本發(fā)明涉及微生物代謝產(chǎn)物分離分析領(lǐng)域，具體來說建立了一種通過固態(tài)發(fā)酵微生物Clonostachys rogersoniana產(chǎn)生抗生素TMC-154的方法。

本發(fā)明使用的微生物Clonostachys rogersoniana：[Clonostachys sp 828H2(保藏號(hào)：CGMCC No.12073)]保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，保藏單位地址：北京市朝陽區(qū)北辰西路1號(hào)院3號(hào)；保藏時(shí)間：2016年1月15日。

背景技術(shù)：

近年來，因微生物具有代謝周期短、轉(zhuǎn)化反應(yīng)條件溫和、副產(chǎn)物少、立體選擇性強(qiáng)等特點(diǎn)，通過微生物(真菌、細(xì)菌以及藻類)發(fā)酵來制備特定化合物的方法越來越受到人們的重視。在實(shí)際生產(chǎn)中，已經(jīng)有大量的應(yīng)用實(shí)例通過微生物發(fā)酵來生產(chǎn)一些新穎的、活性較高的以及對人體健康有益的藥物。

TMC-154是聚酮苷類化合物，其結(jié)構(gòu)特征在于具有一個(gè)獨(dú)特的高度甲基化的erythromycins類型聚酮母核、一個(gè)阿拉伯醇側(cè)鏈和一個(gè)甲基甘露糖取代。文獻(xiàn)報(bào)道該類化合物對多種腫瘤細(xì)胞具有生長抑制活性，且對二酰甘油乙酰轉(zhuǎn)移酶(DGAT)具有抑制活性。在體外細(xì)胞毒活性篩選實(shí)驗(yàn)中，TMC-154對人體白血病早幼粒細(xì)胞株HL-60，人體肝癌細(xì)胞株SMMC-7721，人體非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞株A-549，人體乳腺癌細(xì)胞株MCF-7及人體結(jié)腸癌細(xì)胞株SW-480均表現(xiàn)出明顯的抑制活性，其半數(shù)抑制率(IC₅₀值)分別為2.13μM，15.38μM，17.49μM，15.80μM和14.54μM。而陽性對照順鉑對五株人類腫瘤細(xì)胞HL-60，A-549，SMMC-7721，MCF-7和SW-480的IC₅₀值依次為1.72μM，6.82μM，12.19μM，17.40μM和16.35μM。TMC-154對人體乳腺癌細(xì)胞株MCF-7和人體結(jié)腸癌細(xì)胞株SW-480的生長抑制活性強(qiáng)于陽性對照順鉑。因此，TMC-154具有作為先導(dǎo)化合物開發(fā)抗腫瘤藥物的研究價(jià)值。而基于微生物發(fā)酵的大量而簡單的產(chǎn)生抗生素TMC-154的方法，不僅可以現(xiàn)代環(huán)境保護(hù)和低碳經(jīng)濟(jì)的需求，而且為后期工業(yè)化量產(chǎn)的進(jìn)一步研究和開發(fā)打下了堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)，具有顯著的應(yīng)用價(jià)值。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明旨在通過Clonostachys rogersoniana固體發(fā)酵生產(chǎn)抗生素TMC-154。本發(fā)明提供了一種轉(zhuǎn)化率高，設(shè)備要求低，簡便易操作，綠色無污染，適合產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)TMC-154的方法。

本發(fā)明的目的是通過以下具體技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的：

(1)將擬用微生物C.rogersoniana 828H2(菌種保藏號(hào)CGMCC No.12073)首先進(jìn)行活化，即將C.rogersoniana 828H2接種到經(jīng)過120℃高溫滅菌處理的PDA斜面培養(yǎng)基后，于恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3-7d后，置于4℃冰箱中備用；

(2)將活化的菌種接到PDB種子培養(yǎng)基中，于恒溫?fù)u床中培養(yǎng)3-7d；

(3)取洗凈的土豆切成丁后，取適量置于組織培養(yǎng)瓶中，加入阿拉伯糖(以質(zhì)量百分比計(jì)所述發(fā)酵培養(yǎng)基成分：25g馬鈴薯，0.5g阿拉伯糖)；將裝有培養(yǎng)基的組織培養(yǎng)瓶加蓋包裝后置于120℃高溫滅菌箱中滅菌30min，取出后將組織培養(yǎng)瓶冷卻；

(4)將步驟(2)的種子培養(yǎng)基在無菌環(huán)境下接種到經(jīng)過步驟(3)前處理的培養(yǎng)基上，加蓋后置于培養(yǎng)箱中28℃下培養(yǎng)30d后取出；

(5)經(jīng)微生物C.rogersoniana 828H2發(fā)酵后的培養(yǎng)基經(jīng)過甲醇超聲提取、過濾和濃縮得到粗提物；分離粗提物得到的TMC-154的結(jié)構(gòu)式如下：

(6)經(jīng)TLC薄層層析法檢測，然后經(jīng)過硅膠柱進(jìn)行分離，分離過程采用梯度洗脫，洗脫劑為氯仿：甲醇(10:1—3:1)，然后經(jīng)分離得到的化合物上凝膠柱(甲醇)純化，通過1D/2D NMR以及HR-ESIMS鑒定得到TMC-154結(jié)構(gòu)；

(7)采用如下HPLC色譜條件測定TMC-154的產(chǎn)量。

①色譜柱：ZORBAX SB-C18(4.6×250mm,5μm)；

②梯度洗脫程序：0–10min，20–40％乙腈；10–20min，40-60％乙腈；20–45min，60％乙腈；

③檢測波長：235nm；

④流速：1.0mL/min；

⑤柱溫：20℃。

附圖說明

圖1為本發(fā)明中目標(biāo)化合物的¹H-NMR；

圖2為本發(fā)明中目標(biāo)化合物的¹³C-NMR；

圖3為本發(fā)明中目標(biāo)化合物的HSQC；

圖4為本發(fā)明中目標(biāo)化合物的HMBC；

圖5為本發(fā)明中目標(biāo)化合物的HR-ESI-MS。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合實(shí)施例進(jìn)一步闡述本發(fā)明，但本發(fā)明不局限于該具體實(shí)施例，本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)該認(rèn)識(shí)到，本發(fā)明涵蓋了權(quán)利要求范圍內(nèi)的所有可能的備選方案、改進(jìn)方案和等效方案。

實(shí)施例1

(1)將擬用微生物Clonostachys rogersoniana 828H2首先進(jìn)行活化，即將C.rogersoniana接種到經(jīng)過120℃高溫滅菌處理的PDA斜面培養(yǎng)基后，于恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3-7d后，置于4℃冰箱中備用；

(2)將活化的菌種接到PDB種子培養(yǎng)基中，于恒溫?fù)u床中培養(yǎng)3-7d；

(3)取洗凈的土豆切成丁后，取適量置于組織培養(yǎng)瓶中，加入阿拉伯糖(以質(zhì)量百分比計(jì)所述發(fā)酵培養(yǎng)基成分：25g馬鈴薯，0.5g阿拉伯糖)；將裝有培養(yǎng)基的組織培養(yǎng)瓶加蓋包裝后置于120℃高溫滅菌箱中滅菌30min，取出后將組織培養(yǎng)瓶冷卻；

(4)將步驟(2)的種子培養(yǎng)基在無菌環(huán)境下接種到經(jīng)過步驟(3)前處理的培養(yǎng)基上，加蓋后置于培養(yǎng)箱中28℃下培養(yǎng)30d后取出；

(5)經(jīng)微生物C.rogersoniana 828H2發(fā)酵后的培養(yǎng)基經(jīng)過甲醇超聲提取、過濾和濃縮得到粗提物；分離粗提物得到的TMC-154的結(jié)構(gòu)式如下：

(6)經(jīng)TLC薄層層析法檢測，然后經(jīng)過硅膠柱進(jìn)行分離，分離過程采用梯度洗脫，洗脫劑為氯仿：甲醇(10:1—3:1)，然后經(jīng)分離得到的化合物上凝膠柱(甲醇)純化，通過1D/2D NMR以及HR-ESIMS鑒定得到TMC-154結(jié)構(gòu)；

(7)采用如下HPLC色譜條件測定TMC-154的產(chǎn)量為3.78g/Kg。

①色譜柱：ZORBAX SB-C18(4.6×250mm,5μm)；

②梯度洗脫程序：0–10min，20–40％乙腈；10–20min，40-60％乙腈；20–45min，60％乙腈；

③檢測波長：235nm；

④流速：1.0mL/min；

⑤柱溫：20℃。

該方法是一種高效的，具有創(chuàng)新性的，反應(yīng)條件溫和的，綠色無污染的，易擴(kuò)大化生產(chǎn)的，操作設(shè)備簡單的大量產(chǎn)生抗生素TMC-154的方法，不僅滿足了現(xiàn)代環(huán)境保護(hù)和低碳經(jīng)濟(jì)的需求，而且為后期工業(yè)化量產(chǎn)的進(jìn)一步研究和開發(fā)打下了堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。

實(shí)施例2

操作同實(shí)施例1，把發(fā)酵時(shí)間改為35d后，TMC-154的產(chǎn)量為3.76g/Kg。

實(shí)施例3

操作同實(shí)施例1，把發(fā)酵時(shí)間改為40d后，TMC-154的產(chǎn)量為3.69g/Kg。