本發(fā)明涉及基因工程和微生物發(fā)酵技術(shù)領(lǐng)域，特別涉及一種采用畢赤酵母制備白藜蘆醇二聚體提取物的方法。

背景技術(shù)：

白藜蘆醇二聚體(viniferins)是白藜蘆醇被4-羥基芪過氧化物酶(4-trihydroxy-trans-stilbene)氧化所形成的；是植物在惡劣環(huán)境中或遭到病原體侵染時(shí)所分泌的植物抗毒素；比白藜蘆醇具有更強(qiáng)的抗氧化性能，能夠有效清除和抑制自由基的產(chǎn)生，同時(shí)還能抑制脂質(zhì)過氧化和DNA損失；可改善血小板的活性達(dá)到舒緩過敏癥狀和抗炎的作用。

白藜蘆醇二聚體存在于葡萄葉表皮、漿果果皮和葡萄籽中，含量極低。雖然采取如紫外線照射、真菌感染、機(jī)械損傷等方法會(huì)刺激白藜蘆醇二聚體的合成，但效果不佳。當(dāng)前對(duì)白藜蘆醇二聚體的制備方法主要是化學(xué)全合成法，有研究應(yīng)用1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)處理白藜蘆醇，合成白藜蘆醇二聚體，產(chǎn)量為15％，缺點(diǎn)是合成產(chǎn)率低，應(yīng)用大量強(qiáng)刺激性、有毒的DPPH，危險(xiǎn)性高、環(huán)境負(fù)荷重；有研究應(yīng)用FeCl₃處理白藜蘆醇，得到白藜蘆醇二聚體，產(chǎn)量為2.7％，缺點(diǎn)是重金屬富集，難以直接應(yīng)用；有研究應(yīng)用白藜蘆醇化學(xué)氧化聚合產(chǎn)生白藜蘆醇二聚體，缺點(diǎn)是工藝復(fù)雜，副產(chǎn)物多，且反應(yīng)方向不可控。

目前國(guó)內(nèi)外尚未有應(yīng)用畢赤酵母制備白藜蘆醇二聚體的方法，也未有應(yīng)用畢赤酵母表達(dá)4-羥基芪過氧化物酶蛋白的相關(guān)報(bào)道。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于提供一種采用畢赤酵母制備白藜蘆醇二聚體的方法，以解決當(dāng)前白藜蘆醇二聚體產(chǎn)量低、工藝復(fù)雜、反應(yīng)方向不可控、環(huán)境負(fù)荷重的問題。

為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明采用以下技術(shù)方案：一種采用畢赤酵母制備白藜蘆醇二聚體的方法，其特征在于包括如下步驟：

1)含4-羥基芪過氧化物酶基因的pPU19質(zhì)粒載體的構(gòu)建：分別應(yīng)用限制性內(nèi)切酶EcoP1和EcoP15酶切4-羥基芪過氧化物酶基因片段和pPU19質(zhì)粒，得到酶切后的4-羥基芪過氧化物酶基因片段4TTS(+)和pPU19質(zhì)?；蚱蝡PU19(+)；采用T4連接酶將上述酶切產(chǎn)物進(jìn)行連接，得到重組質(zhì)粒pPU19-4TTS，然后通過PCR技術(shù)擴(kuò)增以pPU19質(zhì)粒DNA為PCR擴(kuò)增模板的4-羥基芪過氧化物酶基因，得PCR擴(kuò)增后的重組質(zhì)粒表達(dá)載體pPU19-4TTS；所述4-羥基芪過氧化物酶基因片段4TTS(+)的基因序列為：

GAAGAGCTGTCGACAGTCGCATGCCAGCTAAATTAAGAAAACCTTCACTTGCTTCAAGTAAAGCATGTCGATCCTTCAACGAATTCTATATCACTTGGATGGAAAACTAAGTGTTCAGTATTTCACAGGTGACAAACCAGACAAGAAGCGTACATTCATTTGACCGAAGAAGCTTGAGGAGCACCCAAACATGGTGCTTATATGGCTCCATCTCTTAACACGCCAAGAGATCAC；

2)通過熱激法將PCR擴(kuò)增后的重組質(zhì)粒表達(dá)載體pPU19-4TTS轉(zhuǎn)入保藏編號(hào)為638632的Komagataella pastoris DSMZ 70382畢赤酵母菌株中，獲得表達(dá)4-羥基芪過氧化物酶的畢赤酵母，命名為Pichia pastoris\pPU19\4TTS，其核苷酸序列：

TCGCTGGTAATCCCGGCTTTTGCTGCTTACAAGCTTTACGGATTATTTCTAGGAGGTAGNCAATTATTGGGTGGTCGCAGCAGTTTCAAAGAGGAGGAGCCAGCTTCTGGGTCAAAAGAAAAGGGACAGAGCAAGAGACAACAGAAACTAGAAAAGAGAGGACAAAAGGTGAGATACAGATAGAATCTTTGCGAGTGAACCAAGGTAGCTGAAAAACATAACTTGCAAGGATGCTATTGGACAATTTTAGGTGATAAACTCGATTGCTATCACTGGGCTCTGCCACATGGAAGCTTTAGTGAGAAGAGCTGTCGACAGTCGCATGCCAGCTAAATTAAGAAAACCTTCACTTGCTTCAAGTAAAGCATGTCGATCCTTCAACGAATTCTATATCACTTGGATGGAAAACTAAGTGTTCAGTATTTCACAGGTGACAAACCAGACAAGAAGCGTACATTCATTTGACCGAAGAAGCTTGAGGAGCACCCAAACATGGTGCTTATATGGCTCCATCTCTTAACACGCCAAGAGATCACAGCTCTTGCGCACTATTCGAGTCGTTTACTTTTTTTTTGGTTTTTGCTAGGCCTTCCATTACTTCTTTACTTCGTTAGTGACAAGTGACTTAAGGCCAATGTATTCTTGAATCAAAAGAAGGCTGTGTCAATTCCTAAGCCCTACTAGCTCTACTTTCGGAGTGACCTACCGATAAGTTCGCATACGCGAATCTGGACCATTTTTATAATACCAAGTAGAAATTCAATAGCCATCTAGCTGTTTCTACATGATGACAGCCCATAACCATAAAGAAAACTGCAAACGATTGCTGAGCTTGTAGAGCGTCCAGTAAGTAGCGCAATCTCCAGTGAGCAACGTAATATCATATTTTCTTCTCTCTCTTTCATTCTCCTCCGAGAATTACAGAAGCATCATAGTAGTGTACCCACCAATGGTTGTGAGCGACTGCGCGATTCCATGGATGCTACTGAAACCAATGAATGAAACTTGTCAAGTTTCCTCGCTTCCTTTTACATAACGGATCTTTTAACTTAGAAACAGTTTAGTAAAAGAAATTCATCAATACAATGGACGGAGGTAAGTCAGCTCTTTCAGCAAGGGAGCATGGAATCAGATTGGCAACGACTTCTGCGATTCTTATTCTTCCGATTGATTCAACAGTAGATTTGCGAGTGGTTGGCCAAACACACAGTTTCGATGCGATCTCCGTTTGATTTGTATGAATACGCAGTCATCTCATTGGTGGAGCATTTTATACGGATTGATTGAGTGGAAGCATGGTACTGAGAGTATCTACATGTGCATTTCTGTTGGTTGTCCTCGGTTGAGTTTTCGTATCTGTTTGTCCCCCCAATTTTGTCCACTCCTTTTGGCAATCTGCCGAATCCAAGCTCATAATACTAACTCCCATTTTAGAAGACGTTGCAGCAGTAAGTACCCTTACATGTAATCCATGAAAGCAAATGTGGCGCAGTCAATCGAAGTCACTGTCTGATTGATTCTTCCCTCAGTGGCGGT；

3)對(duì)步驟(2)得到的Pichia pastoris\pPU19\4TTS菌株通過劃線和繼代培養(yǎng)，經(jīng)初篩、復(fù)篩，進(jìn)行液培發(fā)酵，選取代謝產(chǎn)物含量高或是活性高的菌液劃線于固體篩選培養(yǎng)基上，分離純化，得到復(fù)篩菌種；

4)制備含白藜蘆醇二聚體的發(fā)酵產(chǎn)物：配置含有15-20g/L的白藜蘆醇的LB發(fā)酵培養(yǎng)基，從平板上挑取Pichia pastoris\pPU19\4TTS單菌落于LB培養(yǎng)基的搖瓶中，發(fā)酵，得到含白藜蘆醇二聚體的發(fā)酵產(chǎn)物；

5)白藜蘆醇二聚體的分離：將步驟(4)所述含白藜蘆醇二聚體的發(fā)酵產(chǎn)物液體經(jīng)樹脂純化，得固型物即為白藜蘆醇二聚體提取物。

進(jìn)一步地，步驟(3)中液培發(fā)酵的條件為：發(fā)酵溫度37℃，振蕩速度160r/min，pH為7，發(fā)酵時(shí)間24h。

步驟(4)中搖瓶發(fā)酵的條件為：溫度為31-35℃，振蕩速度180-220r/min，起始pH控制在6-8，發(fā)酵時(shí)間控制在32-40h。

步驟(5)中白藜蘆醇二聚體的分離方法具體為：將步驟4)所述含白藜蘆醇二聚體的發(fā)酵產(chǎn)物液體經(jīng)H103型大孔樹脂富集純化，柱內(nèi)徑4mm，高度1m，裝柱體積為2L，上樣液的質(zhì)量濃度為0.7-0.8mg/mL，上樣流速為2-4BV/h，先用3-5倍柱體積的蒸餾水洗滌，然后用8BV 75％的乙醇水溶液洗脫，回收乙醇水溶液洗出液，使用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀去除乙醇，得固型物即為白藜蘆醇二聚體提取物。

本發(fā)明保藏號(hào)為638632的Komagataella pastoris DSMZ 70382畢赤酵母菌株保藏于NCBI(美國(guó)國(guó)立生物技術(shù)信息中心)。4-羥基芪過氧化物酶購于上海信裕生物科技有限公司；pPU19質(zhì)粒購于澳大利亞pCambia公司；限制性內(nèi)切酶EcoP1和EcoP15酶購于上海斯泰爾生物科技有限公司；T4連接酶購于Thermo Fisher Scientific；液培發(fā)酵設(shè)備購于南京潤(rùn)澤生物工程設(shè)備有限公司，型號(hào)RZY-XGX；固體篩選培養(yǎng)基購于上海哈靈生物科技有限公司；LB培養(yǎng)基購于Sigma Aldrich；白藜蘆醇購買于帝斯曼(中國(guó))有限公司；H103型大孔樹脂購于天津浩聚樹脂；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀為德國(guó)艾卡RV10型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀。

本發(fā)明首次在畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)中分泌表達(dá)了4-羥基芪過氧化物酶，成功將影響白藜蘆醇二聚體生成的4-羥基芪過氧化物酶導(dǎo)入Komagataella pastoris DSMZ 70382畢赤酵母，獲得能夠表達(dá)4-羥基芪過氧化物酶的重組畢赤酵母。

本發(fā)明首次應(yīng)用畢赤酵母，通過基因工程法將能夠產(chǎn)生白藜蘆醇二聚體的關(guān)鍵性4-羥基芪過氧化物酶基因?qū)氘叧嘟湍?，篩選獲得一種高通量表達(dá)4-羥基芪過氧化物酶畢赤酵母菌種。選擇畢赤酵母是因?yàn)楫叧嘟湍富虮磉_(dá)系統(tǒng)為真核表達(dá)系統(tǒng)，且具有調(diào)控機(jī)理嚴(yán)格的醇氧化酶AOX基因啟動(dòng)子；表達(dá)水平高，即可在胞內(nèi)表達(dá)，又可以進(jìn)行分泌型表達(dá)；且發(fā)酵工藝成熟，易工業(yè)化生產(chǎn)；培養(yǎng)成本低，產(chǎn)物容易分離；外援蛋白基因遺傳穩(wěn)定，不易丟失。微生物發(fā)酵法制備白藜蘆醇二聚體，選用的方法綠色環(huán)保、不受氣候影響、成本低、產(chǎn)物可控，且適宜工業(yè)化生產(chǎn)。

經(jīng)本發(fā)明方法分離得到的白藜蘆醇二聚體純度為45-60％，其中白藜蘆醇轉(zhuǎn)化白藜蘆醇二聚體的轉(zhuǎn)化率為35％-45％。遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于當(dāng)前文獻(xiàn)報(bào)道值，且操作工藝簡(jiǎn)單，選用的方法綠色環(huán)保、不受氣候影響、成本低、產(chǎn)物可控，且適宜工業(yè)化生產(chǎn)。

附圖說明

圖1為表達(dá)4-羥基芪過氧化物酶基因的畢赤酵母的瓊脂糖電泳檢測(cè)結(jié)果圖。

圖2為表達(dá)4-羥基芪過氧化物酶基因的畢赤酵母的核苷酸序列。

具體實(shí)施例

以下結(jié)合實(shí)施例1～5對(duì)本發(fā)明公開的技術(shù)方案作進(jìn)一步的說明：

實(shí)施例1：

采用畢赤酵母制備白藜蘆醇二聚體提取物的方法，包括以下步驟：

1)在滅菌的離心管內(nèi)加入1g 4-羥基芪過氧化物酶基因、2g pPU19質(zhì)?；颉?.3mL限制性酶緩沖液、10U限制性內(nèi)切酶EcoP1和10U EcoP15和100mL純水，在30℃下進(jìn)行溫浴10min，經(jīng)旋渦震蕩10s，在12000r/min的轉(zhuǎn)速下，離心2min，過濾，得到含酶切后的4-羥基芪過氧化物酶基因片段4TTS(+)和pPU19質(zhì)粒基因片段pPU19(+)的混合液。其中4-羥基芪過氧化物酶基因片段4TTS(+)的基因序列為：

GAAGAGCTGTCGACAGTCGCATGCCAGCTAAATTAAGAAAACCTTCACTTGCTTCAAGTAAAGCATGTCGATCCTTCAACGAATTCTATATCACTTGGATGGAAAACTAAGTGTTCAGTATTTCACAGGTGACAAACCAGACAAGAAGCGTACATTCATTTGACCGAAGAAGCTTGAGGAGCACCCAAACATGGTGCTTATATGGCTCCATCTCTTAACACGCCAAGAGATCAC。

2)在滅菌的離心管內(nèi)，加入5μL的步驟1)得到的含4-羥基芪過氧化物酶基因片段4TTS(+)和pPU19質(zhì)?；蚱蝡PU19(+)的混合液、0.5μL的T4連接酶、1μL連接酶緩沖液、5μL的ddH2O，然后經(jīng)漩渦振蕩1min，在12000r/min的轉(zhuǎn)速下，離心15s后，置于16℃水中保溫過夜，即得含4-羥基芪過氧化物酶基因的pPU19質(zhì)粒載體，可置于4℃的冰箱中備用。

3)通過PCR技術(shù)對(duì)重組后的質(zhì)粒載體進(jìn)行擴(kuò)增，于95℃預(yù)變性5min，1個(gè)循環(huán)；94℃變性40s，57℃復(fù)性40s，35個(gè)循環(huán)；72℃延伸2min，72℃最后延伸10min，即得到擴(kuò)增后的含4-羥基芪過氧化物酶基因的pPU19質(zhì)粒載體；

4)將重組表達(dá)載體pPU19-4TTS用熱激法轉(zhuǎn)入Komagataella pastoris DSMZ 70382畢赤酵母感受態(tài)細(xì)胞內(nèi)，通過瓊脂糖電泳檢測(cè)結(jié)果如圖1所示，核苷酸序列如圖2，在DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)的306bp處檢測(cè)出4-羥基芪過氧化物酶基因，酶切產(chǎn)物的目的條帶為234bp，符合酶切4-羥基芪過氧化物酶基因的堿基數(shù)，證明重組Komagataella pastoris DSMZ 70382畢赤酵母成功表達(dá)4-羥基芪過氧化物酶基因，將其命名為Pichia pastoris\pPU19\4TTS；

5)從平板上挑取Pichia pastoris\pPU19\4TTS單菌落于裝有LB培養(yǎng)基的搖瓶中，培養(yǎng)基成分為蛋白胨1g/L、酵母膏1.5g/L、蔗糖6g/L、MgSO₄ 0.3g/L、CaCl₂ 0.2g/L、K₂HPO₄0.2g/L、白藜蘆醇15g/L，控制溫度為31℃，振蕩速度180r/min，起始pH控制在6，發(fā)酵時(shí)間控制在32h，得到含白藜蘆醇二聚體的發(fā)酵產(chǎn)物；

6)將白藜蘆醇二聚體的發(fā)酵產(chǎn)物液體經(jīng)H103型大孔樹脂富集純化，柱內(nèi)徑4mm，高度1m，裝柱體積為2L，上樣液的質(zhì)量濃度為0.7mg/mL，上樣流速為2BV/h，先用3倍柱體積的蒸餾水洗滌，然后用8BV 75％的乙醇水溶液洗脫，回收乙醇水溶液。使用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀祛除乙醇，所得固形物即為白藜蘆醇二聚體提取物，經(jīng)HPLC測(cè)試，其純度為45％，其中白藜蘆醇轉(zhuǎn)化白藜蘆醇二聚體的轉(zhuǎn)化率為35％。

實(shí)施例2：

采用畢赤酵母制備白藜蘆醇二聚體提取物的方法，包括以下步驟：

1)在滅菌的離心管內(nèi)加入1g 4-羥基芪過氧化物酶基因、2g pPU19質(zhì)粒基因、0.3mL限制性酶緩沖液、10U限制性內(nèi)切酶EcoP1和10U EcoP15和100mL純水，在32℃下進(jìn)行溫浴13min，經(jīng)旋渦震蕩12s，在12000r/min的轉(zhuǎn)速下，離心2min，過濾，得到含酶切后的4-羥基芪過氧化物酶基因片段4TTS(+)和pPU19質(zhì)?；蚱蝡PU19(+)的混合液。其中4-羥基芪過氧化物酶基因片段4TTS(+)的基因序列為：

GAAGAGCTGTCGACAGTCGCATGCCAGCTAAATTAAGAAAACCTTCACTTGCTTCAAGTAAAGCATGTCGATCCTTCAACGAATTCTATATCACTTGGATGGAAAACTAAGTGTTCAGTATTTCACAGGTGACAAACCAGACAAGAAGCGTACATTCATTTGACCGAAGAAGCTTGAGGAGCACCCAAACATGGTGCTTATATGGCTCCATCTCTTAACACGCCAAGAGATCAC。

2)在滅菌的離心管內(nèi)，加入5μL的步驟1)得到的含4-羥基芪過氧化物酶基因片段4TTS(+)和pPU19質(zhì)?；蚱蝡PU19(+)的混合液、0.5μL的T4連接酶、1μL連接酶緩沖液、5μL的ddH2O，然后經(jīng)漩渦振蕩1.3min，在12000r/min的轉(zhuǎn)速下，離心12s后，置于16℃水中保溫過夜，即得含4-羥基芪過氧化物酶基因的pPU19質(zhì)粒載體，可置于4℃的冰箱中備用。

3)通過PCR技術(shù)對(duì)重組后的質(zhì)粒載體進(jìn)行擴(kuò)增，于95℃預(yù)變性5min，1個(gè)循環(huán)；94℃變性40s，57℃復(fù)性40s，35個(gè)循環(huán)；72℃延伸2min，72℃最后延伸10min，即得到擴(kuò)增后的含4-羥基芪過氧化物酶基因的pPU19質(zhì)粒載體；

4)將重組表達(dá)載體pPU19-4TTS用熱激法轉(zhuǎn)入Komagataella pastoris DSMZ 70382畢赤酵母感受態(tài)細(xì)胞內(nèi)，獲得表達(dá)4-羥基芪過氧化物酶基因的Komagataella pastoris DSMZ 70382畢赤酵母，命名為Pichia pastoris\pPU19\4TTS；

5)從平板上挑取Pichia pastoris\pPU19\4TTS單菌落于裝有LB培養(yǎng)基的搖瓶中，培養(yǎng)基成分為蛋白胨2g/L、酵母膏1.5g/L、蔗糖6.5g/L、MgSO₄ 0.4g/L、CaCl₂ 0.25g/L、K₂HPO₄ 0.3g/L、白藜蘆醇16g/L，控制溫度為32℃，振蕩速度190r/min，起始pH控制在6.5，發(fā)酵時(shí)間控制在33h，得到含白藜蘆醇二聚體的發(fā)酵產(chǎn)物；

6)將白藜蘆醇二聚體的發(fā)酵產(chǎn)物液體經(jīng)H103型大孔樹脂富集純化，柱內(nèi)徑4mm，高度1m，裝柱體積為2L，上樣液的質(zhì)量濃度為0.75mg/mL，上樣流速為2.5BV/h，先用3倍柱體積的蒸餾水洗滌，然后用8BV 75％的乙醇水溶液洗脫，回收乙醇水溶液。使用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀祛除乙醇，所得固形物即為白藜蘆醇二聚體提取物，經(jīng)HPLC測(cè)試，其純度為50％，其中白藜蘆醇轉(zhuǎn)化白藜蘆醇二聚體的轉(zhuǎn)化率為38％。

實(shí)施例3：

采用畢赤酵母制備白藜蘆醇二聚體提取物的方法，包括以下步驟：

1)在滅菌的離心管內(nèi)加入1g 4-羥基芪過氧化物酶基因、2g pPU19質(zhì)?；?、0.3mL限制性酶緩沖液、10U限制性內(nèi)切酶EcoP1和10U EcoP15和100mL純水，在33℃下進(jìn)行溫浴15min，經(jīng)旋渦震蕩14s，在13000r/min的轉(zhuǎn)速下，離心3min，過濾，得到含酶切后的4-羥基芪過氧化物酶基因片段4TTS(+)和pPU19質(zhì)?；蚱蝡PU19(+)的混合液。其中4-羥基芪過氧化物酶基因片段4TTS(+)的基因序列為：

GAAGAGCTGTCGACAGTCGCATGCCAGCTAAATTAAGAAAACCTTCACTTGCTTCAAGTAAAGCATGTCGATCCTTCAACGAATTCTATATCACTTGGATGGAAAACTAAGTGTTCAGTATTTCACAGGTGACAAACCAGACAAGAAGCGTACATTCATTTGACCGAAGAAGCTTGAGGAGCACCCAAACATGGTGCTTATATGGCTCCATCTCTTAACACGCCAAGAGATCAC。

2)在滅菌的離心管內(nèi)，加入5μL的步驟1)得到的含4-羥基芪過氧化物酶基因片段4TTS(+)和pPU19質(zhì)粒基因片段pPU19(+)的混合液、0.5μL的T4連接酶、1μL連接酶緩沖液、5μL的ddH2O，然后經(jīng)漩渦振蕩2min，在12000r/min的轉(zhuǎn)速下，離心16s后，置于16℃水中保溫過夜，即得含4-羥基芪過氧化物酶基因的pPU19質(zhì)粒載體，可置于4℃的冰箱中備用。

3)通過PCR技術(shù)對(duì)重組后的質(zhì)粒載體進(jìn)行擴(kuò)增，于95℃預(yù)變性5min，1個(gè)循環(huán)；94℃變性40s，57℃復(fù)性40s，35個(gè)循環(huán)；72℃延伸2min，72℃最后延伸10min，即得到擴(kuò)增后的含4-羥基芪過氧化物酶基因的pPU19質(zhì)粒載體；

4)將重組表達(dá)載體pPU19-4TTS用熱激法轉(zhuǎn)入Komagataella pastoris DSMZ 70382畢赤酵母感受態(tài)細(xì)胞內(nèi)，獲得表達(dá)4-羥基芪過氧化物酶基因的Komagataella pastoris DSMZ 70382畢赤酵母菌，命名為Pichia pastoris\pPU19\4TTS；

5)從平板上挑取Pichia pastoris\pPU19\4TTS單菌落于裝有LB培養(yǎng)基的搖瓶中，培養(yǎng)基成分為蛋白胨2.5g/L、酵母膏2g/L、蔗糖7g/L、MgSO₄ 0.35g/L、CaCl₂ 0.25g/L、K₂HPO₄ 0.25g/L、白藜蘆醇15g/L，控制溫度為33℃，振蕩速度195r/min，起始pH控制在6.5，發(fā)酵時(shí)間控制在34h，得到含白藜蘆醇二聚體的發(fā)酵產(chǎn)物；

6)將白藜蘆醇二聚體的發(fā)酵產(chǎn)物液體經(jīng)H103型大孔樹脂富集純化，柱內(nèi)徑4mm，高度1m，裝柱體積為2L，上樣液的質(zhì)量濃度為0.78mg/mL，上樣流速為3.0BV/h，先用4倍柱體積的蒸餾水洗滌，然后用8BV 75％的乙醇水溶液洗脫，回收乙醇水溶液。使用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀祛除乙醇，所得固形物即為白藜蘆醇二聚體提取物，經(jīng)HPLC測(cè)試，其純度為48％，其中白藜蘆醇轉(zhuǎn)化白藜蘆醇二聚體的轉(zhuǎn)化率為40％。

實(shí)施例4：

采用畢赤酵母制備白藜蘆醇二聚體提取物的方法，包括以下步驟：

1)在滅菌的離心管內(nèi)加入1g 4-羥基芪過氧化物酶基因、2g pPU19質(zhì)?；?、0.3mL限制性酶緩沖液、10U限制性內(nèi)切酶EcoP1和10U EcoP15和100mL純水，在33℃下進(jìn)行溫浴15min，經(jīng)旋渦震蕩20s，在14000r/min的轉(zhuǎn)速下，離心3min，過濾，得到含酶切后的4-羥基芪過氧化物酶基因片段4TTS(+)和pPU19質(zhì)粒基因片段pPU19(+)的混合液。其中4-羥基芪過氧化物酶基因片段4TTS(+)的基因序列為：

GAAGAGCTGTCGACAGTCGCATGCCAGCTAAATTAAGAAAACCTTCACTTGCTTCAAGTAAAGCATGTCGATCCTTCAACGAATTCTATATCACTTGGATGGAAAACTAAGTGTTCAGTATTTCACAGGTGACAAACCAGACAAGAAGCGTACATTCATTTGACCGAAGAAGCTTGAGGAGCACCCAAACATGGTGCTTATATGGCTCCATCTCTTAACACGCCAAGAGATCAC。

2)在滅菌的離心管內(nèi)，加入5μL的步驟1)得到的含4-羥基芪過氧化物酶基因片段4TTS(+)和pPU19質(zhì)?；蚱蝡PU19(+)的混合液、0.5μL的T4連接酶、1μL連接酶緩沖液、5μL的ddH2O，然后經(jīng)漩渦振蕩1.6min，在12000r/min的轉(zhuǎn)速下，離心14s后，置于16℃水中保溫過夜，即得含4-羥基芪過氧化物酶基因的pPU19質(zhì)粒載體，可置于4℃的冰箱中備用。

3)通過PCR技術(shù)對(duì)重組后的質(zhì)粒載體進(jìn)行擴(kuò)增，于95℃預(yù)變性5min，1個(gè)循環(huán)；94℃變性40s，57℃復(fù)性40s，35個(gè)循環(huán)；72℃延伸2min，72℃最后延伸10min，即得到擴(kuò)增后的含4-羥基芪過氧化物酶基因的pPU19質(zhì)粒載體；

4)將重組表達(dá)載體pPU19-4TTS用熱激法轉(zhuǎn)入Komagataella pastoris DSMZ 70382畢赤酵母感受態(tài)細(xì)胞內(nèi)，獲得表達(dá)4-羥基芪過氧化物酶基因的Komagataella pastoris DSMZ 70382畢赤酵母菌，命名為Pichia pastoris\pPU19\4TTS；

5)從平板上挑取Pichia pastoris\pPU19\4TTS單菌落于裝有LB培養(yǎng)基的搖瓶中，培養(yǎng)基成分為蛋白胨3g/L、酵母膏2g/L、蔗糖8g/L、MgSO₄ 0.3g/L、CaCl₂ 0.3g/L、K₂HPO₄0.3g/L、白藜蘆醇18g/L，控制溫度為33℃，振蕩速度200r/min，起始pH控制在7.5，發(fā)酵時(shí)間控制在36h，得到含白藜蘆醇二聚體的發(fā)酵產(chǎn)物；

6)將白藜蘆醇二聚體的發(fā)酵產(chǎn)物液體經(jīng)H103型大孔樹脂富集純化，柱內(nèi)徑4mm，高度1m，裝柱體積為2L，上樣液的質(zhì)量濃度為0.80mg/mL，上樣流速為3BV/h，先用4倍柱體積的蒸餾水洗滌，然后用8BV 75％的乙醇水溶液洗脫，回收乙醇水溶液。使用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀祛除乙醇，所得固形物即為白藜蘆醇二聚體提取物，經(jīng)HPLC測(cè)試，其純度為60％，其中白藜蘆醇轉(zhuǎn)化白藜蘆醇二聚體的轉(zhuǎn)化率為45％。

實(shí)施例5：

采用畢赤酵母制備白藜蘆醇二聚體提取物的方法，包括以下步驟：

1)在滅菌的離心管內(nèi)加入1g 4-羥基芪過氧化物酶基因、2g pPU19質(zhì)?；?、0.3mL限制性酶緩沖液、10U限制性內(nèi)切酶EcoP1和10U EcoP15和100mL純水，在35℃下進(jìn)行溫浴20min，經(jīng)旋渦震蕩25s，在15000r/min的轉(zhuǎn)速下，離心4min，過濾得到含酶切后的4-羥基芪過氧化物酶基因片段4TTS(+)和pPU19質(zhì)?；蚱蝡PU19(+)的混合液。其中4-羥基芪過氧化物酶基因片段4TTS(+)的基因序列為：

GAAGAGCTGTCGACAGTCGCATGCCAGCTAAATTAAGAAAACCTTCACTTGCTTCAAGTAAAGCATGTCGATCCTTCAACGAATTCTATATCACTTGGATGGAAAACTAAGTGTTCAGTATTTCACAGGTGACAAACCAGACAAGAAGCGTACATTCATTTGACCGAAGAAGCTTGAGGAGCACCCAAACATGGTGCTTATATGGCTCCATCTCTTAACACGCCAAGAGATCAC。

2)在滅菌的離心管內(nèi)，加入5μL的步驟1)得到的含4-羥基芪過氧化物酶基因片段4TTS(+)和pPU19質(zhì)?；蚱蝡PU19(+)的混合液、0.5μL的T4連接酶、1μL連接酶緩沖液、5μL的ddH2O，然后經(jīng)漩渦振蕩1.6min，在12000r/min的轉(zhuǎn)速下，離心13s后，置于16℃水中保溫過夜，即得含4-羥基芪過氧化物酶基因的pPU19質(zhì)粒載體，可置于4℃的冰箱中備用。

3)通過PCR技術(shù)對(duì)重組后的質(zhì)粒載體進(jìn)行擴(kuò)增，于95℃預(yù)變性5min，1個(gè)循環(huán)；94℃變性40s，57℃復(fù)性40s，35個(gè)循環(huán)；72℃延伸2min，72℃最后延伸10min，即得到擴(kuò)增后的含4-羥基芪過氧化物酶基因的pPU19質(zhì)粒載體；

4)將重組表達(dá)載體pPU19-4TTS用熱激法轉(zhuǎn)入Komagataella pastoris DSMZ 70382畢赤酵母感受態(tài)細(xì)胞內(nèi)，獲得表達(dá)4-羥基芪過氧化物酶基因的Komagataella pastoris DSMZ 70382畢赤酵母菌，命名為Pichia pastoris\pPU19\4TTS；

5)從平板上挑取Pichia pastoris\pPU19\4TTS單菌落于裝有LB培養(yǎng)基的搖瓶中，培養(yǎng)基成分為蛋白胨5g/L、酵母膏4g/L、蔗糖12g/L、MgSO₄ 0.5g/L、CaCl₂ 0.4g/L、K₂HPO₄0.6g/L、白藜蘆醇20g/L，控制溫度為35℃，振蕩速度220r/min，起始pH控制在8，發(fā)酵時(shí)間控制在40h，得到含白藜蘆醇二聚體的發(fā)酵產(chǎn)物；

6)將白藜蘆醇二聚體的發(fā)酵產(chǎn)物液體經(jīng)H103型大孔樹脂富集純化，柱內(nèi)徑4mm，高度1m，裝柱體積為2L，上樣液的質(zhì)量濃度為0.80mg/mL，上樣流速為4.0BV/h，先用5倍柱體積的蒸餾水洗滌，然后用8BV 75％的乙醇水溶液洗脫，回收乙醇水溶液。使用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀祛除乙醇，所得固形物即為白藜蘆醇二聚體提取物，經(jīng)HPLC測(cè)試，其純度為50％，其中白藜蘆醇轉(zhuǎn)化白藜蘆醇二聚體的轉(zhuǎn)化率為42％。

SEQUENCE LISTING

<110> 珀萊雅化妝品股份有限公司

<120> 一種采用畢赤酵母制備白藜蘆醇二聚體的方法

<130>

<160> 2

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 234

<212> DNA

<213> 4-羥基芪過氧化物酶基因片段4TTS（+）

<400> 1

gaagagctgt cgacagtcgc atgccagcta aattaagaaa accttcactt gcttcaagta 60

aagcatgtcg atccttcaac gaattctata tcacttggat ggaaaactaa gtgttcagta 120

tttcacaggt gacaaaccag acaagaagcg tacattcatt tgaccgaaga agcttgagga 180

gcacccaaac atggtgctta tatggctcca tctcttaaca cgccaagaga tcac 234

<210> 2

<211> 1536

<212> DNA

<213> 表達(dá)4-羥基芪過氧化物酶的畢赤酵母

<220>

<221> misc_feature

<222> (60)..(60)

<223> n is a, c, g, or t

<400> 2

tcgctggtaa tcccggcttt tgctgcttac aagctttacg gattatttct aggaggtagn 60

caattattgg gtggtcgcag cagtttcaaa gaggaggagc cagcttctgg gtcaaaagaa 120

aagggacaga gcaagagaca acagaaacta gaaaagagag gacaaaaggt gagatacaga 180

tagaatcttt gcgagtgaac caaggtagct gaaaaacata acttgcaagg atgctattgg 240

acaattttag gtgataaact cgattgctat cactgggctc tgccacatgg aagctttagt 300

gagaagagct gtcgacagtc gcatgccagc taaattaaga aaaccttcac ttgcttcaag 360

taaagcatgt cgatccttca acgaattcta tatcacttgg atggaaaact aagtgttcag 420

tatttcacag gtgacaaacc agacaagaag cgtacattca tttgaccgaa gaagcttgag 480

gagcacccaa acatggtgct tatatggctc catctcttaa cacgccaaga gatcacagct 540

cttgcgcact attcgagtcg tttacttttt ttttggtttt tgctaggcct tccattactt 600

ctttacttcg ttagtgacaa gtgacttaag gccaatgtat tcttgaatca aaagaaggct 660

gtgtcaattc ctaagcccta ctagctctac tttcggagtg acctaccgat aagttcgcat 720

acgcgaatct ggaccatttt tataatacca agtagaaatt caatagccat ctagctgttt 780

ctacatgatg acagcccata accataaaga aaactgcaaa cgattgctga gcttgtagag 840

cgtccagtaa gtagcgcaat ctccagtgag caacgtaata tcatattttc ttctctctct 900

ttcattctcc tccgagaatt acagaagcat catagtagtg tacccaccaa tggttgtgag 960

cgactgcgcg attccatgga tgctactgaa accaatgaat gaaacttgtc aagtttcctc 1020

gcttcctttt acataacgga tcttttaact tagaaacagt ttagtaaaag aaattcatca 1080

atacaatgga cggaggtaag tcagctcttt cagcaaggga gcatggaatc agattggcaa 1140

cgacttctgc gattcttatt cttccgattg attcaacagt agatttgcga gtggttggcc 1200

aaacacacag tttcgatgcg atctccgttt gatttgtatg aatacgcagt catctcattg 1260

gtggagcatt ttatacggat tgattgagtg gaagcatggt actgagagta tctacatgtg 1320

catttctgtt ggttgtcctc ggttgagttt tcgtatctgt ttgtcccccc aattttgtcc 1380

actccttttg gcaatctgcc gaatccaagc tcataatact aactcccatt ttagaagacg 1440

ttgcagcagt aagtaccctt acatgtaatc catgaaagca aatgtggcgc agtcaatcga 1500

agtcactgtc tgattgattc ttccctcagt ggcggt 1536