一種甘精胰島素前體的復(fù)性方法
【專利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了一種甘精胰島素前體的復(fù)性方法，屬于生物醫(yī)藥蛋白折疊領(lǐng)域。本發(fā)明通過(guò)將甘精胰島素前體溶解于變性劑溶液中，加入還原劑進(jìn)行還原，調(diào)節(jié)pH值為9.5～11.5，控制反應(yīng)體系的溫度為35℃～45℃，反應(yīng)30～60min，獲得變性后的甘精胰島素前體溶液；將變性后的甘精胰島素前體加入稀釋緩沖液中，再加入蛋白質(zhì)折疊添加劑，調(diào)節(jié)pH值為9.5～11.5，向溶液中持續(xù)通入空氣，控制反應(yīng)體系的溫度0℃～20℃，反應(yīng)2～40小時(shí)，獲得甘精胰島素復(fù)性液。本發(fā)明縮短了復(fù)性反應(yīng)時(shí)間，提高了正確折疊的蛋白含量，復(fù)性效率提高至51%～62%，同時(shí)降低了生產(chǎn)成本，適合工業(yè)化大生產(chǎn)應(yīng)用。
【專利說(shuō)明】一種甘精胰島素前體的復(fù)性方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于生物醫(yī)藥蛋白折疊領(lǐng)域，具體涉及一種甘精胰島素前體的復(fù)性方法，特別涉及一種利用聚乙二醇、甘油和金屬離子等作為蛋白質(zhì)折疊添加劑的空氣氧化稀釋復(fù)性方法，將錯(cuò)誤折疊的甘精胰島素前體轉(zhuǎn)化成具有正確空間結(jié)構(gòu)的前體，復(fù)性效率可以超過(guò)50%，降低了二硫鍵錯(cuò)配副產(chǎn)物的生成，給后續(xù)純化工作帶來(lái)了極大的方便。
【背景技術(shù)】
[0002]甘精胰島素(glycine arginine insulin)是一種通過(guò)重組DNA技術(shù)生產(chǎn)并用于治療1、II型糖尿病的長(zhǎng)效胰島素類生物制品。它是在人胰島素B鏈羧基末端增加了兩個(gè)精氨酸，同時(shí)也把A鏈羧基末端A21位置的天冬酰胺替換成甘氨酸，A鏈羧基末端為甘氨酸防止了脫氨產(chǎn)物的形成，使甘精胰島素具有很好的穩(wěn)定性；又由于增加的兩個(gè)精氨酸帶正電荷，所以甘精膜島素的等電點(diǎn)由5.4 (膜島素等電點(diǎn))左右升聞至7.0左右，因此該膜島素類似物可以在偏酸的條件下(PH4.0)配制成性質(zhì)穩(wěn)定且澄清的注射液。甘精胰島素注射前勿需混懸，皮下注射后在體內(nèi)(PH7.4)形成微小沉淀可持續(xù)緩慢釋放甘精胰島素，血漿濃度平穩(wěn)，峰谷曲線小，作用持續(xù)時(shí)間長(zhǎng)。每日皮下注射一次降糖作用可維持24小時(shí)，且無(wú)明顯的血藥峰值出現(xiàn)，可較好地模擬正常基礎(chǔ)胰島素的分泌，降低發(fā)生低血糖的概率。
[0003]目前國(guó)內(nèi)外生產(chǎn)的甘精胰島素前體采用大腸桿菌表達(dá)，其體系中缺乏真核生物形成蛋白正確結(jié)構(gòu)的環(huán) 境以及相關(guān)的修飾元件，在大腸桿菌中高水平表達(dá)經(jīng)常導(dǎo)致蛋白聚集而形成不溶的、無(wú)活性的包涵體。包涵體經(jīng)過(guò)分離、變性溶解和復(fù)性后，形成有生物活性的蛋白，在復(fù)性過(guò)程中需要提供有利于單鏈蛋白的折疊環(huán)境，同時(shí)提供適當(dāng)?shù)难趸€原環(huán)境，使甘精胰島素前體形成正確的二級(jí)結(jié)構(gòu)。
[0004]復(fù)性的效率直接影響著產(chǎn)量的高低。復(fù)性是一個(gè)復(fù)雜的過(guò)程，復(fù)性過(guò)程中的蛋白聚集反應(yīng)是導(dǎo)致復(fù)性率低的首要原因。當(dāng)變性劑的濃度較低后，單鏈的蛋白分子迅速折疊形成大量的二級(jí)結(jié)構(gòu)的中間態(tài)分子，中間態(tài)分子表面暴露的疏水區(qū)相互作用，發(fā)生聚集作用。蛋白的聚集和正確折疊式之間是競(jìng)爭(zhēng)反應(yīng)，因此減少蛋白的聚集作用，提高蛋白的正確折疊對(duì)復(fù)性至關(guān)重要。
[0005]現(xiàn)有技術(shù)中有關(guān)于胰島素的復(fù)性方法，例如在F-J.魯伯洛德C07K14/62，中國(guó)專利CN1132845C中公開(kāi)了獲得具有正確鍵合的胱氨酸鍵的胰島素前體的改進(jìn)的方法，即在半胱氨酸或半胱氨酸鹽酸鹽和離液助劑存在下，獲得到30%~50%的正確復(fù)性產(chǎn)物。王驪麗C07K14/62，中國(guó)專利CN103172727A中公開(kāi)了一種高效體積排阻色譜復(fù)性同時(shí)純化重組人胰島素原的方法，嘗試該方法在甘精胰島素前體進(jìn)行復(fù)性中，結(jié)果顯示回收率低。目前，在已公開(kāi)文獻(xiàn)中鮮有關(guān)于甘精胰島素高復(fù)性效率的工藝及參數(shù)報(bào)道。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]本發(fā)明的目的在于通過(guò)優(yōu)化復(fù)性工藝參數(shù)，提供一種甘精胰島素前體的復(fù)性方法，即用變性劑溶解包涵體，加入還原劑打開(kāi)鏈間形成的二硫鍵和鏈內(nèi)的非活性二硫鍵，具有一級(jí)結(jié)構(gòu)的甘精胰島素前體在稀釋液中正確折疊成具有活性的蛋白，在復(fù)性過(guò)程中加入聚乙二醇、甘油、金屬離子等蛋白質(zhì)折疊添加劑。該方法能提高復(fù)性的效率至51%~62%，降低了二硫鍵錯(cuò)配副產(chǎn)物的生成，給后續(xù)純化工作帶來(lái)了極大的方便。
[0007]本發(fā)明的目的是通過(guò)采用下述技術(shù)方案來(lái)實(shí)現(xiàn)的:一種甘精胰島素前體的復(fù)性方法，包括如下步驟:
[0008]將甘精胰島素前體溶解于變性劑溶液中，得到溶液I ;再加入還原劑進(jìn)行還原，調(diào)節(jié)pH值為9.5~11.5，控制反應(yīng)體系I的溫度為35°C~45°C，反應(yīng)30~60min，獲得變性后的甘精胰島素前體溶液；將變性后的甘精胰島素前體溶液加入稀釋緩沖液中，得到溶液II ;向溶液II中加入蛋白質(zhì)折疊添加劑，調(diào)節(jié)PH值為9.5~11.5 ;接著向得到的溶液中持續(xù)通入空氣，控制反應(yīng)體系II的溫度為O V~20°C，反應(yīng)2~40小時(shí)，獲得甘精胰島素復(fù)性液。
[0009]所述的甘精胰島素前體為由大腸桿菌通過(guò)重組DNA技術(shù)以包涵體形式表達(dá)獲得，具體是利用基因重組技術(shù)對(duì)人胰島素的進(jìn)行結(jié)構(gòu)改造而成，為20A-Gly21-C肽-30B-Arg31-Arg32，即將人胰島素A鏈的第21位氨基酸由甘氨酸替換，同時(shí)在B鏈第30位氨基酸后引入兩個(gè)精氨酸，再以C肽連接A鏈和B鏈后轉(zhuǎn)入大腸桿菌中進(jìn)行表達(dá)。
[0010]所述的溶液I中的甘精胰島素前體的濃度優(yōu)選為17~28g/L。
[0011 ] 所述的變性 劑為尿素或鹽酸胍。
[0012]所述的變性劑溶液優(yōu)選為6~8M尿素溶液或鹽酸胍溶液，pH值為9.5~11.5 ;進(jìn)一步優(yōu)選6~8M、pH9.5~11.5的尿素溶液。
[0013]所述的還原劑選自二硫蘇糖醇(DTT)和半胱氨酸鹽酸鹽中的一種或兩種。
[0014]所述的還原劑的用量為按還原劑與甘精胰島素前體質(zhì)量比1:2~1:4計(jì)算。
[0015]所述的稀釋緩沖液選自三羥甲基氨基甲烷(Tris)、甘氨酸、碳酸氫銨和磷酸鹽中的一種制備得到的緩沖液。
[0016]所述的稀釋緩沖液優(yōu)選為10~50mM、pH9.5~11.5的Tris-HCl緩沖液或10~50mM、pH9.5~11.5的甘氨酸緩沖液。
[0017]所述的溶液II中變性后的甘精胰島素前體的終濃度優(yōu)選為0.8~2.0g/L，更優(yōu)選為 1.0 ~1.4g/L。
[0018]所述的蛋白質(zhì)折疊添加劑為聚乙二醇、甘油和金屬離子中的至少一種。
[0019]所述的聚乙二醇為PEG4000或PEG6000。
[0020]所述的金屬離子為Ca2+、Mg2+、Cu2+和Fe3+中的一種。
[0021]所述的蛋白質(zhì)折疊添加劑優(yōu)選為以所述的溶液II的體積為分母，濃度為0.5~2g/L的聚乙二醇、體積百分比5%~20%的甘油和5~50 μ M的金屬離子組成，進(jìn)一步優(yōu)選為濃度為0.5~2g/L的聚乙二醇4000、體積百分比5%~20%的甘油和5~20 μ M的Cu2+組成。
[0022]所述的Cu2+由CuSO4或CuCl2提供。
[0023]所述的通入空氣優(yōu)選為將空氣按每升溶液中以2~100cm3/H的速率向溶液中通入。
[0024]所述的反應(yīng)體系II的反應(yīng)條件優(yōu)選為4~15°C反應(yīng)12~25小時(shí)。
[0025]所述的甘精胰島素前體的復(fù)性方法，更具體包括如下步驟:[0026](I)甘精胰島素的變性方法:將甘精胰島素前體溶解于6~8M、pH9.5~11.5的變性劑溶液中，得到溶液I ;加入還原劑，調(diào)節(jié)PH值為9.5~11.5，其中還原劑與甘精胰島素前體按質(zhì)量比1:2~1:4配比，控制反應(yīng)體系的溫度為35°C~45°C，反應(yīng)30~60min，獲得變性后的甘精胰島素前體溶液；
[0027](2)甘精胰島素的復(fù)性方法:將變性后的甘精胰島素前體溶液加入稀釋緩沖液中，得到溶液II;向溶液II中加入聚乙二醇、甘油和金屬離子，其中，以溶液II的體積為基準(zhǔn)，聚乙二醇的濃度為0.5~2g/L，甘油的濃度為體積百分比5%~20%、金屬離子的濃度為5~50 μ M，調(diào)節(jié)pH值為9.5~11.5 ;接著向所得溶液中持續(xù)通入空氣，控制反應(yīng)體系的溫度(TC~20°C，反應(yīng)2~40小時(shí)，獲得甘精胰島素復(fù)性液；
[0028]步驟(1)中所述的甘精胰島素前體為由大腸桿菌通過(guò)重組DNA技術(shù)以包涵體形式表達(dá)獲得，具體是利用基因重組技術(shù)對(duì)人胰島素的進(jìn)行結(jié)構(gòu)改造而成，為20A-Gly21-C肽-30B-Arg31-Arg32，即將人胰島素A鏈的第21位氨基酸由甘氨酸替換，同時(shí)在B鏈第30位氨基酸后引入兩個(gè)精氨酸，再以C肽連接A鏈和B鏈后轉(zhuǎn)入大腸桿菌中進(jìn)行表達(dá)；優(yōu)選將甘精胰島素前體按17~28g/L的濃度溶解于6~8M的變性劑溶液中；
[0029]步驟(1)中所述的變性劑優(yōu)選為尿素或鹽酸胍；
[0030]步驟(1)中所述的還原劑優(yōu)選為DTT和半胱氨酸鹽酸鹽中的一種或兩種；
[0031]步驟(2)中所述的溶液II中變性后的甘精胰島素前體的終濃度優(yōu)選為0.8~
2.0g/L，更優(yōu)選為 1.0~1.4g/L;
[0032]步驟(2)中所述的稀釋緩沖液選自三羥甲基氨基甲烷(Tris)、甘氨酸、碳酸氫銨和磷酸鹽中的一種配制得到的緩沖液；
`[0033]所述稀釋緩沖液優(yōu)選為10~50mM、pH9.5~11.5的Tris-HCl緩沖液或10~50mM、pH9.5~11.5的甘氨酸緩沖液；
[0034]步驟(2)中所述的聚乙二醇選自PEG4000和PEG6000中的一種；優(yōu)選為聚乙二醇4000 ；
[0035]步驟(2)中所述的金屬離子為Ca2+、Mg2+、Cu2+和Fe3+中的一種；優(yōu)選為由CuSO4或CuCl2提供的Cu2+ ;濃度優(yōu)選為5~20 μ M ;
[0036]步驟(2)中所述的通入空氣優(yōu)選為將空氣按每升溶液中以2~100cm3/H的速率向溶液中通入；
[0037]步驟(2)中所述的反應(yīng)體系的反應(yīng)溫度優(yōu)選為4~15°C ;
[0038]步驟(2)中所述的反應(yīng)體系的反應(yīng)時(shí)間優(yōu)選為12~25小時(shí)。
[0039]本發(fā)明中的還原劑的加入比例在甘精胰島素前體復(fù)性過(guò)程至關(guān)重要的。甘精胰島素前體含有三對(duì)二硫鍵，在大腸桿菌表達(dá)形成包涵體過(guò)程中，鏈間和鏈內(nèi)的二硫鍵錯(cuò)配導(dǎo)致蛋白無(wú)活性，需要加入巰基還原劑進(jìn)行處理以還原這些二硫鍵，還原劑的加入比例需要考慮到后續(xù)的復(fù)性過(guò)程。當(dāng)加入過(guò)高濃度的還原劑時(shí)，不僅能夠還原打開(kāi)包涵體中錯(cuò)誤配對(duì)的二硫鍵，還能還原包涵體中正確配對(duì)的二硫鍵，給后續(xù)的復(fù)性反應(yīng)造成困難，而低濃度的還原劑由于不能夠徹底還原包涵體中錯(cuò)誤配對(duì)的二硫鍵，同樣會(huì)直接影響復(fù)性反應(yīng)中目的蛋白正確折疊和二硫鍵正確配對(duì)。本發(fā)明優(yōu)選還原劑與甘精胰島素前體的質(zhì)量比優(yōu)選為1:3加入還原劑。
[0040]本發(fā)明中蛋白質(zhì)折疊添加劑聚乙二醇、甘油和金屬離子的加入對(duì)甘精胰島素前體復(fù)性的效率提高很大。甘精胰島素前體的稀釋氧化復(fù)性體系，是以空氣中的氧氣作為氧化劑。蛋白質(zhì)折疊添加劑可以減少聚集，促進(jìn)折疊，如聚乙二醇可以保護(hù)熔球體，增加黏度，甘油對(duì)蛋白質(zhì)具有優(yōu)先的水合作用，金屬離子可以催化蛋白質(zhì)中還原劑殘基的空氣氧化速率。蛋白質(zhì)折疊添加劑的加入，可以加速形成正確配對(duì)的二硫鍵，從而有效增加了正確折疊的目的蛋白含量，同時(shí)也大大縮短了包涵體的復(fù)性反應(yīng)時(shí)間。本發(fā)明優(yōu)選為0.5~2g/L聚乙二醇4000，金屬離子溶液為5~20 μ M CuSO4或CuCl2。
[0041]本發(fā)明相對(duì)于現(xiàn)有技術(shù)具有如下的優(yōu)點(diǎn)及效果:
[0042](1)本發(fā)明涉及的甘精胰島素前體復(fù)性方法，二硫鍵錯(cuò)配的副產(chǎn)物少，所得的復(fù)性液更有利于后續(xù)的純化工藝。
[0043](2)本發(fā)明采用蛋白質(zhì)折疊添加劑聚乙二醇、甘油和金屬離子輔助復(fù)性，縮短了反應(yīng)時(shí)間，提高了正確折疊的蛋白含量，大大地提高復(fù)性效率至51%~62%。
[0044](3)本發(fā)明涉及的復(fù)性方法，采用稀釋復(fù)性，以空氣作為氧化劑，大大的降低了生產(chǎn)成本，且適合工業(yè)化大生產(chǎn)應(yīng)用。
【專利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0045]圖1實(shí)施例1復(fù)性后的樣品HPLC圖譜圖。
[0046]圖2實(shí)施例2復(fù)性后的樣品HPLC圖譜圖。
[0047]圖3實(shí)施例3復(fù)性后的樣品HPLC圖譜圖。
[0048]圖4實(shí)施例4復(fù)性后的樣品HPLC圖譜圖。
【具體實(shí)施方式】
[0049]下面結(jié)合實(shí)施例和附圖對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)的描述，但本發(fā)明的實(shí)施方式不限于此。
[0050]本發(fā)明實(shí)施例在復(fù)性過(guò)程中用于檢測(cè)復(fù)性效率(％)的公式如下:
[0051]復(fù)性效率(％)=(復(fù)性后正確折疊的甘精胰島素前體質(zhì)量/復(fù)性前甘精胰島素前體質(zhì)量)X 100%
[0052]實(shí)驗(yàn)材料:
[0053]甘精胰島素前體:珠海聯(lián)邦制藥股份有限公司提供，批號(hào)F18121101 ;具體為按美國(guó)專利 US6100376 (A211B30, MODIFIED INSULIN DERIVATIVES HAVING AN ALTERED ACTIONPROFILE)中實(shí)施例6制備。
[0054]尿素來(lái)源于廣州西隴化工有限公司；半胱氨酸鹽酸鹽來(lái)源于武漢遠(yuǎn)大弘元股份有限公司；三羥甲基氨基甲烷來(lái)源于北京科奧科技有限公司；聚乙二醇4000來(lái)源于湖南爾康制藥股份有限公司；甘油來(lái)源于湖南爾康制藥股份有限公司；硫酸銅來(lái)源于廣州西隴化工有限公司；氯化銅來(lái)源于廣州西隴化工有限公司；鹽酸來(lái)源于珠海市華成達(dá)化工有限公司；氫氧化鈉來(lái)源于東江化學(xué)試劑有限公司。
[0055]通氣設(shè)備:E+H空氣流量計(jì)、壓縮空氣。
[0056]實(shí)施例1甘精胰島素前體的復(fù)性
[0057]室溫下，將10克甘精胰島素前體溶解于588mL6M、pH9.5的尿素溶液中，使甘精胰島素前體的蛋白濃度約為17g/L ;再加入5g DTT，調(diào)節(jié)pH值為9.5，控制反應(yīng)體系的溫度為35°C，反應(yīng) 30min。
[0058]將變性后的甘精胰島素前體溶液加入10mM、pH9.5的Tri s_HCl緩沖液中，用Tris-HCl緩沖液定容至10L，使甘精胰島素前體的蛋白濃度為l.0g/L，接著加入5gPEG4000、500mL甘油、8mg CuSO4,調(diào)節(jié)pH值為9.5，以20cm3/H的速率向復(fù)性液中持續(xù)通入空氣，控制反應(yīng)體系的溫度為4°C，反應(yīng)12小時(shí)后停止該反應(yīng)。取復(fù)性液20 μ L經(jīng)HPLC分析檢測(cè)，復(fù)性后的樣品HPLC圖譜見(jiàn)圖1，正確折疊復(fù)性的甘精胰島素前體HPLC圖譜的保留時(shí)間為19.98min，根據(jù)甘精胰島素前體的峰面積歸一化法計(jì)算復(fù)性后實(shí)際得到正確折疊復(fù)性的甘精胰島素前體的量為6.lg，甘精胰島素前體復(fù)性的收率經(jīng)計(jì)算約為61%。
[0059]實(shí)施例2甘精胰島素前體的復(fù)性
[0060]室溫下，將10克甘精胰島素前體溶解于357mL8M、pHll.5的尿素溶液中，使甘精胰島素前體的蛋白濃度約為28g/L，加入2.5g DTT，調(diào)節(jié)pH值為11.5，控制反應(yīng)體系的溫度為45°C，反應(yīng) 60min。
[0061]將變性后的甘精胰島素前體溶液加入50mM、pHll.5的Tris-HCl緩沖液中，用Tris-HCl緩沖液定容至7.14L，使甘精胰島素前體的蛋白濃度為1.4g/L，接著加入14.28gPEG4000、1428mL甘油、22.85mg CuSO4，調(diào)節(jié)pH值為11.5,以714cm3/H的速率向復(fù)性液中持續(xù)通入空氣，控制反應(yīng)體系的溫度15°C，反應(yīng)25小時(shí)后停止該反應(yīng)。取復(fù)性液20 μ L經(jīng)HPLC分析檢測(cè)，復(fù)性后的樣品HPLC圖譜見(jiàn)圖2，正確折疊復(fù)性的甘精胰島素前體HPLC圖譜的保留時(shí)間為20.71min，根據(jù)甘精胰島素前體的峰面積歸一化法計(jì)算復(fù)性后實(shí)際得到正確折疊復(fù)性的甘精胰島素前體的量為5.14g，甘精胰島素前體復(fù)性的收率經(jīng)計(jì)算約為51.40% ο
[0062]實(shí)施例3甘精胰島素前體的復(fù)性
[0063]室溫下，將10克甘精胰島素前體溶解于588mL6M、pH9.5的尿素溶液中，使甘精胰島素前體的蛋白濃度約為17g/L,加入5g半胱氨酸鹽酸鹽,調(diào)節(jié)pH值為9.5,控制反應(yīng)體系的溫度為35°C，反應(yīng)30min。
[0064]將變性后的甘精胰島素前體溶液加入10mM、pH9.5的甘氨酸稀釋緩沖液中，用甘氨酸稀釋緩沖液定容至10L，使甘精胰島素前體的蛋白濃度為1.(^/1，接著加入58PEG4000、500mL甘油、6.75mg CuCl2，調(diào)節(jié)pH值為9.5，以20cm3/H的速率向復(fù)性液中持續(xù)通入空氣，控制反應(yīng)體系的溫度4°C，反應(yīng)12小時(shí)后停止該反應(yīng)。取復(fù)性液20 μ L經(jīng)HPLC分析檢測(cè)，復(fù)性后的樣品HPLC圖譜見(jiàn)圖3，正確折疊復(fù)性的甘精胰島素前體HPLC圖譜的保留時(shí)間為19.94min，根據(jù)甘精胰島素前體的峰面積歸一化法計(jì)算復(fù)性后實(shí)際得到正確折疊復(fù)性的甘精胰島素前體的量為6.2g，甘精胰島素前體復(fù)性的收率經(jīng)計(jì)算約為62%。
[0065]實(shí)施例4甘精胰島素前體的復(fù)性
[0066]室溫下，將10克甘精胰島素前體溶解于357mL8M、pHll.5的尿素溶液中，使甘精胰島素前體的蛋白濃度約為28g/L,加入2.5g半胱氨酸鹽酸鹽,調(diào)節(jié)pH值為11.5,控制反應(yīng)體系的溫度為45°C，反應(yīng)60min。
[0067]將變性后的甘精胰島素前體溶液加入50mM、pHll.5的甘氨酸稀釋緩沖液中，用甘氨酸稀釋緩沖液定容至7.14L，使甘精胰島素前體的蛋白濃度為1.4g/L，接著加入14.28gPEG4000、1428mL甘油、19.28mg的CuCl2，調(diào)節(jié)pH值為IL 5，以714cm3/H的速率向復(fù)性液中持續(xù)通入空氣，控制反應(yīng)體系的溫度15°C，反應(yīng)25小時(shí)后停止該反應(yīng)。取復(fù)性液20 μ L經(jīng)HPLC分析檢測(cè)，復(fù)性后的樣品HPLC圖譜見(jiàn)圖4，正確折疊復(fù)性的甘精胰島素前體HPLC圖譜的保留時(shí)間為20.75min，根據(jù)甘精胰島素前體的峰面積歸一化法計(jì)算復(fù)性后實(shí)際得到正確折疊復(fù)性的甘精胰島素前體的量為5.35g，甘精胰島素前體復(fù)性的收率經(jīng)計(jì)算約為53.5%。
[0068]上述實(shí)施例為本發(fā)明較佳的實(shí)施方式，但本發(fā)明的實(shí)施方式并不受上述實(shí)施例的限制，其他的任何未背離本發(fā)明的精神實(shí)質(zhì)與原理下所作的改變、修飾、替代、組合、簡(jiǎn)化，均應(yīng)為等效的置換方式 ， 都包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。
【權(quán)利要求】
1.一種甘精胰島素前體的復(fù)性方法，其特征在于包括如下步驟:將甘精胰島素前體溶解于變性劑溶液中，得到溶液I ;再加入還原劑進(jìn)行還原，調(diào)節(jié)PH值為9.5~11.5，控制反應(yīng)體系I的溫度為35°C~45°C，反應(yīng)30~60min，獲得變性后的甘精胰島素前體溶液；將變性后的甘精胰島素前體溶液加入稀釋緩沖液中，得到溶液II ;向溶液II中加入蛋白質(zhì)折疊添加劑，調(diào)節(jié)pH值為9.5~11.5 ;接著向得到的溶液中持續(xù)通入空氣，控制反應(yīng)體系II的溫度為0°C~20°C，反應(yīng)2~40小時(shí)，獲得甘精胰島素復(fù)性液。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的甘精胰島素前體的復(fù)性方法，其特征在于: 所述的溶液I中的甘精胰島素前體的濃度為17~28g/L ； 所述的溶液II中變性后的甘精胰島素前體的終濃度為0.8~2.0g/L。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的甘精胰島素前體的復(fù)性方法，其特征在于:所述的溶液II中變性后的甘精胰島素前體的終濃度為1.0~1.4g/L。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的甘精胰島素前體的復(fù)性方法，其特征在于: 所述的變性劑為尿素或鹽酸胍； 所述的還原劑為二硫蘇糖醇和半胱氨酸鹽酸鹽中的一種或兩種； 所述的稀釋緩沖液為三羥甲基氨基甲烷 、甘氨酸、碳酸氫銨和磷酸鹽中的一種制備得到的緩沖液； 所述的蛋白質(zhì)折疊添加劑為聚乙二醇、甘油和金屬離子中的至少一種。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的甘精胰島素前體的復(fù)性方法，其特征在于: 所述的變性劑溶液為6~8M、pH9.5~11.5的尿素溶液或鹽酸胍溶液； 所述的還原劑的用量為按還原劑與甘精胰島素前體質(zhì)量比1:2~1:4計(jì)算； 所述的稀釋緩沖液為10~50mM、pH9.5~11.5的Tris-HCl緩沖液或10~50mM、pH9.5~11.5的甘氨酸緩沖液。
6.根據(jù)權(quán)利要求4所述的甘精胰島素前體的復(fù)性方法，其特征在于: 所述的聚乙二醇為PEG4000或PEG6000 ； 所述的金屬離子為Ca2+、Mg2+、Cu2+和Fe3+中的一種； 所述的蛋白質(zhì)折疊添加劑為由以溶液II體積為基準(zhǔn)，濃度為0.5~2g/L的聚乙二醇、體積百分比5%~20%的甘油和5~50 μ M的金屬離子組成。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的甘精胰島素前體的復(fù)性方法，其特征在于:所述的蛋白質(zhì)折疊添加劑為由以溶液11體積為基準(zhǔn)，濃度為0.5~2g/L的聚乙二醇4000、體積百分比5%~20%的甘油和5~20 μ M的Cu2+組成。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的甘精胰島素前體的復(fù)性方法，其特征在于:所述的通入空氣為將空氣按每升溶液中以2~100cm3/H的速率向溶液中通入； 所述的反應(yīng)體系II的反應(yīng)條件為4~15°C反應(yīng)12~25小時(shí)。
9.根據(jù)權(quán)利要求1~8任一項(xiàng)所述的甘精胰島素前體的復(fù)性方法，其特征在于包括如下步驟: (O甘精胰島素的變性方法:將甘精胰島素前體溶解于6~SM、pH9.5~11.5的變性劑溶液中，得到溶液I ;加入還原劑，調(diào)節(jié)PH值為9.5~11.5，其中還原劑與甘精胰島素前體按質(zhì)量比1:2~1:4配比，控制反應(yīng)體系的溫度為35°C~45°C，反應(yīng)30~60min，獲得變性后的甘精胰島素前體溶液；(2)甘精胰島素的復(fù)性方法:將變性后的甘精胰島素前體溶液加入稀釋緩沖液中，得到溶液II ;向溶液II中加入聚乙二醇、甘油和金屬離子，其中，以溶液II的體積為基準(zhǔn)，聚乙二醇的濃度為0.5~2g/L，甘油的濃度為體積百分比5%~20%、金屬離子的濃度為5~.50 μ M，調(diào)節(jié)pH值為9.5~11.5 ;接著向所得溶液中持續(xù)通入空氣，控制反應(yīng)體系的溫度(TC~20°C，反應(yīng)2~40小時(shí)，獲得甘精胰島素復(fù)性液。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的甘精胰島素前體的復(fù)性方法，其特征在于: 步驟(1)中所述的溶液I中的甘精胰島素前體的濃度為17~28g/L ； 步驟(1)中所述的變性劑為尿素或鹽酸胍； 步驟(1)中所述的還原劑為DTT和半胱氨酸鹽酸鹽中的一種或兩種； 步驟(2)中所述的溶液II中變性后的甘精胰島素前體的終濃度為1.0~1.4g/L ； 所述稀釋緩沖液為10~50mM、pH9.5~11.5的Tris-HCl緩沖液或10~50mM、pH9.5~.11.5的甘氨酸緩沖液； 所述的聚乙二醇為PEG4000 ； 步驟(2)中所述的金屬離子為Cu2+，濃度為5~20μ M ; 步驟(2)中所述的通入空氣為將空氣按每升溶液中以2~100cm3/H的速率向溶液中通 A ； 步驟(2)中所述的反應(yīng)體系的反應(yīng)溫度為4~15°C ； 步驟(2)中所述的反應(yīng)體系的反應(yīng)時(shí)間為12~25小時(shí)。
【文檔編號(hào)】C07K1/14GK103694339SQ201310754124
【公開(kāi)日】2014年4月2日 申請(qǐng)日期:2013年12月31日 優(yōu)先權(quán)日:2013年12月4日
【發(fā)明者】黃曉泉, 肖擁軍, 曹春來(lái), 張偉 申請(qǐng)人:珠海聯(lián)邦制藥股份有限公司