本發(fā)明涉及微生物發(fā)酵技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種黑曲霉及其發(fā)酵百藥煎生成新成分的制備方法與應用。

背景技術(shù)：

百藥煎始載于《丹溪心法》，為五倍子同茶葉等經(jīng)發(fā)酵制成的塊狀物。性味酸甘，平。具有潤肺化痰，生津止渴的功效。臨床多用于治療久咳痰多，咽痛，便血，久痢脫肛，口瘡，牙疳，癰腫瘡瘍。目前發(fā)酵百藥煎多采用復合菌固態(tài)發(fā)酵，由于復合菌在發(fā)酵過程中菌種的變化不清楚，且固體發(fā)酵具有發(fā)酵過程參數(shù)難以測定、過程控制困難，菌體生長、發(fā)酵以及代謝產(chǎn)物在發(fā)酵體系中分布不均等不足，導致產(chǎn)品穩(wěn)定性較差、重復性較低，給百藥煎的發(fā)酵過程帶來不便，使百藥煎質(zhì)量不穩(wěn)定。五倍子發(fā)酵成為百藥煎后鞣質(zhì)含量減少，沒食子酸含量升高，選育一株優(yōu)勢菌株并研究其在百藥煎發(fā)酵中的應用，并將發(fā)酵后升高的化學成分提取分離，結(jié)構(gòu)鑒定，并對該成分抗腫瘤活性進行研究，能更好的控制百藥煎的質(zhì)量，為百藥煎臨床用藥提供依據(jù)，保證其臨床用藥安全有效。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

針對上述情況，為解決現(xiàn)有技術(shù)之缺陷，本發(fā)明之目的就是提供一種黑曲霉菌株及其發(fā)酵百藥煎生成新成分的制備方法與應用，可有效解決固體發(fā)酵具有發(fā)酵過程參數(shù)難以測定、過程控制困難，菌體生長、發(fā)酵以及代謝產(chǎn)物在發(fā)酵體系中分布不均等不足，導致產(chǎn)品穩(wěn)定性較差、重復性較低，給百藥煎的發(fā)酵過程帶來不便，百藥煎質(zhì)量不穩(wěn)定的問題。

本發(fā)明解決的技術(shù)方案是，本發(fā)明所述黑曲霉菌株，其分類命名為曲霉(Aspergillus sp.)BYJ.H-1，已于2016年7月5日保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏編號為：CCTCC NO:M2016376，保藏地址：湖北省武漢市武昌區(qū)八一路299號武漢大學校內(nèi)，武漢大學保藏中心。

其制備方法為：收集新鮮百藥煎，采用稀釋涂布平板法，分別用孟加拉紅、馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基(PDA)和酵母膏3種培養(yǎng)基，28℃恒溫培養(yǎng)，共分離出2個屬的6株菌種，通過發(fā)酵百藥煎外觀狀態(tài)、液相分析，分離和篩選出使百藥煎中沒食子酸含量最高的黑曲霉BYJ.H-1；所述的百藥煎是：將五倍子藥材洗凈，80℃干燥4h，粉碎，過80目篩，取茶葉粗粉1g于10-20mL沸水中煎煮15min，放至23-27℃，濾去茶渣，得茶汁，取茶渣、3mL茶汁與10g上述五倍子粉混勻，用潤濕八層紗布封口于115℃滅菌30min，放涼，即得；

所述的孟加拉紅培養(yǎng)基是由：蛋白胨5g、葡萄糖10g、磷酸二氫鉀1g、硫酸鎂(MgSO₄·7H₂O)0.5g、瓊脂20g、1/3000孟加拉紅溶液100mL、蒸餾水1000mL和氯霉素0.1g制成；

所述的馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基是由：馬鈴薯200g、葡萄糖20g、瓊脂15-20g和自來水1000ml制成；

所述的酵母膏培養(yǎng)基是由：酵母膏5g、蔗糖10g、瓊脂粉14g于1000ml蒸餾水中，煎煮至沸，補足體積即可。

黑曲霉菌株發(fā)酵百藥煎生成新成分的制備方法，包括以下步驟：

1)新成分2,4,6-三-O-沒食子酰-D-葡萄糖的制備：將五倍子藥材洗凈，80℃干燥4-10h，粉碎，過80目篩，取茶葉粗粉1g于20mL沸水中煎煮15min，放至23-27℃，濾去茶渣，得茶汁5-10mL，取茶渣、3mL茶汁與10g上述五倍子粉混勻，用潤濕八層紗布封口于115℃滅菌30min，放涼，得百藥煎軟材，備用；將黑曲霉菌株于馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基上活化3d，取50mL蒸餾水于200mL錐形瓶中121℃滅菌30min，放涼，用滅菌的竹簽刮2-4環(huán)孢子于滅菌的蒸餾水中制成10⁸個/mL以上的孢子菌懸液，180r/min振搖2h，取五倍子粉重量5-8％的孢子菌懸液加入處理好的百藥煎軟材中，攪拌均勻后于35-40℃、85％的濕度發(fā)酵60-66h，干燥，即得新成分2,4,6-三-O-沒食子酰-D-葡萄糖，所述的馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基是由：馬鈴薯去皮200g切塊，煮至一搗即爛，過濾，濾液再加葡萄糖20g，瓊脂粉15g，煮至沸騰，補足蒸餾水至1000mL制成；

2)新成分2,4,6-三-O-沒食子酰-D-葡萄糖的分離純化：取上述得到的2,4,6-三-O-沒食子酰-D-葡萄糖細粉，70℃水浴，甲醇提取3次，過濾，濾液濃縮至干，加水溶解，過濾，濾液上大孔樹脂柱，然后甲醇-水系統(tǒng)洗脫，具體是：先分別用水、10％甲醇(V/V)、20％甲醇(V/V)、30％甲醇(V/V)、50％甲醇(V/V)梯度洗脫，將得到的10％甲醇洗脫液，使用直徑20cm的C18高壓制備液相柱，進樣5L，使用流動相乙腈：0.2％甲酸＝13:87，檢測波長280nm、流速600ml/min進行洗脫分離，得到不同組分，分別分析檢測；將含有2,4,6-三-O-沒食子酰-D-葡萄糖的組分使用直徑10cm的C18高壓制備液相柱，進樣量1.25L，按流動相乙腈：0.2％甲酸＝13:87、檢測波長280nm、流速250ml/min進一步洗脫分離，將得到的組分進行檢測合并，濃縮結(jié)晶，50℃減壓干燥，得純化2,4,6-三-O-沒食子酰-D-葡萄糖。

本發(fā)明中2,4,6-三-O-沒食子酰-D-葡萄糖，為首次發(fā)現(xiàn)的新化合物，通過采用大孔樹脂柱，制備液相對黑曲霉BYJ.H-1發(fā)酵百藥煎含量升高成分進行分離純化，利用核磁共振儀和高分辨質(zhì)譜儀對化合物結(jié)構(gòu)進行鑒定，得到2,4,6-三-O-沒食子酰-D-葡萄糖，該化合物存在α和β兩種構(gòu)型，利用肺腺癌A549細胞及人大細胞肺癌NCI-H460細胞2種癌細胞證明2,4,6-三-O-沒食子酰-D-葡萄糖有抗腫瘤活性。

本發(fā)明利用黑曲霉CCTCC M 2016376發(fā)酵百藥煎鞣質(zhì)的轉(zhuǎn)化率大大提高，并提供了具體的工藝技術(shù)參數(shù)，為百藥煎的質(zhì)量控制及規(guī)范化生產(chǎn)提供依據(jù)，利用細胞模型證明2,4,6-三-O-沒食子酰-D-葡萄糖有抗腫瘤活性，為開發(fā)新的抗腫瘤藥提供了技術(shù)保障。

附圖說明

圖1為本發(fā)明黑曲霉CCTCC M 2016376的系統(tǒng)發(fā)育樹。

圖2為本發(fā)明黑曲霉CCTCC M 2016376的形態(tài)學照片。

圖3為本發(fā)明黑曲霉CCTCC M 2016376的顯微照片。

圖4為本發(fā)明2,4,6-三-O-沒食子酰-D-葡萄糖7 ¹H-NMR(acetone-d₆)譜。

圖5為本發(fā)明2,4,6-三-O-沒食子酰-D-葡萄糖¹³C-NMR(acetone-d₆)譜。

圖6為本發(fā)明2,4,6-三-O-沒食子酰-D-葡萄糖DEPT135譜。

圖7為本發(fā)明2,4,6-三-O-沒食子酰-D-葡萄糖¹H-¹H COSY(acetone-d₆)譜。

圖8為本發(fā)明2,4,6-三-O-沒食子酰-D-葡萄糖HSQC(acetone-d₆)譜。

圖9為本發(fā)明2,4,6-三-O-沒食子酰-D-葡萄糖HMBC(acetone-d₆)譜。

圖10為本發(fā)明2,4,6-三-O-沒食子酰-D-葡萄糖高分辨質(zhì)譜圖。

圖11為本發(fā)明A549和NCI-H460細胞形態(tài)圖。

具體實施方式

以下結(jié)合實施例對本發(fā)明的具體實施方式作進一步詳細說明。

實施例1

黑曲霉菌株分離篩選方法：

收集新鮮百藥煎，采用稀釋涂布平板法，分別用孟加拉紅、馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基和酵母膏3種培養(yǎng)基，28℃恒溫培養(yǎng)，共分離出2個屬的6株菌種，將分離的菌種(曲霉屬菌株HM1、HM2、HM3、HM5、HM7、酵母菌YJ1)分別于PDA上活化3d，取50ml蒸餾水于200ml錐形瓶中121℃滅菌30min，放涼，用滅菌的竹簽刮2-4環(huán)孢子于滅菌的蒸餾水中制成10⁸個/ml以上的孢子菌懸液，180r/min振搖2h，吸取孢子菌懸液5ml加入百藥煎中，用滅菌的玻璃棒攪拌均勻于30℃、85％的濕度發(fā)酵60h，取出，烘干，測沒食子酸含量；

所述的百藥煎是：將五倍子藥材洗凈，80℃干燥4h，粉碎，過80目篩，取茶葉粗粉1g置于10mL沸水中煎煮15min，放至25℃，濾去茶渣，茶汁體積為8mL，取茶渣、3ml茶汁與10g上述五倍子粉混勻，用潤濕八層紗布封口于115℃滅菌30min，放涼，備用；結(jié)果見下表：

表1各菌株發(fā)酵百藥煎的外觀性狀描述及沒食子酸含量

注：空白對照：百藥煎軟材115℃滅菌30min,30℃發(fā)酵60h

實施例2

本發(fā)明在具體實施時，黑曲霉菌株發(fā)酵百藥煎生成新成分的制備方法，包括以下步驟：

1)新成分2,4,6-三-O-沒食子酰-D-葡萄糖的制備：將五倍子藥材洗凈，80℃干燥4h，粉碎，過80目篩，取茶葉粗粉1g于20mL沸水中煎煮15min，放至23-27℃，濾去茶渣，得茶汁8mL，取茶渣、3mL茶汁與10g上述五倍子粉混勻，用潤濕八層紗布封口于115℃滅菌30min，放涼，得百藥煎軟材，備用；將黑曲霉菌株于馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基上活化3d，取50mL蒸餾水于200mL錐形瓶中121℃滅菌30min，放涼，用滅菌的竹簽刮2-4環(huán)孢子于滅菌的蒸餾水中制成10⁸個/mL以上的孢子菌懸液，180r/min振搖2h，取五倍子粉重量5％的孢子菌懸液加入處理好的百藥煎軟材中，攪拌均勻后于40℃、85％的濕度發(fā)酵60h，干燥，即得新成分2,4,6-三-O-沒食子酰-D-葡萄糖，經(jīng)檢測，沒食子酸的含量達到30.22％；

2)新成分2,4,6-三-O-沒食子酰-D-葡萄糖的分離純化：取上述得到的2,4,6-三-O-沒食子酰-D-葡萄糖細粉，70℃水浴，甲醇提取3次，過濾，濾液濃縮至干，加水溶解，過濾，濾液上AB-8大孔樹脂柱，甲醇-水系統(tǒng)洗脫，具體是：先分別用水、10％甲醇(V/V)、20％甲醇、30％甲醇、50％甲醇梯度洗脫，將得到的10％甲醇洗脫液，使用直徑20cm的C18高壓制備液相柱，進樣5L，使用流動相乙腈：0.2％甲酸＝13:87，檢測波長280nm、、流速600ml/min進行洗脫分離，得到不同組分，分別分析檢測；將含有使用2,4,6-三-O-沒食子酰-D-葡萄糖的組分使用直徑10cm的C18高壓制備液相柱，進樣量1.25L，按流動相乙腈：0.2％甲酸＝13:87檢測波長280nm、流速250ml/min進一步洗脫分離，將得到的組分進行檢測合并，濃縮結(jié)晶，50℃減壓干燥，得純化2,4,6-三-O-沒食子酰-D-葡萄糖。

實施例3

本發(fā)明在具體實施時，黑曲霉菌株發(fā)酵百藥煎生成新成分的制備方法，包括以下步驟：

1)新成分2,4,6-三-O-沒食子酰-D-葡萄糖的制備：將五倍子藥材洗凈，80℃干燥8h，粉碎，過80目篩，取茶葉粗粉1g于20mL沸水中煎煮15min，放至25℃，濾去茶渣，得茶汁，取茶渣、3mL茶汁與10g上述五倍子粉混勻，用潤濕八層紗布封口于115℃滅菌30min，放涼，得百藥煎軟材，備用；將黑曲霉菌株于馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基上活化3d，取50mL蒸餾水于200mL錐形瓶中121℃滅菌30min，放涼，用滅菌的竹簽刮2-4環(huán)孢子于滅菌的蒸餾水中制成10⁸個/mL以上的孢子菌懸液，180r/min振搖2h，取五倍子粉重量6％的孢子菌懸液加入處理好的百藥煎軟材中，攪拌均勻后于38℃、85％的濕度發(fā)酵62h，干燥，即得新成分2,4,6-三-O-沒食子酰-D-葡萄糖；

2)新成分2,4,6-三-O-沒食子酰-D-葡萄糖的分離純化：取上述得到的2,4,6-三-O-沒食子酰-D-葡萄糖細粉，70℃水浴，甲醇提取3次，過濾，濾液濃縮至干，加水溶解，過濾，濾液上大孔樹脂柱，然后甲醇-水系統(tǒng)洗脫，具體是：先分別用水、10％甲醇(V/V)、20％甲醇、30％甲醇、50％甲醇梯度洗脫，將得到的10％甲醇洗脫液，使用直徑20cm的C18高壓制備液相柱，進樣5L，使用流動相乙腈：0.2％甲酸＝13:87，檢測波長280nm、、流速600ml/min進行洗脫分離，得到不同組分，分別分析檢測；將含有2,4,6-三-O-沒食子酰-D-葡萄糖的組分使用直徑10cm的C18高壓制備液相柱，進樣量1.25L，按流動相乙腈：0.2％甲酸＝13:87檢測波長280nm、流速250ml/min進一步洗脫分離，將得到的組分進行檢測合并，濃縮結(jié)晶，50℃減壓干燥，得純化2,4,6-三-O-沒食子酰-D-葡萄糖。

本發(fā)明對黑曲霉菌株進行了分類鑒定，并對新化合物進行了抗腫瘤活性研究，相關(guān)實驗資料如下：

一、黑曲霉CCTCC M 2016376的鑒定

為進一步確定CCTCC M 2016376的分類學地位，本發(fā)明采用傳統(tǒng)分類方法和分子生物學分類方法對該菌株進行了分類鑒定。

1形態(tài)觀察用培養(yǎng)基

馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基(PDA固體培養(yǎng)基)：馬鈴薯去皮200g切塊，煮至一搗即爛，過濾，濾液再加葡萄糖20g，瓊脂粉15g，煮至沸騰，補足蒸餾水至1000mL，分裝于錐形瓶中，待滅菌。

孟加拉紅培養(yǎng)基：孟加拉紅培養(yǎng)基35g，加蒸餾水1000mL煎煮至沸，補足水分至1000mL。分裝于錐形瓶中，待滅菌。

沙保弱培養(yǎng)基(SDA培養(yǎng)基)：蛋白胨10g，葡萄糖40g，營養(yǎng)瓊脂14-15g，蒸餾水1000mL。

以上培養(yǎng)基于高壓蒸汽滅菌器中121℃滅菌20min，備用。

2引物

采用真菌通用引物由上海生工生物工程有限公司合成。其序列分別為：ITS 1(5′-TCCGTAGGTGAACCTG CGG-3′)和ITS 4(5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′)對5.8S-ITS區(qū)段進行擴增

3試驗方法

3.1形態(tài)學觀察

3.1.1菌落形態(tài)觀察

用接種針取少量孢子，采用三點接種法分別接種于PDA培養(yǎng)基、SDA培養(yǎng)基以及孟加拉紅培養(yǎng)基上，然后置于28℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，觀察并描述菌種在培養(yǎng)基中菌落形態(tài)與生長情況，并做照相記錄(如圖2所示)。

3.1.2顯微結(jié)構(gòu)觀察

采用插片培養(yǎng)法將需鑒定真菌接種于蓋玻片與培養(yǎng)基交界處，使菌絲生長過程中能夠附著到蓋玻片上，置于28℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，從次日起每天用無菌鑷子拔取蓋玻片，經(jīng)乳酸-棉蘭染液染色后，置于顯微鏡下觀察真菌結(jié)構(gòu)(如圖3所示)。

3.2黑曲霉CCTCC M 2016376的分子生物學鑒定

3.2.1黑曲霉CCTCC M 2016376基因組DNA的提取

將冷凍保存的實驗菌種于固體PDA上28℃活化3d,將活化菌株接種于液體PDA培養(yǎng)基中，28℃搖瓶培養(yǎng)48h，檢查無污染后，按照生工試劑盒說明書提取DNA,2％的瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA提取質(zhì)量，將提取的DNA-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

3.2.2黑曲霉CCTCC M 2016376基因的擴增

將上述制備的基因組DNA作為PCR擴增的模板，用引物ITS 1(5′-TCCGTAGGTGAACCTG CGG-3′)和ITS 4(5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′)對真菌基因組DNA中的18S rDNA基因片段進行擴增。

50μL的PCR反應體系為：Mix25μL、DNA模板3μL、引物ITS 1(10μmol·L-1)μL、ITS(10μmol·L-1)4μL、ddRnase水20μL

PCR反應條件為：預變性94℃4min；變性94℃30s，退火55℃30s，延伸72℃30s，30次循環(huán)；總延伸72℃8min。反應完成后用2％瓊脂糖凝膠電泳檢測。符合條件的PCR產(chǎn)物進行序列測定。

3.2.3測序結(jié)果的比對分析

測序結(jié)果序列通過BLAST與GenBank數(shù)據(jù)庫中的已有效發(fā)表的菌株序列進行比對，下載相似度較高的已有效發(fā)表菌株的18S rDNA基因序列，用MEGA5.03軟件對序列進建系統(tǒng)發(fā)育樹的行構(gòu)(如圖1所示)，確定菌株的分類學地位。

4試驗結(jié)果

4.1CCTCC M 2016376的形態(tài)學觀察結(jié)果

黑曲霉菌株CCTCC M 2016376在PDA上生長較快孢子褐色或者淺褐色，平鋪整個菌落表面，較厚重，邊緣白色粉狀，背面有色素為淺黃色；

在SDA上菌落呈橢圓形或者類圓形，菌落中心白色，四周褐色或淺褐色孢子密集，邊緣稀疏，菌毛黃白色，有皺褶樣紋理，背面菌落中心有黃色色素產(chǎn)生，透明，直徑約61mm；

在孟加拉紅上圓形或類圓形，菌落呈黃色，淺褐色孢子分布不均勻，四周有放射狀紋理，菌落邊緣菌落表面淺黃色，具放射狀紋理，背面紅黃色，直徑約28mm。

鏡下觀察黑曲霉菌株CCTCC M 2016376菌絲有隔，多分枝，分生孢子梗著生在足細胞上，具疣狀突起，足細胞肥大透明，頂囊球形，雙層小梗，部分可育，分生孢子球形。

4.2CCTCC M 2016376的分子生物學鑒定結(jié)果

4.2.1CCTCC M 2016376的18SrDNA序列測定結(jié)果

測序結(jié)果該片段由559個堿基組成，得到黑曲霉CCTCC M 2016376的18S rDNA序列為：GATCGACGCGGGTCTTTGGGCCACCTCCCATCCGTGTCTATTGTACCCTGTTGCTTCGGCGGGCCCGCCGCTTGTCGGCCGCCGGGGGGGCGCCTCTGCCCCCCGGGCCCGTGCCCGCCGGAGACCCCAACACGAACACTGTCTGAAAGCGTGCAGTCTGAGTTGATTGAATGCAATCAGTTAAAACTTTCAACAATGGATCTCTTGGTTCCGGCATCGATGAAGAACGCAGCGAAATGCGATAACTAATGTGAATTGCAGAATTCAGTGAATCATCGAGTCTTTGAACGCACATTGCGCCCCCTGGTATTCCGGGGGGCATGCCTGTCCGAGCGTCATTGCTGCCCTCAAGCCCGGCTTGTGTGTTGGGTCGCCGTCCCCCTCTCCGGGGGGACGGGCCCGAAAGGCAGCGGCGGCACCGCGTCCGATCCTCGAGCGTATGGGGCTTTGTCACATGCTCTGTAGGATTGGCCGGCGCCTGCCGACGTTTTCCAACCATTCTTTCCAGGTTGACCTCGGATCAGGTAGGGATACCCGCTGAACTTAAGCATATCAAAAA4.2.2同源進化樹構(gòu)建

通過BLAST比對，在GenBank數(shù)據(jù)庫中下載與待測黑曲霉18S rDNA基因序列相似度較近的序列，用MEGA5.0軟件對黑曲霉18S rDNA基因序列進行多重序列比對，構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。二2,4,6-三-O-沒食子酰-D-葡萄糖含量的測定

按本發(fā)明制備方法制備的2,4,6-三-O-沒食子酰-D-葡萄糖，經(jīng)檢測，沒食子酸的含量達到30.22％。

三2,4,6-三-O-沒食子酰-D-葡萄糖進行核磁共振及質(zhì)譜檢測

取白色粉末10mg，氘代丙酮溶解，核磁共振檢測，得到¹H-NMR(acetone-d₆)，¹³C-NMR(acetone-d₆)，DEPT135，¹H-¹H COSY(acetone-d₆)，HSQC(acetone-d₆)，HMBC(acetone-d₆)譜(如附圖4-9所示)。稱取白色粉末適量，甲醇溶解，高分辨質(zhì)譜檢測分子量(如圖10所示)。

四2,4,6-三-O-沒食子酰-D-葡萄糖的抗腫瘤活性研究

精密稱取2,4,6-三-O-沒食子酰-D-葡萄糖15.91mg，加入DMSO(二甲基亞砜)使溶解，配制成1mmol/L的母液，用完全培養(yǎng)液稀釋成100umol/L、300umol/L、500umol/L、700umol/L、900umol/L的藥液(含1％DMSO)過濾除菌。

精密稱取MTT(噻唑藍)粉末約100mg溶于20mLPBS(磷酸緩沖鹽溶液)中，過濾除菌。

將生長狀態(tài)良好的NCI-H460和A549細胞消化后，A549和NCI-H460細胞形態(tài)圖如圖11所示，用含10％胎牛血清、100U/mL青鏈霉素混合液的RPMI-1640培養(yǎng)基配成單個細胞懸液，以1×10⁵個ml^-1細胞接種于96孔培養(yǎng)板中，每孔200ul，置于37℃，5％CO₂細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h,、吸棄舊培養(yǎng)液，每孔加入配制好的藥液200uL，每個濃度平行5孔，培養(yǎng)24h、48h、72h、96h后，每孔加入20ulMTT液(5mg/ml)，繼續(xù)培養(yǎng)4h后棄上清，每孔加入150ulDMSO，振蕩5min，使甲瓚結(jié)晶溶解完全，用酶標儀492nm波長測各孔OD值，以每組各孔平均吸光度OD值的平均值作為各組OD，按以下公式計算2,4,6-三-O-沒食子酰-D-葡萄糖藥液對NCI-H460和A549細胞的抑制率：抑制率(IR％)＝(1－給藥組OD均值/空白對照組OD均值)×100％。

實驗結(jié)果表明，2,4,6-三-O-沒食子酰-D-葡萄糖濃度為700umol/L48h對A549和NCI-H460細胞生長抑制作用最強。

綜上，本發(fā)明通過分離和篩選出使百藥煎中沒食子酸含量最高的黑曲霉BYJ.H-1，使得黑曲霉CCTCC M 2016376發(fā)酵百藥煎鞣質(zhì)的轉(zhuǎn)化率大大提高，并提供了具體的工藝技術(shù)參數(shù)，為百藥煎的質(zhì)量控制及規(guī)范化生產(chǎn)提供依據(jù)，首次發(fā)現(xiàn)的新化合物2,4,6-三-O-沒食子酰-D-葡萄糖，利用細胞模型證明了2,4,6-三-O-沒食子酰-D-葡萄糖具有抗腫瘤活性，為開發(fā)新的抗腫瘤藥提供了依據(jù)，具有實際的臨床意義，適合大范圍的推廣和應用。

SEQUENCE LISTING

<110> 河南中醫(yī)藥大學

<120> 一種黑曲霉菌株及其發(fā)酵百藥煎生成新成分的制備方法與應用

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<160> 1

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 559

<212> DNA

<213> 黑曲霉

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gatcgacgcg ggtctttggg ccacctccca tccgtgtcta ttgtaccctg ttgcttcggc 60

gggcccgccg cttgtcggcc gccggggggg cgcctctgcc ccccgggccc gtgcccgccg 120

gagaccccaa cacgaacact gtctgaaagc gtgcagtctg agttgattga atgcaatcag 180

ttaaaacttt caacaatgga tctcttggtt ccggcatcga tgaagaacgc agcgaaatgc 240

gataactaat gtgaattgca gaattcagtg aatcatcgag tctttgaacg cacattgcgc 300

cccctggtat tccggggggc atgcctgtcc gagcgtcatt gctgccctca agcccggctt 360

gtgtgttggg tcgccgtccc cctctccggg gggacgggcc cgaaaggcag cggcggcacc 420

gcgtccgatc ctcgagcgta tggggctttg tcacatgctc tgtaggattg gccggcgcct 480

gccgacgttt tccaaccatt ctttccaggt tgacctcgga tcaggtaggg atacccgctg 540

aacttaagca tatcaaaaa 559