本發(fā)明涉及微生物發(fā)酵
技術(shù)領(lǐng)域：
，具體涉及一種高濃度γ-聚谷氨酸及其發(fā)酵方法。
背景技術(shù)：
：γ-聚谷氨酸（poly-γ-glutamicacid，簡(jiǎn)稱γ-PGA）是一種氨基酸聚合物，由L/D-谷氨酸通過γ-聚谷酰鍵連接而成，其分子量一般在100-1000KDa之間，相當(dāng)于500-5000個(gè)谷氨酸單體聚合而成。γ-聚谷氨酸具有優(yōu)良的水溶性、超強(qiáng)的吸附性和生物可降解性，降解產(chǎn)物為無公害的谷氨酸，是一種優(yōu)良的環(huán)保型高分子材料，可作為保水劑、重金屬離子吸附劑、絮凝劑、緩釋劑以及藥物載體等，在化妝品、環(huán)境保護(hù)、食品、醫(yī)藥、農(nóng)業(yè)、沙漠治理等產(chǎn)業(yè)均有很大的商業(yè)價(jià)值和社會(huì)價(jià)值。γ-聚谷氨酸的主要發(fā)酵方法有化學(xué)合成法、提取法和生物合成法。相比于生物合成法，前兩種方法工藝復(fù)雜、副產(chǎn)物多、產(chǎn)量低、環(huán)境污染較大。目前，國(guó)內(nèi)外主要是利用以芽孢桿菌為代表的微生物來發(fā)酵生產(chǎn)γ-聚谷氨酸。在二十世紀(jì)九十年代以來，科研工作者們?cè)诤Y選γ-聚谷氨酸高產(chǎn)菌株及改善γ-聚谷氨酸的發(fā)酵工藝方面做了大量的研究工作。Kubota從土壤中分離得到一株BacillussubtilisF201，γ-聚谷氨酸的最大產(chǎn)量可達(dá)到50g/L。Yoon對(duì)BacilluslicheniformisATCC9945a利用高密度流加培養(yǎng)，在發(fā)酵35h后，γ-聚谷氨酸的產(chǎn)量達(dá)到最大值39g/L。江波等從土壤中篩選一株Bacillusmethylotrophicus，該菌株可不依賴于谷氨酸進(jìn)行發(fā)酵，產(chǎn)量達(dá)到17g/L，其專利公開號(hào)為CN102268389。喬長(zhǎng)冕等通過向培養(yǎng)基中添加硝酸鈉，調(diào)節(jié)聚谷氨酸合成酶的活性，提高了谷氨酸的轉(zhuǎn)化率，γ-聚谷氨酸的產(chǎn)量達(dá)到45-55g/L，其專利公布號(hào)為CN103695485。目前利用微生物發(fā)酵生產(chǎn)γ-聚谷氨酸的過程中，合成代謝途徑較為復(fù)雜，發(fā)酵液極其粘稠，發(fā)酵液的高粘度顯著降低了溶氧濃度，并大大增加了傳質(zhì)阻力系數(shù)，使得氧氣供給困難，營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)得不到有效利用。這極大地限制了菌體的生長(zhǎng)代謝，最終導(dǎo)致γ-聚谷氨酸產(chǎn)量較低。因此，尋找一種改善培養(yǎng)菌體的低氧環(huán)境及提高發(fā)酵液的傳質(zhì)系數(shù)，是目前發(fā)酵生產(chǎn)γ-聚谷氨酸亟待解決的問題。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：為了克服現(xiàn)有技術(shù)中存在的缺點(diǎn)和不足，本發(fā)明的目的在于提供一種高濃度γ-聚谷氨酸的發(fā)酵方法，該發(fā)酵方法可以解決菌體生長(zhǎng)過程中供氧不足的難題，在低成本的液體培養(yǎng)基中實(shí)現(xiàn)γ-聚谷氨酸的高產(chǎn)。本發(fā)明的另一目的在于提供一種高濃度γ-聚谷氨酸。本發(fā)明的目的通過下述技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)：一種高濃度γ-聚谷氨酸的發(fā)酵方法，包括如下步驟：（1）將產(chǎn)γ-聚谷氨酸的枯草芽孢桿菌接種到含有Span20的發(fā)酵培養(yǎng)基中進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)；（2）在發(fā)酵培養(yǎng)5-7h，添加一定量的正十二烷；（3）在發(fā)酵培養(yǎng)5-7h開始，每隔3-5h，添加一定量的H2O2；（4）從發(fā)酵培養(yǎng)18-24h開始，流加蔗糖溶液、谷氨酸鈉溶液和酵母粉溶液，流加至56-78h，發(fā)酵結(jié)束；（5）分離提取發(fā)酵液中的γ-聚谷氨酸。表面活性劑Span20具有改善發(fā)酵環(huán)境的作用，它的非極性端結(jié)合在菌體表面，能夠使菌體分散度增加，強(qiáng)化傳質(zhì)效果。此外，Span20還能提高細(xì)胞膜的通透性，增加菌體細(xì)胞的攝氧速率。為了在不增加能耗的情況下，進(jìn)一步改善菌體生長(zhǎng)的低氧環(huán)境，本發(fā)明一方面進(jìn)行了氧載體強(qiáng)化溶氧的研究，在載體中氧氣的溶解度比在水中的溶解度高很多。氧載體增加溶氧的方法與提高通氣量強(qiáng)化溶氧的方法相比，具有氧氣傳遞速率快、利用率高、能耗低、氣泡少、液體剪切力小等優(yōu)點(diǎn)。因此，氧載體的方法非常適合應(yīng)用于γ-聚谷氨酸的發(fā)酵生產(chǎn)，本發(fā)明選取了正十二烷進(jìn)行研究，它與Span20共同作用取得了更佳的實(shí)驗(yàn)效果。在另一方面，本發(fā)明通過添加合適濃度的H2O2來增加氧氣的供應(yīng)，并對(duì)菌體細(xì)胞產(chǎn)生一定的氧化脅迫，刺激更多γ-聚谷氨酸的形成，此種方法具有成本低、效率高、環(huán)境污染低、不增加能耗等優(yōu)點(diǎn)。本發(fā)明與相應(yīng)的不添加Span20、正十二烷和H2O2的方法相比可獲得更多的γ-聚谷氨酸，在本發(fā)明的具體實(shí)施方式中，γ-聚谷氨酸的產(chǎn)量達(dá)到55g/L左右。在本發(fā)明中，產(chǎn)γ-聚谷氨酸的枯草芽孢桿菌為本鄰域技術(shù)人員所熟知，如本發(fā)明
背景技術(shù)：
部分所提及的，本發(fā)明優(yōu)選采用的枯草芽孢桿菌將在下文中更詳盡地描述；枯草芽孢桿菌的發(fā)酵溫度為34-38℃，本發(fā)明優(yōu)選采用37℃。優(yōu)選的，所述步驟（1）中，產(chǎn)γ-聚谷氨酸的枯草芽孢桿菌是于2014年5月20日保藏于波頓香料有限公司保藏中心的枯草芽孢桿菌PBS55，其保藏編號(hào)為CMCC3366。優(yōu)選的，所述步驟（1）中，產(chǎn)γ-聚谷氨酸的枯草芽孢桿菌是在種子培養(yǎng)基中活化培養(yǎng)而獲得的，種子培養(yǎng)基包括如下組分：蛋白胨10-30g/L、酵母粉4-20g/L、氯化鈉10-20g/L、硫酸鎂0.5-4g/L、磷酸二氫鉀1-8g/L和氯化銨2-10g/L，pH為6.0-8.0。更為優(yōu)選的，種子培養(yǎng)基包括如下組分：蛋白胨為12-18g/L，酵母粉為6-12g/L，氯化鈉為12-16g/L，硫酸鎂1-3g/L，磷酸二氫鉀1.5-5g/L，氯化銨為3-6g/L，pH為6.5-7.5。在本發(fā)明中，如未特別指出培養(yǎng)基中的添加物，培養(yǎng)基僅僅是未添加相應(yīng)添加物的培養(yǎng)基。優(yōu)選的，所述步驟（1）中，發(fā)酵培養(yǎng)基包括如下組分：蔗糖30-100g/L、蛋白胨10-30g/L、酵母粉5-20g/L、谷氨酸鈉20-80g/L、硫酸鎂0.5-3g/L和磷酸二氫鉀2-5g/L，pH為6.5-7.5。更為優(yōu)選的，所述步驟（1）中，發(fā)酵培養(yǎng)基包括如下組分：蔗糖40-100g/L、蛋白胨15-20g/L、酵母粉6-12g/L、谷氨酸鈉30-70g/L、硫酸鎂1-2g/L和磷酸二氫鉀2-3g/L，pH為6.8-7.2。優(yōu)選的，所述步驟（1）中，培養(yǎng)參數(shù)為：培養(yǎng)溫度為34-38℃，攪拌轉(zhuǎn)速300-400r/min，通氣量1-2vvm，罐壓0.04-0.1mPa。更為優(yōu)選的，所述步驟（1）中，培養(yǎng)參數(shù)為：培養(yǎng)溫度為37℃，攪拌轉(zhuǎn)速350r/min，通氣量1.5vvm，罐壓0.08mPa。優(yōu)選的，所述步驟（1）中，Span20的添加量為1-10ml/L；所述步驟（2）中，正十二烷的添加量為10-60ml/L；所述步驟（3）中，H2O2的添加量為3-20ml/L。更為優(yōu)選的，所述步驟（1）中，Span20的添加量為2-6ml/L；所述步驟（2）中，正十二烷的添加量為20-40ml/L；所述步驟（3）中，H2O2的添加量為5-10ml/L。優(yōu)選的，所述步驟（4）中，蔗糖溶液的質(zhì)量濃度為45-55%，流加速度為每小時(shí)6-12mL/L；酵母粉溶液的質(zhì)量濃度為15-25%，流加速度為每小時(shí)3-6mL/L；谷氨酸鈉溶液的質(zhì)量濃度為45-55%，流加速度為每小時(shí)4-8mL/L。更為優(yōu)選的，所述步驟（4）中，蔗糖溶液的質(zhì)量濃度為50%，流加速度為每小時(shí)6-12mL/L；酵母粉溶液的質(zhì)量濃度為20%，流加速度為每小時(shí)3-6mL/L；谷氨酸鈉溶液的質(zhì)量濃度為40%，流加速度為每小時(shí)4-8mL/L。本發(fā)明在發(fā)酵罐上，通過連續(xù)留加底物方式控制菌體的生長(zhǎng)和代謝，進(jìn)一步促進(jìn)了γ-聚谷氨酸的生成。分別在不同時(shí)間留加蔗糖、谷氨酸鈉和酵母粉等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，在10-100L發(fā)酵罐中培養(yǎng)，γ-聚谷氨酸產(chǎn)量可達(dá)50g/L以上，比利用該菌種單批發(fā)酵產(chǎn)量提高了25%左右。本發(fā)明的另一目的通過下述技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)：一種高濃度γ-聚谷氨酸，所述高濃度γ-聚谷氨酸根據(jù)上述所述的發(fā)酵方法制得。本發(fā)明的有益效果在于：本發(fā)明的發(fā)酵方法可以解決菌體生長(zhǎng)過程中供氧不足的難題，在低成本的液體培養(yǎng)基中實(shí)現(xiàn)γ-聚谷氨酸的高產(chǎn)，還具有成本低、效率高、環(huán)境污染低、不增加能耗等優(yōu)點(diǎn)。附圖說明圖1是實(shí)施例2在10L發(fā)酵罐上不添加調(diào)節(jié)劑單批發(fā)酵生產(chǎn)γ-聚谷氨酸的蔗糖、谷氨酸及γ-聚谷氨酸含量變化圖。圖2是實(shí)施例2在10L發(fā)酵罐上不添加調(diào)節(jié)劑單批發(fā)酵生產(chǎn)γ-聚谷氨酸的DO及相關(guān)氧化酶酶活變化圖。圖3是實(shí)施例3在10L發(fā)酵罐上通過添加調(diào)節(jié)劑單批發(fā)酵生產(chǎn)γ-聚谷氨酸的蔗糖、谷氨酸及γ-聚谷氨酸含量變化圖。圖4是實(shí)施例3在10L發(fā)酵罐上通過添加調(diào)節(jié)劑單批發(fā)酵生產(chǎn)γ-聚谷氨酸的DO及相關(guān)氧化酶酶活變化圖。圖5是實(shí)施例4在10L發(fā)酵罐上通過連續(xù)流加補(bǔ)料的方式發(fā)酵生產(chǎn)γ-聚谷氨酸的蔗糖、谷氨酸及γ-聚谷氨酸含量變化圖。圖6是實(shí)施例5在100L發(fā)酵罐上通過連續(xù)流加補(bǔ)料的方式發(fā)酵生產(chǎn)γ-聚谷氨酸的蔗糖、谷氨酸及γ-聚谷氨酸含量變化圖。具體實(shí)施方式為了便于本領(lǐng)域技術(shù)人員的理解，下面結(jié)合實(shí)施例及附圖1-6對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步的說明，實(shí)施方式提及的內(nèi)容并非對(duì)本發(fā)明的限定。實(shí)施例1一種高濃度γ-聚谷氨酸的發(fā)酵方法，使用本發(fā)明所用菌種枯草芽孢桿菌PBS55進(jìn)行不同處理的對(duì)比發(fā)酵，其中發(fā)酵方法1的過程如下：將在25%（v/v）的甘油中保藏好的菌種接種到液體種子培養(yǎng)基中，以37℃和搖床轉(zhuǎn)速180-220r/min，震蕩培養(yǎng)12-16h。然后將獲得的種子液以3%（v/v）的接種量，接種于發(fā)酵培養(yǎng)基中，以37℃和搖床轉(zhuǎn)速180-220r/min，震蕩培養(yǎng)60-80h。最后測(cè)定并計(jì)算發(fā)酵液中的γ-聚谷氨酸產(chǎn)量。其中，種子培養(yǎng)基的配方為：蛋白胨為12-18g/L，酵母粉為6-12g/L，氯化鈉為12-16g/L，硫酸鎂1-3g/L，磷酸二氫鉀1.5-5g/L，氯化銨為3-6g/L，發(fā)酵初始PH為6.5-7.5；發(fā)酵培養(yǎng)基的配方為：蔗糖為60-120g/L，蛋白胨為10-40g/L，酵母粉為5-20g/L，谷氨酸鈉為60-100g/L，硫酸鎂0.5-5g/L，磷酸二氫鉀2-7g/L，發(fā)酵初始PH為6.5-7.5；更優(yōu)選可以是如下配方：蔗糖為80-100g/L，蛋白胨為15-20g/L，酵母粉為6-12g/L，谷氨酸鈉為70-90g/L，硫酸鎂2-4g/L，磷酸二氫鉀3-5g/L，發(fā)酵初始PH為6.8-7.2。發(fā)酵結(jié)束后，測(cè)定發(fā)酵液黏度和γ-聚谷氨酸產(chǎn)量，并將發(fā)酵液稀釋15倍后，在660nm處測(cè)定其吸光值。發(fā)酵方法2、3、4的過程與發(fā)酵方法1基本相同，所不同的是在搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)基中還含有2ml/L、4ml/L、6ml/L的Span20；發(fā)酵方法5、6、7的過程與發(fā)酵方法1基本相同，所不同的是在發(fā)酵培養(yǎng)6h時(shí)，向發(fā)酵液添加了20ml/L、40ml/L、60ml/L的正十二烷；發(fā)酵方法8、9、10的過程與發(fā)酵方法1基本相同，所不同的是分別在發(fā)酵培養(yǎng)6h開始，每隔3h向培養(yǎng)基中添加5ml/L、10ml/L、15ml/L的H2O2，直到發(fā)酵結(jié)束；發(fā)酵方法11的過程與發(fā)酵方法1基本相同，所不同的是在搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)基中還含有2ml/L的Span20，然后在發(fā)酵培養(yǎng)6h向發(fā)酵液中添加40ml/L的正十二烷；發(fā)酵方法12的過程與發(fā)酵方法1基本相同，所不同的是在搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)基中還含有2ml/L的Span20，然后在發(fā)酵培養(yǎng)6h向發(fā)酵液中添加40ml/L的正十二烷，并發(fā)酵培養(yǎng)6h開始，每隔3h，向發(fā)酵液中添加10ml/L的H2O2，直到發(fā)酵結(jié)束。結(jié)果如表1所示，在Span20、正十二烷和H2O2單獨(dú)作用下，γ-聚谷氨酸的產(chǎn)量均有不同程度的增加。其中，在Span20的作用下，發(fā)酵液黏度明顯降低，促進(jìn)了營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的傳遞。在正十二烷、H2O2的作用下，培養(yǎng)系統(tǒng)的低氧環(huán)境得到了改善，有效地解決了發(fā)酵液中氧氣供應(yīng)不足的問題。發(fā)酵方法11和發(fā)酵方法12的結(jié)果也表明，Span20、正十二烷和H2O2三者聯(lián)合作用，可以起到協(xié)同效果，極大地提高了γ-聚谷氨酸的產(chǎn)量。表1不同發(fā)酵方法下菌種生物量及γ-聚谷氨酸的產(chǎn)量發(fā)酵方法OD660發(fā)酵液黏度（mPa·s）γ-聚谷氨酸產(chǎn)量（g/L）10.47126.523.620.53219.727.230.48318.924.540.29814.319.850.49623.825.760.56327.231.670.55825.429.380.46828.731.590.45230.834.3100.38623.721.7110.57921.836.7120.53127.443.8實(shí)施例2在10L發(fā)酵罐上不添加調(diào)節(jié)劑單批發(fā)酵生產(chǎn)γ-聚谷氨酸，發(fā)酵培養(yǎng)基配方為：蔗糖為100g/L，蛋白胨為20g/L，酵母粉為10g/L，谷氨酸鈉為80g/L，硫酸鎂2g/L，磷酸二氫鉀3g/L，初始PH為6.8，裝液量為5L。將培養(yǎng)好的種子液以3%（v/v）的接種量接種到發(fā)酵培養(yǎng)基中，培養(yǎng)72h，培養(yǎng)溫度為37℃，發(fā)酵過程控制pH為6.5-7.2，攪拌轉(zhuǎn)速300-400r/min，通氣量1-2vvm，罐壓0.04-0.1mPa。發(fā)酵結(jié)果如圖1、圖2所示。結(jié)果表明，在不添加調(diào)節(jié)劑的情況下，γ-聚谷氨酸產(chǎn)量只有23.2g/L，DO從36h開始就低于20%，CAD和SOD的酶活力均較低，這極大地限制了枯草芽孢桿菌菌體的生長(zhǎng)，從而影響最終γ-聚谷氨酸的合成。實(shí)施例3在10L發(fā)酵罐上通過添加調(diào)節(jié)劑單批發(fā)酵生產(chǎn)γ-聚谷氨酸，發(fā)酵初始培養(yǎng)基配方為：蔗糖為100g/L，蛋白胨為20g/L，酵母粉為10g/L，谷氨酸鈉為80g/L，硫酸鎂2g/L，磷酸二氫鉀3g/L，Span202ml/L，發(fā)酵初始PH為6.8，裝液量為5L。將培養(yǎng)好的種子液以3%（v/v）的接種量接種到發(fā)酵培養(yǎng)基中，發(fā)酵培養(yǎng)6h，向發(fā)酵液添加40ml/L的正十二烷，并發(fā)酵培養(yǎng)6h開始，每隔3h，向發(fā)酵液中添加10ml/L的H2O2，直到發(fā)酵結(jié)束。共發(fā)酵72h，發(fā)酵溫度為37℃，發(fā)酵過程控制pH為6.5-7.2，攪拌轉(zhuǎn)速300-400r/min，通氣量1-2vvm，罐壓0.04-0.1mPa。發(fā)酵結(jié)果如圖3、圖4所示。結(jié)果表明，在Span20、正十二烷和H2O2的共同作用下，培養(yǎng)環(huán)境有了很大改善，DO始終維持在20%以上，CAT和SOD酶活活性較高，有效地解決了γ-聚谷氨酸發(fā)酵過程中供氧不足的問題，γ-聚谷氨酸產(chǎn)量有了顯著的提高，達(dá)到42.8g/L。實(shí)施例4在10L發(fā)酵罐上通過連續(xù)流加補(bǔ)料的方式發(fā)酵生產(chǎn)γ-聚谷氨酸，發(fā)酵初始培養(yǎng)基配方為：蔗糖為50g/L，蛋白胨為20g/L，酵母粉為10g/L，谷氨酸鈉為30g/L，硫酸鎂2g/L，磷酸二氫鉀3g/L，Span202ml/L，發(fā)酵初始PH為6.8，裝液量為5L。將培養(yǎng)好的種子液以3%（v/v）的接種量接種到發(fā)酵培養(yǎng)基中，發(fā)酵培養(yǎng)6h，向發(fā)酵液添加40ml/L的正十二烷，并發(fā)酵培養(yǎng)6h開始，每隔3h，向發(fā)酵液中添加10ml/L的H2O2，發(fā)酵溫度為37℃，發(fā)酵過程控制pH為6.5-7.2，攪拌轉(zhuǎn)速300-400r/min，通氣量1-2vvm，罐壓0.04-0.1mPa。當(dāng)發(fā)酵培養(yǎng)18-24h左右時(shí)，糖濃度較低，發(fā)酵液PH上升至7.0以上時(shí)，開始分別流加50%（w/v）的蔗糖溶液6-12ml/（L*h），20%（w/v）的酵母粉溶液3-6ml/（L*h），50%（w/v）的谷氨酸鈉溶液4-8ml/（L*h），流加至72h，發(fā)酵結(jié)束。發(fā)酵結(jié)果如圖5所示，通過流加補(bǔ)料的方式，營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)得到充分利用，γ-聚谷氨酸的產(chǎn)量有了進(jìn)一步的提高，達(dá)到55.1g/L。實(shí)施例5在100L發(fā)酵罐上通過連續(xù)流加補(bǔ)料的方式發(fā)酵生產(chǎn)γ-聚谷氨酸，發(fā)酵初始培養(yǎng)基配方為：蔗糖為60g/L，蛋白胨為20g/L，酵母粉為10g/L，谷氨酸鈉為40g/L，硫酸鎂2g/L，磷酸二氫鉀3g/L，Span202ml/L，發(fā)酵初始PH為6.8，裝液量為5L。將培養(yǎng)好的種子液以3%（v/v）的接種量接種到發(fā)酵培養(yǎng)基中，發(fā)酵培養(yǎng)6h，向發(fā)酵液添加40ml/L的正十二烷，并發(fā)酵培養(yǎng)6h開始，每隔3h，向發(fā)酵液中添加10ml/L的H2O2，發(fā)酵溫度為37℃，發(fā)酵過程控制pH為6.5-7.2，攪拌轉(zhuǎn)速300-400r/min，通氣量1-2vvm，罐壓0.04-0.1mPa。當(dāng)發(fā)酵培養(yǎng)18-24h左右時(shí)，糖濃度較低，發(fā)酵液PH上升至7.0以上時(shí)，開始分別流加50%（w/v）的蔗糖溶液6-12ml/（L*h），20%（w/v）的酵母粉溶液3-6ml/（L*h），50%（w/v）的谷氨酸鈉溶液4-8ml/（L*h），流加至56h結(jié)束補(bǔ)料，繼續(xù)發(fā)酵至74h時(shí)，蔗糖和谷氨酸鈉消耗殆盡，結(jié)束發(fā)酵。發(fā)酵結(jié)果如圖6所示，100L發(fā)酵罐的發(fā)酵結(jié)果與10L發(fā)酵罐的發(fā)酵結(jié)果相似。在流加補(bǔ)料發(fā)酵方式下，γ-聚谷氨酸產(chǎn)量達(dá)到57.3g/L，比添加調(diào)節(jié)劑的單批發(fā)酵提高了32%，比不添加調(diào)節(jié)劑的單批發(fā)酵提高了148%。上述實(shí)施例為本發(fā)明較佳的實(shí)現(xiàn)方案，除此之外，本發(fā)明還可以其它方式實(shí)現(xiàn)，在不脫離本發(fā)明構(gòu)思的前提下任何顯而易見的替換均在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。當(dāng)前第1頁(yè)1 2 3