續(xù)培養(yǎng)，另一半發(fā)酵液通過壓差法轉(zhuǎn)移至無菌保壓的副罐中培養(yǎng)，主副罐中分別補入適量滅菌后新鮮培養(yǎng)基或無菌水，分罐培養(yǎng)后主副罐通氣量、罐壓及攪拌轉(zhuǎn)速均按溶氧調(diào)控策略作相應(yīng)調(diào)整；8)發(fā)酵過程中葡萄糖濃度隨菌體生長不斷下降，流加碳源將發(fā)酵液中糖點(葡萄糖濃度)維持在1－5g/L；9)發(fā)酵培養(yǎng)84－108h，終止發(fā)酵，放罐，測定發(fā)酵液中生物量達120－180g/L，生物量中粗油脂含量達45％－60％，DHA占總油脂含量為40％－55％，DHA產(chǎn)量最高可達44.9g/L，DHA產(chǎn)率最高可達11.2g/(L·d)。上述步驟1)至步驟3)中所用的種子培養(yǎng)基的配方以及上述的步驟4)中所用的發(fā)酵培養(yǎng)基的配方，為本領(lǐng)域技術(shù)人員知悉的常規(guī)配方。例如，種子培養(yǎng)基配方為：葡萄糖3％，蛋白胨1％，酵母粉0.5％，海水晶2％，pH自然。發(fā)酵培養(yǎng)基配方為：葡萄糖12％，蛋白胨1％，酵母粉0.5％，海水晶2％，pH6.5(裂殖壺菌產(chǎn)DHA的工藝研究及高產(chǎn)菌株選育，王申強等，江南大學(xué)碩士學(xué)位論文，2013年，p13-14)。上述發(fā)酵培養(yǎng)基碳源中添加了20％－40％(粗甘油的質(zhì)量/碳源的質(zhì)量×100％)預(yù)處理后的生物柴油副產(chǎn)物粗甘油。生物柴油是以植物油和動物油脂等可再生油脂為原料制成的可再生能源，經(jīng)過轉(zhuǎn)酯反應(yīng)后可生成生物柴油及副產(chǎn)物甘油。粗甘油的預(yù)處理過程包括調(diào)節(jié)pH值至酸性、稀釋、水解、分離。在本發(fā)明的一個實施方案中，粗甘油的預(yù)處理包括下述步驟：i)將粗甘油與去離子水以1:4(體積比)混合；ii)以鹽酸調(diào)節(jié)pH至6.5左右；iii)以5000rpm的轉(zhuǎn)速分離去除沉淀物質(zhì)。不拘于理論的限制：步驟i)中，稀釋后可以降低粘度；步驟ii)中，將粗甘油中可溶性的皂角類物質(zhì)轉(zhuǎn)化為不溶的游離脂肪酸固體物質(zhì)；步驟iii)中，沉淀物質(zhì)包括游離脂肪酸固體和不溶解的重金屬雜質(zhì)。上述步驟8)中，糖點(葡萄糖的濃度)采用本領(lǐng)域技術(shù)人員知悉的方法測定，例如生物傳感儀測定。上述發(fā)酵過程中采用溶氧調(diào)控策略將發(fā)酵前48hDO控制在30％－50％、發(fā)酵48h后DO控制在5％－10％，過程中以DO為控制指標，調(diào)整通氣量、罐壓及攪拌轉(zhuǎn)速，并適當補入滅菌后新鮮培養(yǎng)基或無菌水。上述發(fā)酵過程中發(fā)酵48h前流加40％的氨水控制發(fā)酵液pH在6.0－7.0，流加氨水補充氮源的同時可以控制發(fā)酵液pH穩(wěn)定，48h后停止流加氨水，進行缺氮培養(yǎng)，pH不再作控制。上述發(fā)酵過程中發(fā)酵至24h將發(fā)酵罐中發(fā)酵液按體積一分為二培養(yǎng)，一半發(fā)酵液留在主罐中繼續(xù)培養(yǎng)，另一半發(fā)酵液通過壓差法轉(zhuǎn)移至無菌保壓的副罐中培養(yǎng)，主副罐中分別補入適量滅菌后新鮮培養(yǎng)基或無菌水，分罐培養(yǎng)后主副罐通氣量、罐壓及攪拌轉(zhuǎn)速均按溶氧調(diào)控策略作相應(yīng)調(diào)整。上述發(fā)酵過程中流加碳源將發(fā)酵液中糖點(葡萄糖濃度)維持在1－5g/L。上述發(fā)酵培養(yǎng)基中碳源包括葡萄糖、玉米漿粉、糖蜜、甘油和淀粉中的一種或多種；氮源包括大豆粉、酵母提取物、蛋白胨、氨水、硝酸鈉、谷氨酸鈉、硫酸銨中的一種或多種。上述發(fā)酵培養(yǎng)基中添加的微量元素包括丙氨酸、谷氨酸、賴氨酸、泛酸鈣、生物素、維生素B1、微生物B6、微生物B12、維生素K中的一種或多種，當為其中一種時，添加量為0.001％－0.01％；當為其中多種時，任意一種組分的添加量為0.001％－0.005％。上述發(fā)酵培養(yǎng)基中添加的無機鹽包括硫酸鎂、氯化鉀、氯化鈉、氯化鈣、磷酸二氫鉀、磷酸氫二鉀中的一種或多種。對上述發(fā)酵所用菌種裂殖壺菌(Schizochytriumsp.)沒有特殊的限制，可以是歸類于裂殖壺菌屬的各種菌類，具體來說，包括但不限于Schizochytriumsp.CGMCCNo.6843、Schizochytriumsp.ATCCNo.20888、Schizochytriumsp.ATCCNo.20889、Schizochytriumsp.ATCCNo.28209、SchizochytriumlimacinumHondaetYokochiATCCMYA-1381，對其來源也無特殊限制，可以從發(fā)酵研究所或ATCC、CGMCC、CCTCC等微生物保藏寄存機關(guān)獲得，還可以使用從自然環(huán)境中通過公知的篩選方法獲得的裂殖壺菌(Schizochytriumsp.)菌株。本發(fā)明的另一方面涉及一種微生物發(fā)酵液，其由本發(fā)明中任一項所述的培養(yǎng)方法得到。優(yōu)選地，所述微生物發(fā)酵液為裂殖壺菌發(fā)酵液。本發(fā)明的再一方面涉及一種提取DHA毛油的方法，包括如下步驟：1)將用于生產(chǎn)DHA的微生物的發(fā)酵液進行脫水處理；2)將步驟1)的產(chǎn)物進行柔性壓榨，得到DHA毛油。在本發(fā)明的一些實施方式中，所述的提取方法，其中，步驟1)中，所述發(fā)酵液為裂殖壺菌發(fā)酵液；優(yōu)選地，所述發(fā)酵液為本發(fā)明的微生物發(fā)酵液。在本發(fā)明的一些實施方式中，所述的提取方法，其中，步驟1)中，所述脫水處理選自如下的任意一種、兩種或三種：離心、第一級柔性壓榨、干燥例如噴霧干燥；優(yōu)選地，所述脫水處理依次包括離心和第一級柔性壓榨，或者依次包括離心和噴霧干燥；優(yōu)選地，所述噴霧干燥的噴霧壓力為4－8MPa，進風溫度160℃－220℃，出風溫度80℃－120℃。在本發(fā)明的一些實施方式中，所述的提取方法，其中，步驟1)中，所述第一級柔性壓榨采用逐步加壓方式，設(shè)定壓力為20－40MPa，加壓時間為1－6h，到達設(shè)定壓力后保壓1－4h。在本發(fā)明的一些實施方式中，所述的提取方法，其中，步驟2)中，所述柔性壓榨采用逐步加壓方式，設(shè)定壓力為50－150MPa，加壓時間為1－6h，到達設(shè)定壓力后保壓1－4h。在本發(fā)明一個具體的實施方案中，所述的提取方法，包括下述步驟：1)布料：將一定量的DHA發(fā)酵液用布料器運送至布料腔中，布料器回到初始位置，待下一步布料。2)一級柔性壓榨：采用逐步加壓方式，一級柔性壓榨的壓力范圍為20－40MPa，加壓時間為1－6h，到達設(shè)定壓力，保壓1－4h至基本無水滴流出，結(jié)束后，待物料下降到重壓腔中，將物料推入二級柔性壓榨位置。3)二級柔性壓榨：采用逐步加壓方式，壓榨的最終壓力為50－150MPa，加壓時間為1－6h，到達設(shè)定壓力，保壓1－4h至基本無油滴流出，收集壓榨出來的DHA毛油，卸壓，去掉二級壓榨籠，將微藻粕與濾布進行分離。上述DHA發(fā)酵液可直接進行一級柔性壓榨，也可以先采用離心方法除去一部分水分，提高發(fā)酵液的含固量后再進行一級柔性壓榨，可縮短壓榨時間和提高生產(chǎn)能力。上述發(fā)酵液離心方法可采用臥式螺旋離心機、碟式離心機、管式離心機中的一種進行。提取DHA毛油方法也可以采用如下方式：DHA發(fā)酵液經(jīng)噴霧干燥得到微藻粉(是指菌體經(jīng)干燥去除水分后，得到的干菌體，外觀為顆粒狀粉末，稱之為微藻粉)，微藻粉進行柔性壓榨(條件等同于前面的二級柔性壓榨)，得到DHA毛油。上述噴霧干燥噴霧壓力為4－8MPa，進風溫度160℃－220℃，出風溫度80℃－120℃，DHA微藻粉水分控制在10％以內(nèi)。上述DHA發(fā)酵液可直接進行噴霧干燥，也可以噴霧干燥前先采用離心方法除去一部分水分，提高發(fā)酵液的含固量后再進行噴霧干燥，可提高產(chǎn)能和節(jié)約能耗。上述發(fā)酵液離心方法可采用臥式螺旋離心機、碟式離心機、管式離心機中的一種進行。上述柔性壓榨包括以下步驟：(1)布料：將一定量的DHA微藻粉用布料器運送至布料腔中，布料器回到初始位置，待下一步布料。(2)柔性壓榨，采用逐步加壓方式，壓榨的最終壓力為50－150MPa，加壓時間為1－6h，到達設(shè)定壓力，保壓1－4h至基本無油滴流出，收集壓榨出來的DHA毛油，卸壓，去掉二級壓榨籠，將微藻粕與濾布進行分離。本發(fā)明的再一方面涉及一種DHA毛油，其由本發(fā)明中任一項所述的提取方法制得。本發(fā)明的再一方面涉及一種純化DHA毛油的方法，包括將DHA毛油進行水化、脫色和分子蒸餾的步驟；優(yōu)選地，所述DHA毛油為本發(fā)明的DHA毛油。在本發(fā)明的一些實施方式中，所述的純化方法，其中，所述水化包括如下步驟：將DHA毛油加熱至70℃－85℃，按1kg毛油加入50－150g水的比例加入75℃－90℃水，攪拌10－60min，攪拌速度30－90轉(zhuǎn)/min，靜置1－6h，分層去掉下層磷脂，得到水化油。在本發(fā)明的一些實施方式中，所述的純化方法，其中，所述脫色包括如下步驟：將水化產(chǎn)物升溫至90℃－110℃，控制真空度≤-0.07MPa，真空脫水0.5－2h，然后降溫至60℃－80℃，加入脫色劑(例如水化油重量1％－3％的活性炭和2－4％活性白土)，攪拌0.5－1h，停止攪拌，過濾去除脫色劑，得到脫色油。在本發(fā)明的一些實施方式中，所述的純化方法，其中，所述分子蒸餾為三級分子蒸餾；優(yōu)選地，所述分子蒸餾包括如下步驟：將脫色油進入三級分子蒸餾，控制第一級真空度≤100Pa、溫度150℃－200℃，去除第一級的輕組分；得到的第一重組分進入第二級分子蒸餾，控制二級真空度≤50Pa、溫度180℃－220℃，去除第二級輕組分；得到的第二重組分進入第三級分子蒸餾，控制第三級真空度≤5Pa、溫度200℃－250℃，去除第三級輕組分，得到第三重組分，為DHA成品油。優(yōu)選地，重復(fù)分子蒸餾1次或多次。在本發(fā)明一個具體的實施方案中，所述的純化方法，包括下述步驟：DHA毛油經(jīng)水化、脫色、分子蒸餾等步驟進行精煉，最終得到DHA成品油。精煉具體步驟如下：1)水化：DHA毛油加熱至70℃－85℃，按1kg毛油加入50－150g水的比例加入75℃－90℃水，攪拌10－60min，攪拌速度30－90轉(zhuǎn)/min，靜置1－6h，分層去掉下層磷脂，得到水化油。2)脫色：水化油移入脫色鍋，升溫至90℃－110℃，控制真空度≤-0.07MPa，真空脫水0.5－2h，然后降溫至60℃－80℃，加入脫色劑(水化油重量1％－3％的活性炭和2％－4％活性白土)，攪拌脫色0.5－1h，停止攪拌，過濾去除脫色劑，得到脫色油。3)分子蒸餾：脫色油進入三級分子蒸餾，控制第一級真空度≤100Pa、溫度150℃－200℃，去除第一級的輕組分，重組分進入第二級分子蒸餾，控制二級真空度≤50Pa、溫度180℃－220℃，去除第二級輕組分，重組分進入第三級分子蒸餾，控制第三級真空度≤5Pa、溫度200℃－250℃，去除第三級輕組分，收集重組分，得到分子蒸餾油。分子蒸餾遍數(shù)控制1－3遍，至酸價、氣味符合標準要求。分子蒸餾完畢，降溫至20℃－40℃，添加抗氧化劑，包裝，得到DHA成品油。上述步驟1)中，優(yōu)選地，所述水為純化水。本發(fā)明的再一方面涉及一種DHA成品油，其由本發(fā)明中任一項所述的純化方法制得。本發(fā)明的再一方面涉及一種生產(chǎn)DHA或含有DHA的產(chǎn)品(例如DHA成品油)的方法，包括：本發(fā)明中任一項所述的培養(yǎng)用于生產(chǎn)DHA的微生物的方法、本發(fā)明中任一項所述的提取DHA毛油的方法、和/或本發(fā)明中任一項所述的純化DHA毛油的方法。在本發(fā)明的一個實施方式中，所述生產(chǎn)方法的如圖1所示。在本發(fā)明的另一個實施方式中，所述生產(chǎn)方法的如圖2所示。本發(fā)明中，術(shù)語“柔性壓榨”是指采用PLC(可編程邏輯控制器)程序控制來進行加壓－保壓－加壓循環(huán)，逐步達到預(yù)定壓力的一種高壓壓榨方式。術(shù)語“純化水”是指飲用水經(jīng)蒸餾法、離子交換法、反滲透法或其他適宜的方法制得的供藥用的水，不含任何添加劑。在本發(fā)明的一個實施方案中，所述純化水參照《中國藥典》的規(guī)定。術(shù)語“DHA毛油”是指，從DHA發(fā)酵液中制取、沒經(jīng)過精煉加工的初級油。術(shù)語“DHA成品油”是指，DHA毛油經(jīng)過精煉加工得到的精油。術(shù)語“發(fā)酵罐培養(yǎng)”是指種子擴大培養(yǎng)之后，在發(fā)酵罐中進行的用于生產(chǎn)目的產(chǎn)物的發(fā)酵培養(yǎng)。本發(fā)明的有益效果：本發(fā)明提供了一種工業(yè)化發(fā)酵生產(chǎn)二十二碳六烯酸油脂的方法，該方法能夠低成本、高產(chǎn)量生產(chǎn)綠色環(huán)保的高品質(zhì)DHA油脂。本發(fā)明具有下述技術(shù)效果中的至少一種：(1)本發(fā)明的工藝技術(shù)指標均明顯優(yōu)于現(xiàn)有的工藝技術(shù)指標，所得DHA油脂產(chǎn)量高、純度高，有利于DHA的大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)，粗甘油的添加也降低了DHA發(fā)酵生產(chǎn)成本，大幅提高了DHA發(fā)酵生產(chǎn)的市場競爭力。(2)本發(fā)明采用柔性壓榨工藝制備DHA毛油，不需要使用有機溶劑進行提取，整條生產(chǎn)工藝路線無需使用有機溶劑，最終產(chǎn)品不會有溶劑殘留，一方面所得產(chǎn)品綠色健康，產(chǎn)品質(zhì)量好，另一方面生產(chǎn)車間安全環(huán)保，是一個綠色的清潔生產(chǎn)工藝。(3)發(fā)酵液經(jīng)一級柔性壓榨除去的水溶液，基本不含菌渣，COD比較低，容易生化處理，二級柔性壓榨得到毛油后，剩下的微藻粕還含有少量的油脂和大量的蛋白，可以作為飼料添加劑使用，經(jīng)濟環(huán)保。(4)本發(fā)明采用分子蒸餾一步工藝替代傳統(tǒng)脫酸、脫臭兩步工藝。分子蒸餾能夠在保留物質(zhì)生理活性的基礎(chǔ)上快速去除大量的游離脂肪酸和臭味。對比傳統(tǒng)的堿煉脫酸方法，分子蒸餾脫酸工藝簡單，降低了過度堿煉的風險，減少從皂腳帶走中性油脂的損失，脫酸收率明顯提高，脫酸過程在高真空條件下進行且時間短，避免了堿煉脫酸受熱時間長造成過氧化值、茴香胺值升高的風險，產(chǎn)品穩(wěn)定性好；對比傳統(tǒng)水蒸氣蒸餾脫臭工藝，分子蒸餾脫臭時間短，真空度高，減少了反式脂肪酸的產(chǎn)生，且臭味物質(zhì)脫除效果好，產(chǎn)品無腥味。(5)生產(chǎn)過程避免了有機溶劑的使用，避免了溶劑消耗和溶劑回收的成本，污水COD低容易處理，精煉收率高，從而大大降低了生產(chǎn)成本。附圖說明圖1：本發(fā)明一個實施方式的生產(chǎn)DHA成品油的工藝流程示意圖。圖2：本發(fā)明另一個實施方式的生產(chǎn)DHA成品油的工藝流程示意圖。圖3：采用裂殖壺菌Schizochytriumsp.CGMCCNo.6843在不同培養(yǎng)方式下100m3發(fā)酵罐發(fā)酵生產(chǎn)DHA的結(jié)果。具體實施方式下面通過具體實施例對本發(fā)明作詳細說明。然而，本領(lǐng)域的技術(shù)人員容易理解，實施例所描述的具體的物料配比、工藝條件及其結(jié)果僅用于說明本發(fā)明，而不應(yīng)當也不會限制權(quán)利要求書中所詳細描述的本發(fā)明。關(guān)于本發(fā)明涉及的物理量或者指標的測定方法或者計算方法，如果沒有特別說明，按照下面所述的方法進行：生物量的測定方法為：取適量發(fā)酵液置于扁形稱量瓶中，于105℃電熱恒溫干燥箱中干燥4h后，放入干燥器冷卻至室溫，稱重，減去稱量瓶重量，再除以發(fā)酵液體積，所得數(shù)值即為生物量，單位g/L。粗油脂產(chǎn)量的測定方法：取一定體積發(fā)酵液，加入2倍體積的濃鹽酸，70℃下恒溫攪拌50min至菌體完全消化，加入適量正己烷，靜置分層，用滴管取上層有機相至茄型瓶中，連續(xù)萃取5－8次，直至上層有機相為無色，通過80℃水浴旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去正己烷，然后將茄型瓶置于105℃電熱恒溫干燥箱中干燥1h，放入干燥器冷卻至室溫，稱重，減去茄型瓶重量，再除以發(fā)酵液體積，所得數(shù)值即為粗油脂產(chǎn)量，單位g/L。DHA產(chǎn)量為：以氣相色譜法測得粗油脂中DHA的含量，乘以粗油脂產(chǎn)量所得，單位g/L。DHA生產(chǎn)率為：DHA產(chǎn)量除以發(fā)酵周期(天數(shù))所得數(shù)值，單位g/(L·d)。脂肪酸組成分析的方法和本發(fā)明中DHA成品油檢測方法依據(jù)GB26400-2011食品安全國家標準食品添加劑二十二碳六烯酸油脂(發(fā)酵法)。毛油提取收率計算方式：收率＝毛油重量g/(發(fā)酵液體積L×發(fā)酵液粗油脂產(chǎn)量g/L)×100％。發(fā)酵培養(yǎng)實施例1為原始培養(yǎng)方式(不采用溶氧調(diào)控策略、氮源調(diào)控策略及分罐培養(yǎng)策略)；實施例2為采用溶氧調(diào)控策略；實施例3為采用氮源調(diào)控策略；實施例4為采用分罐培養(yǎng)策略；實施例5－13為同時采用溶氧調(diào)控策略、氮源調(diào)控策略及分罐培養(yǎng)策略。下面的實施例1－13中，如果沒有特別說明，所用種子培養(yǎng)基配方為：葡萄糖3％，蛋白胨1％，酵母粉0.5％，海水晶2％，pH自然(其余為水)。發(fā)酵培養(yǎng)基配方為：葡萄糖12％，蛋白胨1％，酵母粉0.5％，海水晶2％(其余為水)。實施例1：原始培養(yǎng)方式(不采用溶氧調(diào)控策略、氮源調(diào)控策略及分罐培養(yǎng)策略)對100m3發(fā)酵罐發(fā)酵生產(chǎn)DHA的影響分別將裂殖壺菌(Schizochytriumsp.ATCC20888)、裂殖壺菌(SchizochytriumlimacinumHondaetYokochiATCCMYA-1381)、裂殖壺菌(Schizochytriumsp.CGMCCNo.6843)斜面保藏菌株接入裝有400mL培養(yǎng)基的2L搖瓶，在25℃的溫度下以200rpm的轉(zhuǎn)速培養(yǎng)24h，完成菌株活化培養(yǎng)。按照0.4％的接種量將搖瓶種子液接入裝有滅菌后培養(yǎng)基的一級種子罐中，培養(yǎng)溫度28℃、通氣量1vvm、罐壓0.02MPa、攪拌轉(zhuǎn)速50rpm培養(yǎng)30h，完成一級種子擴大培養(yǎng)。按照3％的接種量將一級種子罐的種子液接入裝有滅菌后培養(yǎng)基的二級種子罐中，培養(yǎng)溫度28℃、通氣量1vvm、罐壓0.02MPa、攪拌轉(zhuǎn)速75rpm培養(yǎng)24h，完成二級種子擴大培養(yǎng)。按照3％的接種量將二級種子罐的種子液接入裝有滅菌后培養(yǎng)基的發(fā)酵罐中。發(fā)酵過程培養(yǎng)溫度28℃、通氣量1vvm、罐壓0.02MPa、攪拌轉(zhuǎn)速75rpm，流加含30％預(yù)處理后粗甘油的碳源，控制葡萄糖濃度在5g/L，流加補入氮源，進行發(fā)酵培養(yǎng)。發(fā)酵過程中檢測發(fā)酵液葡萄糖濃度、pH、菌體生物量、粗油脂產(chǎn)量及DHA產(chǎn)量變化。培養(yǎng)96h后終止發(fā)酵，下表1為分別測定所述三株菌在原始培養(yǎng)模式下培養(yǎng)后的生物量、粗油脂產(chǎn)量、DHA產(chǎn)量及DHA生產(chǎn)率，下表2為發(fā)酵后所得混合油脂脂肪酸組成氣相分析結(jié)果。CGMCCNo.6843的生物量、粗油脂產(chǎn)量、DHA產(chǎn)量亦如圖3所示。表1：不同菌株在原始培養(yǎng)模式下的發(fā)酵結(jié)果表2：100m3發(fā)酵罐原始培養(yǎng)方式發(fā)酵后所得混合油脂脂肪酸組成通過表1及表2可見，三株菌在原始培養(yǎng)方式下產(chǎn)量及脂肪酸組成均差異較大，其中裂殖壺菌(Schizochytriumsp.CGMCCNo.6843)各項指標均優(yōu)于另外兩株菌，因此以裂殖壺菌(Schizochytriumsp.CGMCCNo.6843)為出發(fā)菌株來進行不同培養(yǎng)方式的優(yōu)化。實施例2：采用溶氧調(diào)控策略對100m3發(fā)酵罐發(fā)酵生產(chǎn)DHA的影響將裂殖壺菌(Schizochytriumsp.CGMCCNo.6843)斜面保藏菌株接入裝有400mL培養(yǎng)基的2L搖瓶，在25℃的溫度下以200rpm的轉(zhuǎn)速培養(yǎng)24h，完成菌株活化培養(yǎng)。按照0.4％的接種量將搖瓶種子液接入裝有滅菌后培養(yǎng)基的一級種子罐中，培養(yǎng)溫度28℃、通氣量1vvm、罐壓0.02MPa、攪拌轉(zhuǎn)速50rpm培養(yǎng)30h，完成一級種子擴大培養(yǎng)。按照3％的接種量將一級種子罐的種子液接入裝有滅菌后培養(yǎng)基的二級種子罐中，培養(yǎng)溫度28℃、通氣量1vvm、罐壓0.02MPa、攪拌轉(zhuǎn)速75rpm培養(yǎng)24h，完成二級種子擴大培養(yǎng)。按照3％的接種量將二級種子罐的種子液接入裝有滅菌后培養(yǎng)基的發(fā)酵罐中。發(fā)酵過程培養(yǎng)溫度28℃、通氣量1－2vvm、罐壓0.02－0.05MPa、攪拌轉(zhuǎn)速50－100rpm，流加含30％預(yù)處理后粗甘油的碳源，控制葡萄糖濃度在5g/L，流加補入氮源，進行發(fā)酵培養(yǎng)。采用溶氧調(diào)控策略將發(fā)酵前48hDO控制在40％、發(fā)酵48h后DO控制在8％，過程中以DO為控制指標，調(diào)整通氣量、罐壓及攪拌轉(zhuǎn)速，并適當補入滅菌后新鮮培養(yǎng)基或無菌水。發(fā)酵過程中檢測發(fā)酵液葡萄糖濃度、pH、菌體生物量、粗油脂產(chǎn)量及DHA產(chǎn)量變化。培養(yǎng)96h后終止發(fā)酵，測定發(fā)酵液中生物量為125g/L，粗油脂產(chǎn)量為56.3g/L，DHA產(chǎn)量為29.3g/L，DHA生產(chǎn)率為7.3g/(L·d)，如圖3。發(fā)酵液放罐體積為78m3，整批發(fā)酵含DHA粗油脂產(chǎn)量為4391.4kg，比原始培養(yǎng)方式產(chǎn)量提高了0.67倍。以下表3為發(fā)酵后所得混合油脂脂肪酸組成氣相分析結(jié)果：表3：100m3發(fā)酵罐溶氧調(diào)控策略發(fā)酵后所得混合油脂脂肪酸組成實施例3：采用氮源調(diào)控策略對100m3發(fā)酵罐發(fā)酵生產(chǎn)DHA的影響將裂殖壺菌(Schizochytriumsp.CGMCCNo.6843)斜面保藏菌株接入裝有400mL培養(yǎng)基的2L搖瓶，在25℃的溫度下以200rpm的轉(zhuǎn)速培養(yǎng)24h，完成菌株活化培養(yǎng)。按照0.4％的接種量將搖瓶種子液接入裝有滅菌后培養(yǎng)基的一級種子罐中，培養(yǎng)溫度28℃、通氣量1vvm，罐壓0.02MPa、攪拌轉(zhuǎn)速50rpm培養(yǎng)30h，完成一級種子擴大培養(yǎng)。按照3％的接種量將一級種子罐的種子液接入裝有滅菌后培養(yǎng)基的二級種子罐中，培養(yǎng)溫度28℃、通氣量1vvm、罐壓0.02MPa、攪拌轉(zhuǎn)速75rpm培養(yǎng)24h，完成二級種子擴大培養(yǎng)。按照3％的接種量將二級種子罐的種子液接入裝有滅菌后培養(yǎng)基的發(fā)酵罐中。發(fā)酵過程培養(yǎng)溫度28℃、通氣量1vvm、罐壓0.02MPa、攪拌轉(zhuǎn)速75rpm，流加含30％預(yù)處理后粗甘油的碳源，控制葡萄糖濃度在5g/L，進行發(fā)酵培養(yǎng)。發(fā)酵過程中發(fā)酵48h前流加40％的氨水控制發(fā)酵液pH在6.5，流加氨水補充氮源的同時可以控制發(fā)酵液pH穩(wěn)定，48h后停止流加氨水，進行缺氮培養(yǎng)，pH不再作控制。發(fā)酵過程中檢測發(fā)酵液葡萄糖濃度、pH、菌體生物量、粗油脂產(chǎn)量及DHA產(chǎn)量變化。培養(yǎng)96h后終止發(fā)酵，測定發(fā)酵液中生物量為118g/L，粗油脂產(chǎn)量為64.2g/L，DHA產(chǎn)量為32.6g/L，DHA生產(chǎn)率為8.2g/(L·d)，如圖3。發(fā)酵液放罐體積為78m3，整批發(fā)酵含DHA粗油脂產(chǎn)量為5007.6kg，比原始培養(yǎng)方式產(chǎn)量提高了0.91倍。以下表4為發(fā)酵后所得混合油脂脂肪酸組成氣相分析結(jié)果：表4：100m3發(fā)酵罐氮源調(diào)控策略發(fā)酵后所得混合油脂脂肪酸組成脂肪酸組成含量％C12:00.48C14:04.96C16:017.12C16:11.26C18:01.88C18:11.67C20:46.23C20:51.25C22:514.35C22:650.8實施例4：采用分罐培養(yǎng)策略對100m3發(fā)酵罐發(fā)酵生產(chǎn)DHA的影響將裂殖壺菌(Schizochytriumsp.CGMCCNo.6843)斜面保藏菌株接入裝有400mL培養(yǎng)基的2L搖瓶，在25℃的溫度下以200rpm的轉(zhuǎn)速培養(yǎng)24h，完成菌株活化培養(yǎng)。按照0.4％的接種量將搖瓶種子液接入裝有滅菌后培養(yǎng)基的一級種子罐中，培養(yǎng)溫度28℃、通氣量1vvm、罐壓0.02MPa、攪拌轉(zhuǎn)速50rpm培養(yǎng)30h，完成一級種子擴大培養(yǎng)。按照3％的接種量將一級種子罐的種子液接入裝有滅菌后培養(yǎng)基的二級種子罐中，培養(yǎng)溫度28℃、通氣量1vvm、罐壓0.02MPa、攪拌轉(zhuǎn)速75rpm培養(yǎng)24h，完成二級種子擴大培養(yǎng)。按照3％的接種量將二級種子罐的種子液接入裝有滅菌后培養(yǎng)基的發(fā)酵罐中。發(fā)酵過程培養(yǎng)溫度28℃、通氣量1vvm、罐壓0.02MPa、攪拌轉(zhuǎn)速75rpm，流加含30％預(yù)處理后粗甘油的碳源，控制葡萄糖濃度在5g/L，流加補入氮源，進行發(fā)酵培養(yǎng)。發(fā)酵至24h將發(fā)酵罐中發(fā)酵液按體積一分為二培養(yǎng)，一半發(fā)酵液留在主罐中繼續(xù)培養(yǎng)，另一半發(fā)酵液通過壓差法轉(zhuǎn)移至無菌保壓的副罐中培養(yǎng)，主副罐中分別補入適量滅菌后新鮮培養(yǎng)基或無菌水。發(fā)酵過程中檢測發(fā)酵液葡萄糖濃度、pH、菌體生物量、粗油脂產(chǎn)量及DHA產(chǎn)量變化。培養(yǎng)96h后終止發(fā)酵，測定發(fā)酵液中生物量為73g/L，粗油脂產(chǎn)量為36.3g/L，DHA產(chǎn)量為16.4g/L，DHA生產(chǎn)率為4.1g/(L·d)，如圖3。發(fā)酵液放罐體積為132m3，整批發(fā)酵含DHA粗油脂產(chǎn)量為4791.6kg，比原始培養(yǎng)方式產(chǎn)量提高了0.83倍，雖然放罐生物量、粗油脂產(chǎn)量、DHA產(chǎn)量等指標與原始培養(yǎng)方式比較差異不大，但是由于采用分罐培養(yǎng)，發(fā)酵液放罐體積為原始培養(yǎng)方式的1.74倍，所以整批發(fā)酵產(chǎn)量較原始培養(yǎng)方式提高了0.83倍。這對于工業(yè)化大規(guī)模生產(chǎn)含DHA油脂具有重要意義，可以極大的節(jié)約成本，提高DHA生產(chǎn)的市場競爭力。以下表5為發(fā)酵后所得混合油脂脂肪酸組成氣相分析結(jié)果：表5：100m3發(fā)酵罐發(fā)酵后所得混合油脂脂肪酸組成脂肪酸組成含量％C12:00.58C14:04.88C16:020.21C16:11.91C18:01.54C18:11.22C20:46.13C20:51.25C22:517.08C22:645.2實施例5：采用溶氧調(diào)控策略、氮源調(diào)控策略及分罐培養(yǎng)策略對100m3發(fā)酵罐裂殖壺菌(Schizochytriumsp.CGMCCNo.6843)發(fā)酵生產(chǎn)DHA的影響將裂殖壺菌(Schizochytriumsp.CGMCCNo.6843)斜面保藏菌株接入裝有400mL培養(yǎng)基的2L搖瓶，在25℃的溫度下以200rpm的轉(zhuǎn)速培養(yǎng)24h，完成菌株活化培養(yǎng)。按照0.4％的接種量將搖瓶種子液接入裝有滅菌后培養(yǎng)基的一級種子罐中，培養(yǎng)溫度28℃、通氣量1vvm、罐壓0.02MPa、攪拌轉(zhuǎn)速50rpm培養(yǎng)30h，完成一級種子擴大培養(yǎng)。按照3％的接種量將一級種子罐的種子液接入裝有滅菌后培養(yǎng)基的二級種子罐中，培養(yǎng)溫度28℃、通氣量1vvm、罐壓0.02MPa、攪拌轉(zhuǎn)速75rpm培養(yǎng)24h，完成二級種子擴大培養(yǎng)。按照3％的接種量將二級種子罐的種子液接入裝有滅菌后培養(yǎng)基的發(fā)酵罐中。發(fā)酵過程培養(yǎng)溫度28℃、通氣量1－2vvm、罐壓0.02－0.05MPa、攪拌轉(zhuǎn)速50－100rpm，流加含30％預(yù)處理后粗甘油的碳源，控制葡萄糖濃度在5g/L，進行發(fā)酵培養(yǎng)。采用溶氧調(diào)控策略將發(fā)酵48h前DO控制在40％、發(fā)酵48h后DO控制在8％，過程中以DO為控制指標，調(diào)整通氣量、罐壓及攪拌轉(zhuǎn)速，并適當補入滅菌后新鮮培養(yǎng)基或無菌水。發(fā)酵過程中發(fā)酵48h前流加40％的氨水控制發(fā)酵液pH在6.5左右，流加氨水補充氮源的同時可以控制發(fā)酵液pH穩(wěn)定，48h后停止流加氨水，進行缺氮培養(yǎng)，pH不再作控制。發(fā)酵至24h將發(fā)酵罐中發(fā)酵液按體積一分為二培養(yǎng)，一半發(fā)酵液留在主罐中繼續(xù)培養(yǎng)，另一半發(fā)酵液通過壓差法轉(zhuǎn)移至無菌保壓的副罐中培養(yǎng)，主副罐中分別補入適量滅菌后新鮮培養(yǎng)基或無菌水，分罐培養(yǎng)后主副罐通氣量、罐壓及攪拌轉(zhuǎn)速均按溶氧調(diào)控策略作相應(yīng)調(diào)整。發(fā)酵過程中檢測發(fā)酵液葡萄糖濃度、pH、菌體生物量、粗油脂產(chǎn)量及DHA產(chǎn)量變化。培養(yǎng)96h后終止發(fā)酵，測定發(fā)酵液中生物量為145g/L，粗油脂產(chǎn)量為82.6g/L，DHA產(chǎn)量為44.9g/L，DHA生產(chǎn)率為11.2g/(L·d)，如圖3。發(fā)酵液放罐體積為130m3，整批發(fā)酵含DHA粗油脂產(chǎn)量為10738kg，比原始培養(yǎng)方式產(chǎn)量提高了3.10倍。同時采用溶氧調(diào)控策略、氮源調(diào)控策略及分罐培養(yǎng)策略不僅可以高產(chǎn)含DHA的油脂，而且所得DHA油脂中DHA的含量高，具有強勢的市場競爭力。以下表6為發(fā)酵后所得混合油脂脂肪酸組成氣相分析結(jié)果：表6：100m3發(fā)酵罐發(fā)酵后所得混合油脂脂肪酸組成脂肪酸組成含量％C12:00.45C14:04.86C16:014.22C16:11.68C18:01.72C18:11.59C20:46.36C20:51.54C22:513.28C22:654.3實施例6：采用溶氧調(diào)控策略、氮源調(diào)控策略及分罐培養(yǎng)策略對100m3發(fā)酵罐裂殖壺菌(Schizochytriumsp.ATCC20888)發(fā)酵生產(chǎn)DHA的影響將裂殖壺菌(Schizochytriumsp.ATCC20888)按實施例5的培養(yǎng)方式進行培養(yǎng)，培養(yǎng)96h后終止發(fā)酵，測定發(fā)酵液中生物量為65g/L，粗油脂產(chǎn)量為15.2g/L，DHA產(chǎn)量為6.5g/L，比原始培養(yǎng)方式產(chǎn)量提高了2.49倍。同時采用溶氧調(diào)控策略、氮源調(diào)控策略及分罐培養(yǎng)策略不僅可以高產(chǎn)含DHA的油脂，而且所得DHA油脂中DHA的含量高，具有強勢的市場競爭力。以下表7為發(fā)酵后所得混合油脂脂肪酸組成氣相分析結(jié)果：表7：100m3發(fā)酵罐發(fā)酵后所得混合油脂脂肪酸組成實施例7：采用溶氧調(diào)控策略、氮源調(diào)控策略及分罐培養(yǎng)策略對100m3發(fā)酵罐裂殖壺菌(SchizochytriumlimacinumHondaetYokochiATCCMYA-1381)發(fā)酵生產(chǎn)DHA的影響將裂殖壺菌(SchizochytriumlimacinumHondaetYokochiATCCMYA-1381)施例5的培養(yǎng)方式進行培養(yǎng)，培養(yǎng)96h后終止發(fā)酵，測定發(fā)酵液中生物量為105g/L，粗油脂產(chǎn)量為37g/L，DHA產(chǎn)量為17.2g/L，比原始培養(yǎng)方式產(chǎn)量提高了2.81倍。同時采用溶氧調(diào)控策略、氮源調(diào)控策略及分罐培養(yǎng)策略不僅可以高產(chǎn)含DHA的油脂，而且所得DHA油脂中DHA的含量高，具有強勢的市場競爭力。以下表8為發(fā)酵后所得混合油脂脂肪酸組成氣相分析結(jié)果：表8：100m3發(fā)酵罐發(fā)酵后所得混合油脂脂肪酸組成脂肪酸組成含量％C12:00.79C14:05.48C16:020.63C16:11.25C18:01.96C18:11.12C20:47.95C20:52.87C22:511.45C22:646.5實施例8：采用溶氧調(diào)控策略、氮源調(diào)控策略及分罐培養(yǎng)策略對100m3發(fā)酵罐裂殖壺菌(Schizochytriumsp.CGMCCNo.6843)發(fā)酵生產(chǎn)DHA的影響將裂殖壺菌(Schizochytriumsp.CGMCCNo.6843)斜面保藏菌株接入裝有400mL培養(yǎng)基的2L搖瓶，在25℃的溫度下以200rpm的轉(zhuǎn)速培養(yǎng)24h，完成菌株活化培養(yǎng)。按照0.4％的接種量將搖瓶種子液接入裝有滅菌后培養(yǎng)基的一級種子罐中，培養(yǎng)溫度28℃、通氣量1vvm、罐壓0.02MPa、攪拌轉(zhuǎn)速50rpm培養(yǎng)30h，完成一級種子擴大培養(yǎng)。按照3％的接種量將一級種子罐的種子液接入裝有滅菌后培養(yǎng)基的二級種子罐中，培養(yǎng)溫度28℃、通氣量1vvm、罐壓0.02MPa、攪拌轉(zhuǎn)速75rpm培養(yǎng)24h，完成二級種子擴大培養(yǎng)。按照3％的接種量將二級種子罐的種子液接入裝有滅菌后培養(yǎng)基的發(fā)酵罐中。發(fā)酵過程培養(yǎng)溫度28℃、通氣量1－2vvm、罐壓0.02－0.05MPa、攪拌轉(zhuǎn)速50－100rpm，流加含20％預(yù)處理后粗甘油的碳源，控制葡萄糖濃度在1g/L，進行發(fā)酵培養(yǎng)。采用溶氧調(diào)控策略將發(fā)酵36h前DO控制在30％、發(fā)酵36h后DO控制在5％，過程中以DO為控制指標，調(diào)整通氣量、罐壓及攪拌轉(zhuǎn)速，并適當補入滅菌后新鮮培養(yǎng)基或無菌水。發(fā)酵過程中發(fā)酵36h前流加25％的氨水控制發(fā)酵液pH在6左右，流加氨水補充氮源的同時可以控制發(fā)酵液pH穩(wěn)定，36h后停止流加氨水，進行缺氮培養(yǎng)，pH不再作控制。發(fā)酵至12h將發(fā)酵罐中發(fā)酵液按體積一分為二培養(yǎng)，一半發(fā)酵液留在主罐中繼續(xù)培養(yǎng)，另一半發(fā)酵液通過壓差法轉(zhuǎn)移至無菌保壓的副罐中培養(yǎng)，主副罐中分別補入適量滅菌后新鮮培養(yǎng)基或無菌水，分罐培養(yǎng)后主副罐通氣量、罐壓及攪拌轉(zhuǎn)速均按溶氧調(diào)控策略作相應(yīng)調(diào)整。發(fā)酵過程中檢測發(fā)酵液葡萄糖濃度、pH、菌體生物量、粗油脂產(chǎn)量及DHA產(chǎn)量變化。培養(yǎng)96h后終止發(fā)酵，測定發(fā)酵液中生物量為140g/L，粗油脂產(chǎn)量為78.5g/L，DHA產(chǎn)量為40.4g/L，DHA生產(chǎn)率為10.1g/(L·d)。以下表9為發(fā)酵后所得混合油脂脂肪酸組成氣相分析結(jié)果：表9：100m3發(fā)酵罐發(fā)酵后所得混合油脂脂肪酸組成脂肪酸組成含量％C12:00.42C14:04.87C16:015.07C16:11.65C18:01.7C18:11.58C20:46.35C20:51.62C22:515.24C22:651.5實施例9：采用溶氧調(diào)控策略、氮源調(diào)控策略及分罐培養(yǎng)策略對100m3發(fā)酵罐裂殖壺菌(Schizochytriumsp.CGMCCNo.6843)發(fā)酵生產(chǎn)DHA的影響將裂殖壺菌(Schizochytriumsp.CGMCCNo.6843)斜面保藏菌株接入裝有400mL培養(yǎng)基的2L搖瓶，在25℃的溫度下以200rpm的轉(zhuǎn)速培養(yǎng)24h，完成菌株活化培養(yǎng)。按照0.4％的接種量將搖瓶種子液接入裝有滅菌后培養(yǎng)基的一級種子罐中，培養(yǎng)溫度28℃、通氣量1vvm、罐壓0.02MPa、攪拌轉(zhuǎn)速50rpm培養(yǎng)30h，完成一級種子擴大培養(yǎng)。按照3％的接種量將一級種子罐的種子液接入裝有滅菌后培養(yǎng)基的二級種子罐中，培養(yǎng)溫度28℃、通氣量1vvm、罐壓0.02MPa、攪拌轉(zhuǎn)速75rpm培養(yǎng)24h，完成二級種子擴大培養(yǎng)。按照3％的接種量將二級種子罐的種子液接入裝有滅菌后培養(yǎng)基的發(fā)酵罐中。發(fā)酵過程培養(yǎng)溫度28℃、通氣量1－2vvm、罐壓0.02－0.05MPa、攪拌轉(zhuǎn)速50－100rpm，流加含20％預(yù)處理后粗甘油的碳源，控制葡萄糖濃度在5g/L，進行發(fā)酵培養(yǎng)。采用溶氧調(diào)控策略將發(fā)酵60h前DO控制在50％、發(fā)酵60h后DO控制在10％，過程中以DO為控制指標，調(diào)整通氣量、罐壓及攪拌轉(zhuǎn)速，并適當補入滅菌后新鮮培養(yǎng)基或無菌水。發(fā)酵過程中發(fā)酵60h前流加45％的氨水控制發(fā)酵液pH在7左右，流加氨水補充氮源的同時可以控制發(fā)酵液pH穩(wěn)定，60h后停止流加氨水，進行缺氮培養(yǎng)，pH不再作控制。發(fā)酵至36h將發(fā)酵罐中發(fā)酵液按體積一分為二培養(yǎng)，一半發(fā)酵液留在主罐中繼續(xù)培養(yǎng)，另一半發(fā)酵液通過壓差法轉(zhuǎn)移至無菌保壓的副罐中培養(yǎng)，主副罐中分別補入適量滅菌后新鮮培養(yǎng)基或無菌水，分罐培養(yǎng)后主副罐通氣量、罐壓及攪拌轉(zhuǎn)速均按溶氧調(diào)控策略作相應(yīng)調(diào)整。發(fā)酵過程中檢測發(fā)酵液葡萄糖濃度、pH、菌體生物量、粗油脂產(chǎn)量及DHA產(chǎn)量變化。培養(yǎng)96h后終止發(fā)酵，測定發(fā)酵液中生物量為138g/L，粗油脂產(chǎn)量為78.6g/L，DHA產(chǎn)量為39.6g/L，DHA生產(chǎn)率為9.9g/(L·d)。以下表10為發(fā)酵后所得混合油脂脂肪酸組成氣相分析結(jié)果：表10：100m3發(fā)酵罐發(fā)酵后所得混合油脂脂肪酸組成脂肪酸組成含量％C12:00.41C14:04.88C16:015.32C16:11.64C18:01.71C18:11.6C20:46.38C20:51.58C22:516.08C22:650.4實施例10：采用溶氧調(diào)控策略、氮源調(diào)控策略及分罐培養(yǎng)策略對100m3發(fā)酵罐裂殖壺菌(Schizochytriumsp.CGMCCNo.6843)發(fā)酵生產(chǎn)DHA的影響將裂殖壺菌(Schizochytriumsp.CGMCCNo.6843)斜面保藏菌株接入裝有400mL培養(yǎng)基的2L搖瓶，在25℃的溫度下以200rpm的轉(zhuǎn)速培養(yǎng)24h，完成菌株活化培養(yǎng)。按照0.4％的接種量將搖瓶種子液接入裝有滅菌后培養(yǎng)基的一級種子罐中，培養(yǎng)溫度28℃、通氣量1vvm、罐壓0.02MPa、攪拌轉(zhuǎn)速50rpm培養(yǎng)30h，完成一級種子擴大培養(yǎng)。按照3％的接種量將一級種子罐的種子液接入裝有滅菌后培養(yǎng)基的二級種子罐中，培養(yǎng)溫度28℃、通氣量1vvm、罐壓0.02MPa、攪拌轉(zhuǎn)速75rpm培養(yǎng)24h，完成二級種子擴大培養(yǎng)。按照3％的接種量將二級種子罐的種子液接入裝有滅菌后培養(yǎng)基的發(fā)酵罐中。發(fā)酵過程培養(yǎng)溫度28℃、通氣量1－2vvm、罐壓0.02－0.05MPa、攪拌轉(zhuǎn)速50－100rpm，流加含20％預(yù)處理后粗甘油的碳源，控制葡萄糖濃度在2g/L，進行發(fā)酵培養(yǎng)。采用溶氧調(diào)控策略將發(fā)酵40h前DO控制在35％、發(fā)酵40h后DO控制在6％，過程中以DO為控制指標，調(diào)整通氣量、罐壓及攪拌轉(zhuǎn)速，并適當補入滅菌后新鮮培養(yǎng)基或無菌水。發(fā)酵過程中發(fā)酵40h前流加38％的氨水控制發(fā)酵液pH在6.5左右，流加氨水補充氮源的同時可以控制發(fā)酵液pH穩(wěn)定，40h后停止流加氨水，進行缺氮培養(yǎng)，pH不再作控制。發(fā)酵至20h將發(fā)酵罐中發(fā)酵液按體積一分為二培養(yǎng)，一半發(fā)酵液留在主罐中繼續(xù)培養(yǎng)，另一半發(fā)酵液通過壓差法轉(zhuǎn)移至無菌保壓的副罐中培養(yǎng)，主副罐中分別補入適量滅菌后新鮮培養(yǎng)基或無菌水，分罐培養(yǎng)后主副罐通氣量、罐壓及攪拌轉(zhuǎn)速均按溶氧調(diào)控策略作相應(yīng)調(diào)整。發(fā)酵過程中檢測發(fā)酵液葡萄糖濃度、pH、菌體生物量、粗油脂產(chǎn)量及DHA產(chǎn)量變化。培養(yǎng)96h后終止發(fā)酵，測定發(fā)酵液中生物量為139g/L，粗油脂產(chǎn)量為78.2g/L，DHA產(chǎn)量為38.0g/L，DHA生產(chǎn)率為9.5g/(L·d)。以下表11為發(fā)酵后所得混合油脂脂肪酸組成氣相分析結(jié)果：表11：100m3發(fā)酵罐發(fā)酵后所得混合油脂脂肪酸組成實施例11：采用溶氧調(diào)控策略、氮源調(diào)控策略及分罐培養(yǎng)策略對100m3發(fā)酵罐裂殖壺菌(Schizochytriumsp.CGMCCNo.6843)發(fā)酵生產(chǎn)DHA的影響將裂殖壺菌(Schizochytriumsp.CGMCCNo.6843)斜面保藏菌株接入裝有400mL培養(yǎng)基的2L搖瓶，在25℃的溫度下以200rpm的轉(zhuǎn)速培養(yǎng)24h，完成菌株活化培養(yǎng)。按照0.4％的接種量將搖瓶種子液接入裝有滅菌后培養(yǎng)基的一級種子罐中，培養(yǎng)溫度28℃、通氣量1vvm、罐壓0.02MPa、攪拌轉(zhuǎn)速50rpm培養(yǎng)30h，完成一級種子擴大培養(yǎng)。按照3％的接種量將一級種子罐的種子液接入裝有滅菌后培養(yǎng)基的二級種子罐中，培養(yǎng)溫度28℃、通氣量1vvm、罐壓0.02MPa、攪拌轉(zhuǎn)速75rpm培養(yǎng)24h，完成二級種子擴大培養(yǎng)。按照3％的接種量將二級種子罐的種子液接入裝有滅菌后培養(yǎng)基的發(fā)酵罐中。發(fā)酵過程培養(yǎng)溫度28℃、通氣量1－2vvm、罐壓0.02－0.05MPa、攪拌轉(zhuǎn)速50－100rpm，流加含40％預(yù)處理后粗甘油的碳源，控制葡萄糖濃度在4g/L，進行發(fā)酵培養(yǎng)。采用溶氧調(diào)控策略將發(fā)酵56h前DO控制在45％、發(fā)酵56h后DO控制在9％，過程中以DO為控制指標，調(diào)整通氣量、罐壓及攪拌轉(zhuǎn)速，并適當補入滅菌后新鮮培養(yǎng)基或無菌水。發(fā)酵過程中發(fā)酵56h前流加42％的氨水控制發(fā)酵液pH在7左右，流加氨水補充氮源的同時可以控制發(fā)酵液pH穩(wěn)定，56h后停止流加氨水，進行缺氮培養(yǎng)，pH不再作控制。發(fā)酵至28h將發(fā)酵罐中發(fā)酵液按體積一分為二培養(yǎng)，一半發(fā)酵液留在主罐中繼續(xù)培養(yǎng)，另一半發(fā)酵液通過壓差法轉(zhuǎn)移至無菌保壓的副罐中培養(yǎng)，主副罐中分別補入適量滅菌后新鮮培養(yǎng)基或無菌水，分罐培養(yǎng)后主副罐通氣量、罐壓及攪拌轉(zhuǎn)速均按溶氧調(diào)控策略作相應(yīng)調(diào)整。發(fā)酵過程中檢測發(fā)酵液葡萄糖濃度、pH、菌體生物量、粗油脂產(chǎn)量及DHA產(chǎn)量變化。培養(yǎng)96h后終止發(fā)酵，測定發(fā)酵液中生物量為140g/L，粗油脂產(chǎn)量為80.8g/L，DHA產(chǎn)量為42.0g/L，DHA生產(chǎn)率為10.5g/(L·d)。以下表12為發(fā)酵后所得混合油脂脂肪酸組成氣相分析結(jié)果：表12：100m3發(fā)酵罐發(fā)酵后所得混合油脂脂肪酸組成脂肪酸組成含量％C12:00.44C14:04.86C16:014.61C16:11.67C18:01.7C18:11.58C20:46.38C20:51.64C22:515.12C22:652實施例12：采用溶氧調(diào)控策略、氮源調(diào)控策略及分罐培養(yǎng)策略對100m3發(fā)酵罐裂殖壺菌(Schizochytriumsp.CGMCCNo.6843)發(fā)酵生產(chǎn)DHA的影響將裂殖壺菌(Schizochytriumsp.CGMCCNo.6843)斜面保藏菌株接入裝有400mL培養(yǎng)基的2L搖瓶，在25℃的溫度下以200rpm的轉(zhuǎn)速培養(yǎng)24h，完成菌株活化培養(yǎng)。按照0.4％的接種量將搖瓶種子液接入裝有滅菌后培養(yǎng)基的一級種子罐中，培養(yǎng)溫度28℃、通氣量1vvm、罐壓0.02MPa、攪拌轉(zhuǎn)速50rpm培養(yǎng)30h，完成一級種子擴大培養(yǎng)。按照3％的接種量將一級種子罐的種子液接入裝有滅菌后培養(yǎng)基的二級種子罐中，培養(yǎng)溫度28℃、通氣量1vvm、罐壓0.02MPa、攪拌轉(zhuǎn)速75rpm培養(yǎng)24h，完成二級種子擴大培養(yǎng)。按照3％的接種量將二級種子罐的種子液接入裝有滅菌后培養(yǎng)基的發(fā)酵罐中。發(fā)酵過程培養(yǎng)溫度28℃、通氣量1－2vvm、罐壓0.02－0.05MPa、攪拌轉(zhuǎn)速50－100rpm，流加含40％預(yù)處理后粗甘油的碳源，控制葡萄糖濃度在3g/L，進行發(fā)酵培養(yǎng)。采用溶氧調(diào)控策略將發(fā)酵44h前DO控制在38％、發(fā)酵44h后DO控制在7％，過程中以DO為控制指標，調(diào)整通氣量、罐壓及攪拌轉(zhuǎn)速，并適當補入滅菌后新鮮培養(yǎng)基或無菌水。發(fā)酵過程中發(fā)酵44h前流加40％的氨水控制發(fā)酵液pH在6.5左右，流加氨水補充氮源的同時可以控制發(fā)酵液pH穩(wěn)定，44h后停止流加氨水，進行缺氮培養(yǎng)，pH不再作控制。發(fā)酵至22h將發(fā)酵罐中發(fā)酵液按體積一分為二培養(yǎng)，一半發(fā)酵液留在主罐中繼續(xù)培養(yǎng)，另一半發(fā)酵液通過壓差法轉(zhuǎn)移至無菌保壓的副罐中培養(yǎng)，主副罐中分別補入適量滅菌后新鮮培養(yǎng)基或無菌水，分罐培養(yǎng)后主副罐通氣量、罐壓及攪拌轉(zhuǎn)速均按溶氧調(diào)控策略作相應(yīng)調(diào)整。發(fā)酵過程中檢測發(fā)酵液葡萄糖濃度、pH、菌體生物量、粗油脂產(chǎn)量及DHA產(chǎn)量變化。培養(yǎng)96h后終止發(fā)酵，測定發(fā)酵液中生物量為141g/L，粗油脂產(chǎn)量為81.2g/L，DHA產(chǎn)量為42.4g/L，DHA生產(chǎn)率為10.6g/(L·d)。以下表13為發(fā)酵后所得混合油脂脂肪酸組成氣相分析結(jié)果：表13：100m3發(fā)酵罐發(fā)酵后所得混合油脂脂肪酸組成實施例13：采用溶氧調(diào)控策略、氮源調(diào)控策略及分罐培養(yǎng)策略對100m3發(fā)酵罐裂殖壺菌(Schizochytriumsp.CGMCCNo.6843)發(fā)酵生產(chǎn)DHA的影響將裂殖壺菌(Schizochytriumsp.CGMCCNo.6843)斜面保藏菌株接入裝有400mL培養(yǎng)基的2L搖瓶，在25℃的溫度下以200rpm的轉(zhuǎn)速培養(yǎng)24h，完成菌株活化培養(yǎng)。按照0.4％的接種量將搖瓶種子液接入裝有滅菌后培養(yǎng)基的一級種子罐中，培養(yǎng)溫度28℃、通氣量1vvm、罐壓0.02MPa、攪拌轉(zhuǎn)速50rpm培養(yǎng)30h，完成一級種子擴大培養(yǎng)。按照3％的接種量將一級種子罐的種子液接入裝有滅菌后培養(yǎng)基的二級種子罐中，培養(yǎng)溫度28℃、通氣量1vvm、罐壓0.02MPa、攪拌轉(zhuǎn)速75rpm培養(yǎng)24h，完成二級種子擴大培養(yǎng)。按照3％的接種量將二級種子罐的種子液接入裝有滅菌后培養(yǎng)基的發(fā)酵罐中。發(fā)酵過程培養(yǎng)溫度28℃、通氣量1－2vvm、罐壓0.02－0.05MPa、攪拌轉(zhuǎn)速50－100rpm，流加含40％預(yù)處理后粗甘油的碳源，控制葡萄糖濃度在5g/L，進行發(fā)酵培養(yǎng)。采用溶氧調(diào)控策略將發(fā)酵52h前DO控制在42％、發(fā)酵52h后DO控制在8％，過程中以DO為控制指標，調(diào)整通氣量、罐壓及攪拌轉(zhuǎn)速，并適當補入滅菌后新鮮培養(yǎng)基或無菌水。發(fā)酵過程中發(fā)酵52h前流加40％的氨水控制發(fā)酵液pH在6.5左右，流加氨水補充氮源的同時可以控制發(fā)酵液pH穩(wěn)定，52h后停止流加氨水，進行缺氮培養(yǎng)，pH不再作控制。發(fā)酵至26h將發(fā)酵罐中發(fā)酵液按體積一分為二培養(yǎng)，一半發(fā)酵液留在主罐中繼續(xù)培養(yǎng)，另一半發(fā)酵液通過壓差法轉(zhuǎn)移至無菌保壓的副罐中培養(yǎng)，主副罐中分別補入適量滅菌后新鮮培養(yǎng)基或無菌水，分罐培養(yǎng)后主副罐通氣量、罐壓及攪拌轉(zhuǎn)速均按溶氧調(diào)控策略作相應(yīng)調(diào)整。發(fā)酵過程中檢測發(fā)酵液葡萄糖濃度、pH、菌體生物量、粗油脂產(chǎn)量及DHA產(chǎn)量變化。培養(yǎng)96h后終止發(fā)酵，測定發(fā)酵液中生物量為142g/L，粗油脂產(chǎn)量為80.2g/L，DHA產(chǎn)量為41.2g/L，DHA生產(chǎn)率為10.3g/(L·d)。以下表14為發(fā)酵后所得混合油脂脂肪酸組成氣相分析結(jié)果：表14：100m3發(fā)酵罐發(fā)酵后所得混合油脂脂肪酸組成脂肪酸組成含量％C12:00.45C14:04.86C16:015.06C16:11.65C18:01.72C18:11.56C20:46.35C20:51.59C22:515.36C22:651.4提取毛油實施例14取實施例5得到的DHA發(fā)酵液100L，經(jīng)加熱滅活處理后，用布料器將發(fā)酵液運至布料腔中，進行布料包裹，布料完畢后，進行一級壓榨，采用逐步加壓的方式，在設(shè)定的2h內(nèi)達到設(shè)定的30MPa壓力，保壓2h到基本沒有水滴流出。去掉一級壓榨籠，換上二級壓榨籠，推入二級壓榨處，進行二級壓榨，采用逐步加壓的方式，在設(shè)定的2h內(nèi)達到設(shè)定的100MPa壓力，保壓2h到基本沒有油滴流出，收集壓榨出來的DHA毛油，共得到DHA毛油6.8kg，發(fā)酵液至毛油收率82.3％。去掉二級壓榨籠，將壓完的微藻粕與濾布進行分離。實施例15取實施例5得到的DHA發(fā)酵液100L，經(jīng)加熱滅活處理后，用布料器將發(fā)酵液運至布料腔中，進行布料包裹，布料完畢后，進行一級壓榨，采用逐步加壓的方式，在設(shè)定的5h內(nèi)達到設(shè)定的40MPa壓力，保壓4h到基本沒有水滴流出。去掉一級壓榨籠，換上二級壓榨籠，推入二級壓榨處，進行二級壓榨，采用逐步加壓的方式，在設(shè)定的5h內(nèi)達到設(shè)定的150MPa壓力，保壓4h到基本沒有油滴流出，收集壓榨出來的DHA毛油，共得到DHA毛油7.3kg，發(fā)酵液至毛油收率88.4％。去掉二級壓榨籠，將壓完的微藻粕與濾布進行分離。實施例16取實施例5得到的DHA發(fā)酵液150L，經(jīng)加熱滅活處理后，采用蝶式離心機離心，去除離心輕液，得到95L濃縮后的發(fā)酵液，用布料器將濃縮后的發(fā)酵液運至布料腔中，進行布料包裹，布料完畢后，進行一級壓榨，采用逐步加壓的方式，在設(shè)定的5h內(nèi)達到設(shè)定的40MPa壓力，保壓4h到基本沒有水滴流出。去掉一級壓榨籠，換上二級壓榨籠，推入二級壓榨處，進行二級壓榨，采用逐步加壓的方式，在設(shè)定的5h內(nèi)達到設(shè)定的150MPa壓力，保壓4h到基本沒有油滴流出，收集壓榨出來的DHA毛油，共得到DHA毛油10.8kg，發(fā)酵液至毛油收率87.2％。去掉二級壓榨籠，將壓完的微藻粕與濾布進行分離。實施例17取實施例5得到的DHA發(fā)酵液300L，經(jīng)加熱滅活處理后，加入噴霧干燥器中，設(shè)定噴霧壓力5MPa，進風溫度180℃，出風溫度80℃，噴霧干燥成粉末，得到DHA微藻粉52.5kg。DHA微藻粉運至布料腔中，進行布料包裹，布料完畢后，進行柔性壓榨壓榨，采用逐步加壓的方式，在設(shè)定的2h內(nèi)達到設(shè)定的100MPa壓力，保壓2h到基本沒有油滴流出，收集壓榨出來的DHA毛油，共得到DHA毛油22.1kg，發(fā)酵液至毛油收率89.2％。實施例18取實施例5得到的DHA發(fā)酵液300L，經(jīng)加熱滅活處理后，加入噴霧干燥器中，設(shè)定噴霧壓力6MPa，進風溫度200℃，出風溫度100℃，噴霧干燥成粉末，得到DHA微藻粉51.0kg。DHA微藻粉運至布料腔中，進行布料包裹，布料完畢后，進行柔性壓榨壓榨，采用逐步加壓的方式，在設(shè)定的4h內(nèi)達到設(shè)定的150MPa壓力，保壓4h到基本沒有油滴流出，收集壓榨出來的DHA毛油，共得到DHA毛油22.8kg，發(fā)酵液至毛油收率92.0％。實施例19取實施例5得到的DHA發(fā)酵液300L，經(jīng)加熱滅活處理后，采用蝶式離心機離心，去除離心輕液，得到200L濃縮后的發(fā)酵液，加入噴霧干燥器中，設(shè)定噴霧壓力8MPa，進風溫度220℃，出風溫度110℃，噴霧干燥成粉末，得到DHA微藻粉47.5kg。DHA微藻粉運至布料腔中，進行布料包裹，布料完畢后，進行柔性壓榨壓榨，采用逐步加壓的方式，在設(shè)定的4h內(nèi)達到設(shè)定的150MPa壓力，保壓4h到基本沒有油滴流出，收集壓榨出來的DHA毛油，共得到DHA毛油23.3kg，發(fā)酵液至毛油收率94.0％。對比例1取實施例5得到的DHA發(fā)酵液300L，經(jīng)加熱滅活處理后，采用蝶式離心機離心，去除離心輕液，得到200L濃縮后的發(fā)酵液，加入噴霧干燥器中，設(shè)定噴霧壓力8MPa，進風溫度220℃，出風溫度110℃，噴霧干燥成粉末，得到DHA微藻粉47.8kg。雙螺桿壓榨機先預(yù)熱至80℃，將DHA微藻粉加入雙螺桿壓榨機中榨油，得到DHA毛油11.6kg，發(fā)酵液至毛油收率46.81％。毛油精煉實施例20取10kg實施例14、15、16合并所得的DHA毛油，按水化、脫色、分子蒸餾步驟進行精煉。水化：10kgDHA毛油，升溫至至75℃，加入1kg溫度為80℃的純化水，攪拌30min，攪拌速度30轉(zhuǎn)/min，靜置2h，分去下層，得到水化油9.75kg。脫色：水化油升溫至100℃，控制真空度-0.075MPa，真空脫水1h，然后降溫至70℃，加入脫色劑(191g活性炭和286g活性白土)，攪拌脫色0.5h，停止攪拌，過濾去除脫色劑，得到脫色油9.30kg。分子蒸餾：脫色油進入三級分子蒸餾，控制第一級真空度90Pa左右、溫度160℃，去除第一級的輕組分，重組分進入第二級分子蒸餾，控制二級真空度40Pa左右、溫度200℃，去除第二級輕組分，重組分進入第三級分子蒸餾，控制第三級真空度3Pa左右、溫度220℃，去除第三級輕組分，收集重組分，脫臭完畢，降溫至30℃，添加抗氧化劑，包裝，得到DHA成品油9.10kg，檢驗結(jié)果見表15。表15：DHA成品油檢驗結(jié)果實施例21取10kg實施例14、15、16合并所得的DHA毛油，按水化、脫色、分子蒸餾步驟進行精煉。水化：10kgDHA毛油，升溫至至85℃，加入1kg溫度為90℃的純化水，攪拌15min，攪拌速度90轉(zhuǎn)/min，靜置4h，分去下層，得到水化油9.70kg。脫色：水化油升溫至110℃，控制真空度-0.075MPa，真空脫水0.5h，然后降溫至80℃，加入脫色劑(192g活性炭和288g活性白土)，攪拌脫色1h，停止攪拌，過濾去除脫色劑，得到脫色油9.31kg。分子蒸餾：脫色油進入三級分子蒸餾，控制第一級真空度90Pa左右、溫度200℃，去除第一級的輕組分，重組分進入第二級分子蒸餾，控制二級真空度40Pa左右、溫度220℃，去除第二級輕組分，重組分進入第三級分子蒸餾，控制第三級真空度3Pa左右、溫度250℃，去除第三級輕組分，收集重組分，分子蒸餾完畢，降溫至30℃，添加抗氧化劑，包裝，得到DHA成品油9.03kg，檢驗結(jié)果見表16。表16：DHA成品油檢驗結(jié)果實施例22取10kg實施例17、18、19合并所得的DHA毛油，按實施例20的精煉方法進行精煉，得到DHA成品油9.13kg，檢驗結(jié)果見表17。表17：DHA成品油檢驗結(jié)果實施例23取10kg實施例17、18、19合并所得的DHA毛油，按實施例21的精煉方法進行精煉，得到DHA成品油9.08kg，檢驗結(jié)果見表18。表18：DHA成品油檢驗結(jié)果對比例2取10kg實施例17、18、19合并所得的DHA毛油，按傳統(tǒng)精煉方法即水化、堿煉、脫色、脫臭步驟進行精煉。水化：10kgDHA毛油，升溫至至85℃，加入1kg溫度為90℃的純化水，攪拌15min，攪拌速度90轉(zhuǎn)/min，靜置4h，分去下層，得到水化油9.71kg。堿煉：水化油保溫在75℃，加入1L濃度10％(質(zhì)量分數(shù))的NaOH溶液，攪拌30min，攪拌速度30轉(zhuǎn)/min，靜置4h，分離掉皂腳，得到堿煉油，堿煉油攪拌情況下噴灑入油重10％的80℃純化水進行水洗，加水時間控制在10－30min，加完水后采用靜置2h，分離水層，重復(fù)洗滌2次，得到堿煉油8.92kg。脫色：堿煉油升溫至110℃，控制真空度-0.075MPa，真空脫水0.5h，然后降溫至80℃，加入脫色劑(186g活性炭和280g活性白土)，攪拌脫色1h，停止攪拌，過濾去除脫色劑，得到脫色油8.49kg。脫臭：脫色油移入脫臭鍋，通水蒸氣進行脫臭，脫臭溫度控制在185℃，真空度控制在600Pa以內(nèi)，脫臭時間2h，脫臭完畢，停止通蒸汽，降溫至30℃，添加抗氧化劑，包裝，得到DHA成品油8.31kg，檢測結(jié)果見表19。表19：DHA成品油檢驗結(jié)果當前第1頁1 2 3