本發(fā)明涉及基因工程技術(shù)改造微生物，使得重組菌能以酒糟為原料生產(chǎn)γ-氨基丁酸的方法，屬于基因工程和生物工程領(lǐng)域。

背景技術(shù)：

γ-氨基丁酸(γ-amino butyric acid，GABA)是天然存在于某些生物體內(nèi)的非蛋白質(zhì)氨基酸，其為哺乳動(dòng)物中樞神經(jīng)系統(tǒng)重要的抑制性神經(jīng)遞質(zhì)，具有抗焦慮、降血壓、鎮(zhèn)定安神、增強(qiáng)記憶、調(diào)節(jié)激素分泌、促進(jìn)生殖、利尿，鎮(zhèn)痛等生理功能，在食品、飼料、醫(yī)藥等領(lǐng)域都具有廣泛的應(yīng)用。

正如以授權(quán)專利(CN201110209999.7)的技術(shù)背景所述，目前報(bào)道的利用酒糟的技術(shù)主要有：烘干去稻殼直接生產(chǎn)飼料；經(jīng)微生物發(fā)酵生產(chǎn)菌體蛋白飼料；進(jìn)行固態(tài)發(fā)酵，生產(chǎn)酶類飼料添加劑；厭氧發(fā)酵生產(chǎn)沼氣；也有利用酒糟的水解液發(fā)酵生產(chǎn)丁二酸的報(bào)道。但未見利用微生物發(fā)酵酒糟生產(chǎn)γ-氨基丁酸的報(bào)道。

因此，針對(duì)當(dāng)前酒糟的處理方式是直接用來做飼料的應(yīng)用附加值極低，且其中大部分的營養(yǎng)成分均未有效開發(fā)與利用等問題。發(fā)明人利用研究室前期通過菌種選育保藏Bacillus amyloliquefaciens B10-127(CCTCC NO：M2012349，已在已授權(quán)專利中公開，授權(quán)號(hào)：ZL201310342414.8)分泌的復(fù)雜胞外酶系，在一定條件下利用酒糟作為碳源進(jìn)行生長和代謝的特性，通過基因工程技術(shù)改造該菌種使其能生物發(fā)酵轉(zhuǎn)化酒糟為γ-氨基丁酸。有效開發(fā)利用酒糟，生產(chǎn)高附加值物質(zhì)，減少酒糟對(duì)環(huán)境的污染，在一定程度上能帶來可觀的經(jīng)濟(jì)效益。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是提供一種微生物利用酒糟發(fā)酵生產(chǎn)γ-氨基丁酸的方法。

本發(fā)明提供一株可利用酒糟發(fā)酵生產(chǎn)γ-氨基丁酸的基因工程菌種。

所述的酒糟為發(fā)酵酒醪經(jīng)壓榨、分離去除酒液后留下的固形物，經(jīng)預(yù)粉碎處理的基質(zhì)。

本發(fā)明的技術(shù)方案：通過基因工程技術(shù)，構(gòu)建一株能以廉價(jià)酒糟為碳源直接發(fā)酵生產(chǎn)γ-氨基丁酸的重組解淀粉芽孢桿菌。

所述的重組菌發(fā)明人按分類命名為B.amyloliquefaciens B10-127/pGAD.

所述重組菌的構(gòu)建方法如下：

(1)以植物乳桿菌GB01-21(CCTCCM209102)的基因組DNA為模板，利用正向引物F(5’-TTCCATATGATGGACCAGAAGCTGTTAAC-3’，酶切位點(diǎn)NdeI)，反向引物R(5’-GGCGGATCCCAGGTGTGTTTAAAGCTGTT-3’，酶切位點(diǎn)BamHI)進(jìn)行PCR擴(kuò)增即得到植物乳桿菌谷氨酸脫羧酶基因全長1401bp，所述核苷酸序列是SEQ ID N0.1所示的序列。

(2)將上一步得到的重組基因序列，連接到pMA5表達(dá)載體中，得到重組質(zhì)粒pMA5-GAD，重組質(zhì)?；D(zhuǎn)化B.amyloliquefaciens B10-127，獲得重組解淀粉芽孢桿菌，命名為B.amyloliquefaciens B10-127/pGAD。

發(fā)酵培養(yǎng)基：酒糟100g/L，葡萄糖30g/L，玉米漿5g/L，尿素3g/L，檸檬酸鈉6g/L，K2HPO44g/L，MgSO40.2g/L；將上述發(fā)酵培養(yǎng)基用5mol/L的NaOH調(diào)節(jié)其pH至6.5(接種后添加商品化500U/mL左右糖化酶、300U/mL左右復(fù)合纖維素酶和少量氨基酸氧化酶，不用添加淀粉酶)。其中葡萄糖的作用是保證發(fā)酵前期菌體快速生長。

本發(fā)明的效益：在一定條件下利用酒糟作為碳源進(jìn)行生長和代謝的特性，通過基因工程技術(shù)改造該菌種使其能生物發(fā)酵轉(zhuǎn)化酒糟為γ-氨基丁酸。有效開發(fā)利用酒糟，生產(chǎn)高附加值物質(zhì)，減少酒糟對(duì)環(huán)境的污染，在一定程度上能帶來可觀的經(jīng)濟(jì)效益。

具體實(shí)施方式

實(shí)施例1含谷氨酸脫羧酶重組載體的構(gòu)建

(1)谷氨酸脫羧酶基因片段獲得：以植物乳桿菌GB01-21(CCTCCM209102)的基因組DNA為模板，利用正向引物F(5’-TTCCATATGATGGACCAGAAGCTGTTAAC-3’，酶切位點(diǎn)NdeI)，反向引物R(5’-GGCGGATCCCAGGTGTGTTTAAAGCTGTT-3’，酶切位點(diǎn)BamHI)進(jìn)行PCR擴(kuò)增。

(2)將重組基因與pMA5分別用BamHI、NdeI雙酶切，純化后用T4DNA連接酶16℃過夜連接。連接產(chǎn)物化學(xué)法轉(zhuǎn)化JM109感受態(tài)細(xì)胞。轉(zhuǎn)化液涂布含卡那霉素(50mg/L)LB平板，提取質(zhì)粒，雙酶切驗(yàn)證構(gòu)建的重組質(zhì)粒，命名為pMA5-GAD。測(cè)序工作由上海生工完成。

實(shí)施例2重組解淀粉芽孢桿菌的構(gòu)建

將實(shí)施例1得到的重組質(zhì)粒pMA5-GAD化學(xué)法轉(zhuǎn)化入B.amyloliquefaciensB10-127感受態(tài)細(xì)胞，具體方法如下：

(1)轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)所需溶液如下(g/L)：

Sp-A：(NH₄)₂SO₄ 4，K₂HPO₄ 28，檸檬酸鈉12Sp-B：MgSO₄·7H₂O 0.4

100×CAYE：Casamino acid 20，酵母粉100 Sp I培養(yǎng)基：Sp-A 49％，Sp-B 49％，50％葡萄糖2％，100×CAYE 2％Sp II培養(yǎng)基：Sp I培養(yǎng)基98％，50mmol/LCaCl₂ 1％，250mmol/L MgCl₂ 1％。115℃濕熱滅菌。

(2)將B.amyloliquefaciens B10-127的單菌落接種至2mL Sp I培養(yǎng)基中(50mL離心管)，37℃、200r/min培養(yǎng)過夜；

(3)取100μL培養(yǎng)液至5mL Sp I培養(yǎng)基中，37℃、200r/min培養(yǎng)至對(duì)數(shù)期(OD600值為1左右)，約4～5h；

(4)取200μL培養(yǎng)液至2mL Sp II培養(yǎng)基中，37℃、200r/min培養(yǎng)90min，取出后加入20μL 10mmol/L EGTA，于37℃、200r/min繼續(xù)培養(yǎng)10min，然后分裝成500μL每管，加入5μL重組質(zhì)粒pMA5-GAD，混勻，37℃、200r/min培養(yǎng)90min，取菌液涂布抗性平板。37℃培養(yǎng)12h，挑取陽性轉(zhuǎn)化子驗(yàn)證。得到重組菌B.amyloliquefaciens B10-127/pGAD。

實(shí)施例3：重組菌B.amyloliquefaciens B10-127/pGAD利用酒糟發(fā)酵產(chǎn)γ-氨基丁酸。

將實(shí)施例2構(gòu)建的重組菌B.amyloliquefaciens B10-127/pGAD接種于l0mL含卡那霉素的LB培養(yǎng)基中，37℃振蕩培養(yǎng)過夜，搖床轉(zhuǎn)速160r/min，培養(yǎng)時(shí)間為12h左右，種子培養(yǎng)基組成：淀粉10g/L，酵母提取物5g/L，胰蛋白胨10g/L，NaCl 10g/L。

將上述培養(yǎng)好的種子液按4％接種量接種于發(fā)酵培養(yǎng)基中進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)，發(fā)酵溫度37℃，空氣流量為120m³/h·m³培養(yǎng)基，攪拌轉(zhuǎn)速為350r/min。定時(shí)取樣測(cè)定細(xì)胞濃度、底物殘留量和γ-氨基丁酸生產(chǎn)量，發(fā)酵培養(yǎng)60h，即刻停止發(fā)酵。發(fā)酵結(jié)束后，γ-氨基丁酸產(chǎn)量達(dá)到48.9g/L。

雖然本發(fā)明已以較佳實(shí)施例公開如上，但其并非用以限定本發(fā)明，任何熟悉此技術(shù)的人，在不脫離本發(fā)明的精神和范圍內(nèi)，都可做各種的改動(dòng)與修飾，因此本發(fā)明的保護(hù)范圍應(yīng)該以權(quán)利要求書所界定的為準(zhǔn)。

序列表

<110> 江南大學(xué)

<120>一種微生物利用酒糟發(fā)酵生產(chǎn)γ-氨基丁酸的方法

<160> 2

<210> 2

<211> 1401

<212> DNA

<213> Lactobacillus plantarum GB01-21

<400> 1

1 ATGGCAATGT TATACGGTAA ACACAATCAT GAAGCTGAAG AATACTTGGA ACCAGTCTTT

61 GGTGCGCCTT CTGAACAACA TGATCTTCCT AAGTATCGGT TACCAAAGCA TTCATTATCC

121 CCTCGAGAAG CCGATCGCTT AGTTCGTGAT GAATTATTAG ATGAAGGCAA TTCACGACTG

181 AACTTGGCAA CTTTTTGTCA GACCTATATG GAACCCGAAG CCGTTGAATT GATGAAGGAT

241 ACGCTGGCTA AGAATGCCAT CGACAAATCT GAGTACCCCC GCACGGCCGA GATTGAAAAT

301 CGGTGTGTGA ACATTATTGC CAATCTGTGG CACGCACCTG ATGACGAACA CTTTACGGGT

361 ACCTCTACGA TTGGCTCCTC TGAAGCTTGT ATGTTAGGCG GTTTAGCAAT GAAATTCGCC

421 TGGCGTAAAC GCGCTCAAGC GGCAGGTTTA GATCTGAATG CCCATCGACC TAACCTCGTT

481 ATTTCGGCTG GCTATCAAGT TTGCTGGGAA AAGTTTTGTG TCTACTGGGA CGTTGACATG

541 CACGTGGTCC CAATGGATGA GCAACACATG GCCCTTGACG TTAACCACGT CTTAGACTAC

601 GTGGACGAAT ACACAATTGG TATCGTCGGT ATCATGGGCA TCACTTATAC CGGTCAATAT

661 GACGACCTAG CCGCACTCGA TAAGGTCGTT ACTCACTACA ATCATCAGCA TCCCAAATTA

721 CCAGTCTACA TTCACGTTGA CGCAGCGTCA GGTGGCTTCT ATACCCCATT TATTGAGCCG

781 CAACTCATCT GGGACTTCCG GTTGGCTAAC GTCGTTTCGA TCAACGCCTC CGGGCACAAG

841 TACGGTTTAG TTTATCCCGG GGTCGGCTGG GTCGTTTGGC GTGATCGTCA GTTTTTACCG

901 CCAGAATTAG TCTTCAAAGT TAGTTATTTA GGTGGGGAGT TGCCGACAAT GGCGATCAAC

961 TTCTCACATA GTGCAGCCCA GCTCATTGGA CAATACTATA ATTTCATTCG CTTTGGTATG

1021 GACGGTTACC GCGAGATTCA AACAAAGACT CACGATGTTG CCCGCTACCT AGCAGCTGCT

1081 CTGGATAAAG TTGGTGAGTT TAAGATGATC AATAACGGAC ACCAACTACC TCTGATTTGT

1141 TACCAACTAG CCCCGCGCGA AGATCGTGAA TGGACCCTTT ATGATTTATC GGACCGCCTA

1201 TTAATGAACG GCTGGCAAGT ACCAACATAT CCTTTACCTG CTAATCTAGA ACAACAAGTC

1261 ATCCAACGAA TCGTCGTTCG AGCTGACTTT GGCATGAATA TGGCACACGA TTTCATGGAT

1321 GACCTGACCA AGGCTGTCCA TGACTTAAAC CAAGCCCACA TTGTCTATCA TCATGACGCG

1381 GCACCTAAGA AATACGGATT CACACACTGA