一種促進紅曲菌液態(tài)發(fā)酵生產(chǎn)紅曲黃色素的方法與流程

文檔序號：11145549閱讀：732來源：國知局

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本發(fā)明涉及一種促進紅曲菌液態(tài)發(fā)酵生產(chǎn)紅曲黃色素的方法，屬于微生物發(fā)酵技術(shù)領(lǐng)域。

背景技術(shù)：

目前，微生物發(fā)酵法和植物抽提法為生產(chǎn)天然黃色素的兩種主要方法。植物來源的天然黃色素如：梔子黃色素、紅花黃色素、姜黃色素、玉米黃色素、桔皮黃色素、南瓜黃色素等，這些植物來源的色素在生產(chǎn)過程中面臨各方面的局限性，一方面抽提過程中要采用有機試劑，成本較高，產(chǎn)量及應(yīng)用受限，另一方面其季節(jié)性很強，其生產(chǎn)在季節(jié)的影響下會導(dǎo)致設(shè)備的利用率低下，造成資源浪費。相反，利用微生物發(fā)酵法生產(chǎn)天然黃色素基本安全無毒，具有十分廣闊的發(fā)展前景。

為提高紅曲黃色素生產(chǎn)水平，國內(nèi)外文獻(xiàn)報道的論文或?qū)＠P(guān)注的重點主要集中在高產(chǎn)紅曲菌種的誘變篩選方面，但收效不大。例如泰國Yongsmith的科研團隊從20世紀(jì)90年代以來通過誘變選育到了單產(chǎn)黃色素的紅曲菌，應(yīng)用于液態(tài)發(fā)酵和固態(tài)發(fā)酵生產(chǎn)紅曲黃色素。該菌株生產(chǎn)的紅曲黃色素的最大吸收峰對應(yīng)的波長是370nm。但液態(tài)發(fā)酵法黃色素生產(chǎn)水平非常低，至今尚未實現(xiàn)工業(yè)化生產(chǎn)。該菌固態(tài)發(fā)酵12天生產(chǎn)的紅曲黃(米)色價達(dá)到2224.63U/gdw，雖然色素生產(chǎn)水平較高，但發(fā)酵時間過長。國內(nèi)周波等人通過誘變選育出了紅曲黃色素產(chǎn)生菌，該菌株生產(chǎn)的紅曲黃色素的最大吸收峰對應(yīng)的波長是410nm，液態(tài)發(fā)酵7天的發(fā)酵液黃色素色價值僅達(dá)110U/mL。以上幾例由于發(fā)酵色素濃度偏低，發(fā)酵時間偏長，均不符合工業(yè)化生產(chǎn)的要求。

本實驗室在發(fā)明專利“一種偶聯(lián)原位萃取發(fā)酵紅曲黃色素的雙液相發(fā)酵方法”(專利號201410116854)中，通過設(shè)計合理的碳氮源組分、控制培養(yǎng)基中游離氨基酸的含量以及雙液相發(fā)酵體系，將合成的紅曲黃色素迅速富集到脂溶性溶劑中(所述脂溶性溶劑主要指甘油酯類物質(zhì))，從而大大提高紅曲黃色素的生產(chǎn)效率。但是在實際生產(chǎn)過程中，發(fā)現(xiàn)仍然有產(chǎn)物抑制的現(xiàn)象，胞內(nèi)色素的分泌仍然會受到限制，因此有必要使得黃色素產(chǎn)量得以進一步提高。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

目前紅曲菌發(fā)酵產(chǎn)紅曲黃色素的合成途徑仍然沒有得到深入的研究，采用普通的液態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基成分，很難達(dá)到高產(chǎn)紅曲黃色素的目的。在原位萃取發(fā)酵的基礎(chǔ)上，產(chǎn)物抑制得到一部分的解除，同時傳質(zhì)以及傳氧得以部分的提高，但是仍有進一步提高紅曲黃色素產(chǎn)量的必要。本發(fā)明通過添加表面活性劑的方法，增大細(xì)胞膜的通透性，在解除底物抑制的同時增加細(xì)胞內(nèi)的傳質(zhì)、氧傳遞系數(shù)。該方法操作簡單，不增加額外的人工和設(shè)備，僅通過較低的附加投入，就可以提高目標(biāo)產(chǎn)物的合成濃度，因而具有重大的經(jīng)濟效益。

本發(fā)明提供了一種促進紅曲菌液態(tài)發(fā)酵生產(chǎn)紅曲黃色素的方法，所述方法是在紅曲菌的液態(tài)發(fā)酵初始或者發(fā)酵過程中加入表面活性劑。

在一種實施方式中，所述紅曲菌是能夠產(chǎn)紅曲黃色素的紅曲菌。

在一種實施方式中，所述表面活性劑為Span系列、Tween系列、Triton X-100、PEG系列或者皂角。所述表面活性劑有解除產(chǎn)物抑制以及提高溶氧的作用，可以大幅提高紅曲菌對黃色素的合成能力和產(chǎn)率。

在一種實施方式中，所述表面活性劑為Span-80、Tween-20、Triton X-100、PEG中的任意一種。

在一種實施方式中，所述表面活性劑的添加量為0.1g/L-15g/L。

在一種實施方式中，所述表面活性劑的添加時機為液態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)開始后0～96h內(nèi)。

在一種實施方式中，所述表面活性劑的添加時機為液態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)開始后24～96h內(nèi)。

在一種實施方式中，所述發(fā)酵是在轉(zhuǎn)速為180r/min，溫度30℃條件下，發(fā)酵培養(yǎng)8d。

在一種實施方式中，所述方法是接種紅曲菌種子液于液態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基中進行發(fā)酵；在液態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)開始后0～96h內(nèi)加入表面活性劑。

在一種實施方式中，所述液態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基是采用含有紅曲菌生長所需營養(yǎng)成分的基本培養(yǎng)基。

在一種實施方式中，所述液態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基是由水相和萃取相組成的雙液相萃取發(fā)酵體系，所述水相是含有紅曲菌生長所需營養(yǎng)成分的基本培養(yǎng)基，所述萃取相含有甘油酯類物質(zhì)。

在一種實施方式中，所述基本培養(yǎng)基含有玉米淀粉20-80g/L，黃豆粉0.05-10g/L，硫酸銨3-10g/L，NaNO₃2-6g/L，酵母膏0.05-5g/L，玉米漿粉0.05-10g/L，硫酸鋅0.1-0.5g/L，硫酸鎂0.5-1.5g/L，磷酸二氫鉀0.5-1.5g/L。

在一種實施方式中，所述萃取相中的甘油酯類物質(zhì)作為萃取劑有提高溶氧的作用，可將附著在發(fā)酵液中及紅曲菌球表面的色素萃取富集到萃取劑相中，大幅度提高紅曲液態(tài)發(fā)酵合成黃色素產(chǎn)物的濃度和產(chǎn)率。

在一種實施方式中，所述甘油酯類物質(zhì)是甘油三酯類物質(zhì)，用量體積占基本培養(yǎng)基體積的10-40％。所述甘油三酯類物質(zhì)可以是三辛酸甘油酯、三異辛酸甘油酯、植物油或其混合物。

在一種實施方式中，所述萃取相為10份大豆油、8份玉米油、1份三辛酸甘油酯、0.3份二辛酸甘油酯、0.2份辛酸甘油酯的混合。

在一種實施方式中，所述甘油酯類物質(zhì)除甘油三酯類物質(zhì)，同時還包括甘油二酯類物質(zhì)、甘油單酯類物質(zhì)或其混合物。

本發(fā)明的優(yōu)點和效果：

本發(fā)明的提高紅曲黃色素產(chǎn)量的方法，經(jīng)濟高效，且不會改變色素的結(jié)構(gòu)，是一種理想的生產(chǎn)方法，在工業(yè)大規(guī)模生產(chǎn)中的可行性較高。

具體實施方案

黃色素色價的測定方法：

色價為色素濃度的一種表示方法，大小等于稀釋倍數(shù)與稀釋后的色素溶液在其吸收峰處對應(yīng)的OD值的乘積，單位為U/mL。

用無水乙醇對待測溶液稀釋適當(dāng)倍數(shù)(將OD值控制在0.2-0.8之間)，并以無水乙醇的吸光度為空白對照在200-600nm范圍內(nèi)進行全波長掃描，測定400-440nm之間峰值的OD值。

黃色素色價＝OD_410nm×總稀釋倍數(shù)(U/mL)

實施例1：

選擇紫色紅曲菌sjs-6、CICC編號為40225、CICC編號為40937、CICC編號為5042的紫色紅曲菌，和CGMCC編號為3.4701、CGMCC編號為3.4652、CGMCC編號為3.465、CGMCC編號為3.4649的紅色紅曲菌為搖瓶菌種，其發(fā)酵基本培養(yǎng)基(g/L)：玉米淀粉60，硫酸銨4，硝酸鈉2，硫酸鎂0.5，磷酸二氫鉀2，磷酸氫二鉀2，氯化鈣0.1；

處于對數(shù)生長期的紅曲菌液體種子以體積比10％的接種量接入裝有50mL發(fā)酵基本培養(yǎng)基的500mL三角瓶中，在轉(zhuǎn)速為180r/min，溫度30℃條件下，搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)8d。結(jié)束后測得這八株菌sjs-6、CICC 40225、CICC 40937、CICC 5042、CGMCC 3.4701、CGMCC 3.4652、CGMCC 3.465、CGMCC 3.4649的紅曲黃色素的色價分別為50U/mL、32U/mL、26U/mL、24U/mL、42U/mL、28U/mL、36U/mL、37U/mL。

實施例2：

處于對數(shù)生長期的紅曲菌液體種子以體積比10％的接種量接入裝有50mL發(fā)酵基本培養(yǎng)基的500mL三角瓶中，同時分別在發(fā)酵初始時添加1g/L的span-80、Tween-20、Triton X-100、PEG在轉(zhuǎn)速為180r/min，在轉(zhuǎn)速為180r/min，溫度30℃條件下，搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)8d。結(jié)束后分別測得紅曲黃色素的色價，結(jié)果如表1所示。

表1不同表面活性劑對菌株產(chǎn)紅曲黃色素的影響

實施例3：

選擇紫色紅曲菌sjs-6、CICC編號為40225、CICC編號為40937、CICC編號為5042的紫色紅曲菌為搖瓶菌種，其發(fā)酵基本培養(yǎng)基(g/L)：玉米淀粉60，硫酸銨4，硝酸鈉2，硫酸鎂0.5，磷酸二氫鉀2，磷酸氫二鉀2，氯化鈣0.1；

處于對數(shù)生長期的紅曲菌液體種子以體積比10％的接種量接入裝有50mL發(fā)酵基本培養(yǎng)基的500mL三角瓶中，加入甘油脂類原位萃取相20mL(萃取相為10份大豆油、8份玉米油、1份三辛酸甘油酯、0.3份二辛酸甘油酯、0.2份辛酸甘油酯的混合)，在轉(zhuǎn)速為180r/min，溫度30℃條件下，搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)8d。結(jié)束后測得紅曲黃色素的色價210U/mL、160U/mL、180U/mL、110U/mL。

實施例4：