專利名稱：重組人胰島素復(fù)合物、其制備方法及包含該復(fù)合物的藥物組合物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及包含一種重組人胰島素復(fù)合物。更具體而言，本發(fā)明涉及一種包含重組人胰島素、磷脂及硫酸魚(yú)精蛋白的復(fù)合物。本發(fā)明還涉及該復(fù)合物的制備方法以及包含所述復(fù)合物的藥物組合物。
胰島素注射液為治療糖尿病的首選藥物，傳統(tǒng)的給藥途徑是皮下注射，由于吸收較慢，經(jīng)常導(dǎo)致糖尿病病人的飯前高血糖以及飯后低血糖，引起患者加餐，同樣每天的的連續(xù)注射也改變了糖尿病患者的生活。長(zhǎng)期注射還會(huì)產(chǎn)生一些問(wèn)題，如抗原抗體反應(yīng)、胰島素抗原性等。因此，尋找胰島素注射給藥的替代途徑已引起國(guó)內(nèi)外研究者的注意，胰島素口服、鼻腔、眼睛、舌下、植入及直腸系統(tǒng)等的給藥都已研究過(guò)，在眾多胰島素的非注射給藥途徑的研究中，口服制劑被認(rèn)為是最方便、最易被接受的。
自1965年發(fā)現(xiàn)脂質(zhì)體作為新的藥物載體后，已有人證明含有胰島素的脂質(zhì)體口服后可引起正常小鼠低血糖性休克。Dapergolas等1976年將脂質(zhì)體胰島素給糖尿病大鼠口服5U或12U，3小時(shí)后使血糖下降30-60％(Gerry Dapergolas等，Hypoglycaemic Effect ofLiposome-Entrapped Insulin Administered Intragastrically into Rats，TheLancet，第824-827頁(yè)，1976年10月16日；以及Gerry Dapergolas等，Penetration of Target Areas in the Rat by Liposome-AssociatedBleomycin，Glucose Oxidase and Insulin，F(xiàn)EBS LETTERS，第63卷第2號(hào)，第235-238頁(yè)1976)。他們發(fā)現(xiàn)流動(dòng)性小的脂質(zhì)體比流動(dòng)性大的脂質(zhì)體更有效。對(duì)人類自愿者的研究結(jié)果表明，80U-90U/人使血糖下降并伴隨胰島素免疫活性增加(Gerry Dapergolas等，TheEffect of Liposomal Lipid Composition on the Fate and Effect ofLiposome-Entrapped Insulin and Tubocurarine，Biochemical SocietyTransactions，第5卷，1383-1386頁(yè))。
在以后的很多年中，很多人都在試圖重復(fù)他們結(jié)果。Moufti報(bào)告(Oral Ingestion of Insulin LiposomesEffects of the AdministrationRoute，Life Sciences，第28卷，2747-2752頁(yè)，1981)，正常大鼠口服胰島素脂質(zhì)體，1小時(shí)血糖下降37％，2.5小時(shí)血糖下降44％。K.H.Tray等報(bào)告(Zur peroralen Verabreichung von Insulin mittelsLiposomen im Tierversuch，Wiener Klinische Wochenschrft，1979年6月)，口服10單位/千克體重胰島素脂質(zhì)體大鼠血糖值下降67％。Stetanov等(1980)使用(PC/CN)脂質(zhì)體口服后，可使糖尿病大鼠血糖明顯下降，3小時(shí)內(nèi)達(dá)到最大降糖作用。Patel等(1982)使用更不具流動(dòng)性的脂質(zhì)體(DSPC/CN/DCP，10∶2∶1)，以導(dǎo)管導(dǎo)入糖尿病狗十二指腸，出現(xiàn)暫短的血糖下降。
但是，口服胰島素脂質(zhì)體也存在著一些問(wèn)題，例如，脂質(zhì)體的組成和大小、在消化道中的穩(wěn)定性以及吸附速度等，都可能影響胰島素生物利用度(Gregory Gregoriadis，Engineering Liposomes for DrugDeliveryProgress and Problems，TIEBTECH，第13卷，527-537頁(yè)，1995年)。一般的胰島素注射劑直接口服吸收只有1％，其余均被胃腸道酶破壞，而不能發(fā)揮藥效作用。通過(guò)將胰島素同磷脂形成復(fù)合物后，成功的解決了這一課題，產(chǎn)品的生物利用度超過(guò)10％。
根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)方面，所提供的重組人胰島素復(fù)合物包括重組人胰島素、天然大豆磷脂以及硫酸魚(yú)精蛋白，其中重組人胰島素、天然大豆磷脂與硫酸魚(yú)精蛋白的重量比為1∶60-100∶1-5。
根據(jù)本發(fā)明的另一個(gè)方面，其提供制備重組人胰島素復(fù)合物的方法，該方法包括以下步驟A、原料液的制備(1)重組人胰島素水溶液將注射用水添加至重組人胰島素中，緩慢滴加鹽酸，使pH為3-5，然后攪拌溶解；(2)硫酸魚(yú)精蛋白水溶液將注射用水添加至硫酸魚(yú)精蛋白中使其溶解；(3)磷脂混懸液在天然大豆磷脂中添加注射用水，充分?jǐn)嚢?，使其呈均勻粘稠的白色乳狀液體，并控制pH為5-7之間，其中重組人胰島素、天然大豆磷脂與硫酸魚(yú)精蛋白的重量比為1∶60-100∶1-5；B、在不超過(guò)37℃的溫度下對(duì)上述制得的磷脂混懸液進(jìn)行多次超聲、間隔連續(xù)超聲處理，使白色乳狀液體轉(zhuǎn)變?yōu)榘胪该饕后w；C、在快速攪拌條件下將重組人胰島素水溶液和硫酸魚(yú)精蛋白水溶液添加到磷脂半透明溶液中，充分?jǐn)嚢?，然后靜置至變?yōu)榘咨闋钜后w，并冷卻至室溫，接著按照凍干曲線操作，經(jīng)反復(fù)凍融形成重組人胰島素復(fù)合物球狀顆粒，再加溫形成穩(wěn)定復(fù)合物。
根據(jù)本發(fā)明的再一個(gè)方面，其提供一種包含所述復(fù)合物以及藥物學(xué)上可接受的載體的藥物組合物。
根據(jù)Lipoplexes的思路和胰島素在脂質(zhì)體膜上的復(fù)合技術(shù)，我們?cè)O(shè)計(jì)了全新的胰島素-魚(yú)精蛋白-磷脂復(fù)合物，產(chǎn)生了意想不到的效果。雖然不想囿于任何理論的限制，但我們認(rèn)為在該胰島素-魚(yú)精蛋白-磷脂復(fù)合物中，胰島素結(jié)合在磷脂的極性部位上，而魚(yú)精蛋白因帶有大量正電荷，與帶有負(fù)電荷的胰島素和磷脂分子具有多價(jià)靜電結(jié)合的性質(zhì)，由此起到固定作用，使三者更易形成穩(wěn)定的復(fù)合物。
因此，本發(fā)明的重組人胰島素復(fù)合物包含重組人胰島素、天然大豆磷脂以及硫酸魚(yú)精蛋白，它們的重量比為1∶60-100∶1-5。
本發(fā)明的復(fù)合物具有下述優(yōu)越性(1)與包裹藥物脂質(zhì)體比較，藥物形成復(fù)合物后，增加了胰島素在胃腸道內(nèi)的穩(wěn)定性，免受胃腸道蛋白酶的破壞；(2)產(chǎn)品易被胃腸道吸收；(3)能夠?qū)⒁葝u素復(fù)合物制備成凍干粉，有利于口服固體制劑生產(chǎn)；(4)增加貯存穩(wěn)定性。
脂質(zhì)體和本發(fā)明的復(fù)合物區(qū)別在于前者將溶于介質(zhì)中的藥物包裹在膜層之間；后者將藥物固定在磷脂極性部分形成了一個(gè)整體，多個(gè)磷脂復(fù)合物分子形成不同于脂質(zhì)體的球狀體，更增加了重組人胰島素的穩(wěn)定性。
本發(fā)明的藥物組合物包括所述胰島素復(fù)合物以及藥物學(xué)上可接受的賦形劑。所述賦形劑包括但不限于甘露糖醇、微晶纖維素、二氧化硅、聚乙烯吡咯烷酮(PVP)。
以下將通過(guò)實(shí)施例以及動(dòng)物試驗(yàn)更為詳細(xì)地說(shuō)明本發(fā)明。實(shí)施例1重組人胰島素復(fù)合物的制備稱取重組人胰島素760mg(白色粉末，純度為99％，提供單位通化東寶藥業(yè))，加注射用水15ml振蕩呈混懸液。緩慢逐滴加入0.1mol/L鹽酸，邊加邊在磁力攪拌器上攪拌，直至混懸液完全溶解。測(cè)定pH值應(yīng)在4左右。
稱取硫酸魚(yú)精蛋白2.28g(白色粉末，提供單位北京化學(xué)試劑公司，含量99％)，加注射用水45ml使之完全溶解。
稱取藥用大豆磷脂60.8g(淡黃色粘稠膏狀物，經(jīng)工藝制備為半透明液體，提供單位上海油脂一廠)，含量98％，加1000ml注射用水，在搗碎容器內(nèi)高速充分?jǐn)嚢?，使磷脂在水溶液中充分混懸，得到均勻的粘稠乳白色液體，測(cè)定pH值應(yīng)為5-7。
取磷脂混懸液，置超聲波破碎儀中，以高能量超聲15分鐘，間隔10分鐘，連續(xù)超聲2次，溶液溫度維持在37℃以下，至白色乳狀液轉(zhuǎn)變?yōu)榫鶆虬胪该鞯S色液體。
在快速攪拌條件下，將重組人胰島素水溶液和魚(yú)精蛋白水溶液逐漸加入到磷脂半透明溶液中，充分?jǐn)嚢?0分鐘后，靜止60分鐘。半透明溶液再次變成白色乳狀液，表明魚(yú)精蛋白、磷脂、重組人胰島素結(jié)合成復(fù)合物。靜止1小時(shí)后倒入不銹鋼盤(pán)內(nèi)，液體溫度大約20℃。放入凍干機(jī)內(nèi)，快速降溫，1-2℃/分鐘，40分鐘后降到-40℃以下，維持1小時(shí)后，再升溫，升溫速度為1-2℃/分鐘，升到37℃，持續(xù)10分鐘后，再次快速降溫。這個(gè)程序反復(fù)5次。經(jīng)反復(fù)凍融，使重組人胰島素磷脂復(fù)合物形成類似脂質(zhì)體的球狀顆粒，再經(jīng)3℃保溫30分鐘后，重組人胰島素、魚(yú)精蛋白和磷脂形成穩(wěn)定的復(fù)合物。經(jīng)光鏡、電鏡、激光散射儀檢測(cè)符合質(zhì)檢標(biāo)準(zhǔn)。實(shí)施例2重組人胰島素凍干粉的制備取實(shí)施例1中制得的重組人胰島素磷脂復(fù)合物60g溶解于1000ml水中形成溶液，然后在攪拌條件下向該溶液中加入甘露醇136g(白色粉末，純度為99％，分析純，提供單位太原制藥廠)逐漸分散溶解。裝入盤(pán)內(nèi)凍干。凍干過(guò)程30分鐘降溫至-40℃冰凍后逐漸升溫，第4.5小時(shí)升至-20℃，維持-20℃至第12.5小時(shí)后第二次升溫，第17.5小時(shí)升至20℃，維持至第20小時(shí)得淡黃色粉末。經(jīng)光鏡、電鏡、激光散射儀檢測(cè)符合質(zhì)檢標(biāo)準(zhǔn)。實(shí)施例3重組人胰島素膠囊制備取根據(jù)實(shí)施例2制得的重組人胰島素凍干粉190g、微晶纖維素152g(白色粉末，純度98％，提供單位北京化學(xué)試劑公司)、二氧化硅38g(白色粉末，純度98％，提供單位北京化學(xué)試劑公司)、以及適量的10％PVP(白色粉末，純度98％，提供單位北京化學(xué)試劑公司)。將原料藥與填充輔料過(guò)40目篩充分混合，逐滴加入適量10％PVP，經(jīng)充分?jǐn)嚢柚瞥绍洸?，過(guò)30目的篩網(wǎng)，得到均勻的顆粒粉。然后在真空干燥條件下干燥，20目篩整粒。裝0號(hào)膠囊即得。實(shí)施例4取大豆磷脂1000mg，加入注射用水20ml，充分振蕩使磷脂在水溶液中形成均勻乳狀懸浮液，用低能量超聲5次，每次30秒，間隔30分鐘，控制穩(wěn)定在30℃以下，得到幾乎完全透明的淡黃色微乳液。取重組入胰島素100mg，加入水8ml，然后緩慢加入0.1N鹽酸使其溶解。
按照以下表1中的量和比例混合上述兩種溶液，充分振蕩混勻后，在液氮中速凍，5分鐘后取出融化。如此反復(fù)凍融5次后，得到胰島素與磷脂的復(fù)合物，并用凝膠電泳法測(cè)定胰島素游離率(結(jié)合率)。所得結(jié)果如表1所示。
表1不同磷脂/重組人胰島素比例對(duì)結(jié)合率的影響

*兩次測(cè)量的平均值根據(jù)實(shí)施例1中所述的方法按照以下表2中所示的量制備不同比例的重組人胰島素、硫酸魚(yú)精蛋白和磷脂的復(fù)合物。然后用凝膠電泳法測(cè)定胰島素游離率(結(jié)合率)，所得結(jié)果如表2所示。
表2

由表1和表的結(jié)果對(duì)比可以看出，在磷脂與重組人胰島素的復(fù)合物中添加硫酸魚(yú)精蛋白使胰島素的結(jié)合率顯著提高。藥效學(xué)試驗(yàn)受試藥物實(shí)施例2中制得的重組人胰島素凍干粉(以下稱為Ins-O)，每克Ins-O含胰島素量為2.5mg(即2.5mg/g)，每毫克胰島素相當(dāng)于26單位(即26u/mg)根據(jù)所需劑量用蒸餾水配制成不同濃度給藥，給藥體積小鼠0.1ml/10g體重，大鼠1ml/100g體重，家兔5ml/kg體重，犬用熟牛肉夾試藥吞藥。已知陽(yáng)性對(duì)照藥選用市售常規(guī)胰島素(以下稱為R-Ins)，由通化東寶生產(chǎn)，批號(hào)為T(mén)N006R01(40u/ml)；中效胰島素優(yōu)泌林(以下稱為N-Ins)，Lilly法國(guó)S.A.產(chǎn)品，批號(hào)為FF9F62C(40u/ml)，進(jìn)口藥品注冊(cè)證號(hào)X960514；給小鼠和大鼠皮下注射時(shí)，要據(jù)所需劑量用生理鹽水稀釋成不同濃度，家兔及比格犬用微量注射器或0.25ml注射器直接吸取皮下注射。動(dòng)物雄性自發(fā)性型糖尿病NOD小鼠，Wistar雄性大鼠均購(gòu)自中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院試驗(yàn)動(dòng)物研究所繁育場(chǎng)；新西蘭白兔(雌雄兼用)，體重2.5～3.2kg，購(gòu)自中國(guó)藥品生物制品檢定所實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心；比格犬購(gòu)自中國(guó)人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院試驗(yàn)動(dòng)物中心。
試驗(yàn)時(shí)，小鼠或大鼠每組10只，家兔每組為6～7只，比格犬為8條(交叉使用)。試驗(yàn)數(shù)據(jù)處理用計(jì)算機(jī)Microsoft Excell程序進(jìn)行血糖變化率、血糖曲線下面積(AUC)計(jì)算，根據(jù)T-test進(jìn)行顯著性檢驗(yàn)?？诜亟M人胰島素降血糖的藥效相對(duì)利用度(D)，參考文獻(xiàn)方法，根據(jù)藥時(shí)曲線血糖下降面積(即曲線上面積，AAC)用下列公式進(jìn)行計(jì)算。D%=AACp.oAACs.c.×Doses.c.Dosep.o×100%]]>一、Ins-O對(duì)自發(fā)性1型糖尿病NOD小鼠血糖的降低作用自發(fā)性1型糖尿病NOD小鼠隨機(jī)分為5組，每組10只，禁食2小時(shí)后，一組以空白輔料灌胃作為對(duì)照組，一組皮下注射R-Ins(0.5u/kg)作為陽(yáng)性對(duì)照藥組，其余三組分別以6.0、3.0、1.5u/kg劑量的Ins-O灌胃。給藥后動(dòng)物繼續(xù)禁食，自由飲水(以下同)，分別于給藥前(0min)及給藥后40min(對(duì)照組、陽(yáng)性對(duì)照藥組；參考我國(guó)藥典R-Ins效價(jià)測(cè)定血糖法的采血時(shí)間，以下同)、120min采血，用葡萄糖氧化酶法測(cè)定血糖值(以下同)，所得的結(jié)果見(jiàn)下表3。
表3、口服重組人胰島素對(duì)自發(fā)性1型糖尿病NOD小鼠血糖的影響(Mean±sd，n＝10)

與對(duì)照比較，*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001；自身比較，△P＜0.05，△△P＜0.01，△△△P＜0.001；以0min血糖為100％，↓為血糖下降，↑為血糖上升。
以上表3的結(jié)果表明，對(duì)照組動(dòng)物在40、120min血糖相對(duì)于0min血糖有所上升，陽(yáng)性對(duì)照藥R-Ins組血糖分別下降47.9％(P＜0.001)和39.7％(p＜0.01)，不同劑量的Ins-O組，在給藥后120min，能使自發(fā)性遺傳性1型糖尿病NOD小鼠血糖明顯下降42.4％、33.5％、31％(P＜0.001或p＜0.01)。二、Ins-O對(duì)自發(fā)性1型糖尿病NOD小鼠葡萄糖耐量的改善作用4組自發(fā)性1型糖尿病NOD小鼠(10只/組)，禁食2小時(shí)各組取0min血后，第一組以輔料空白灌胃作為對(duì)照組，第二、三組分別以3.0u/kg、1.5u/kg劑量的Ins-O灌胃，100min時(shí)，第四組皮下注射R-Ins(0.5u/kg)作為陽(yáng)性對(duì)照藥組，120min時(shí)，所有動(dòng)物灌胃葡萄糖(2.0g/kg)溶液。分別于給葡萄糖負(fù)荷后30min、60min、120min取血，測(cè)定血糖值。所得結(jié)果如表4所示。
表4、口服重組人胰島素對(duì)自發(fā)性1型糖尿病NOD小鼠葡萄糖耐量的影響(Mean±sd，n＝10)

與對(duì)照比較，*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001；以0min血糖為100％，↓為血糖下降，↑為血糖上升。
由表4的結(jié)果可以看出，對(duì)照組動(dòng)物葡萄糖負(fù)荷后血糖明顯升高；陽(yáng)性對(duì)照組R-Ins(0.5u/kg)血糖明顯下降，葡萄糖負(fù)荷后各時(shí)間點(diǎn)血糖分別下降33.9％、40.1％和26.8％(P＜0.001)；兩給藥組(Ins-O 3.0u/kg、1.5u/kg)葡萄糖負(fù)荷后各時(shí)間點(diǎn)血糖也明顯下降，下降率分別為5.4％及8.7％、10.4％及17.1％、29.2％及26、8％(P＜0.01)，尤以120min作用明顯。三、Ins-O對(duì)正常大鼠降血糖作用的量效關(guān)系正常Wistar雄性大鼠50只，隨機(jī)均分為5組，禁食2小時(shí)取0min血后，一組灌胃等體積水作為對(duì)照組，一組陽(yáng)性對(duì)照藥組(R-Ins，0.5u/kg，S.C)，其余三組分別以不同劑量的Ins-O(4.5、3.0、1.5u/kg)灌胃，于給藥后40min、180min、240min取血測(cè)定血糖含量，結(jié)果如表5所示。
表5、口服重組人胰島素對(duì)正常小鼠血糖的影響(Mean±sd，n＝10)

與對(duì)照比較，*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001；以0min血糖為100％，↓為血糖下降，↑為血糖上升。
表5的結(jié)果顯示，陽(yáng)性對(duì)照藥R-Ins組血糖在給藥后40min明顯降低，下降幅度為0min血糖的37％(P＜0.001)，但在180min、240min，血糖恢復(fù)正常，這體現(xiàn)了常規(guī)胰島素R-Ins起效快、作用持續(xù)時(shí)間短的特點(diǎn)；三個(gè)不同劑量的Ins-O組在180min、240min血糖均顯著下降，尤以240min作用明顯，血糖下降幅度分別為45.4％、36.5％、19.2％(P＜0.001)，用回歸分析法得出該時(shí)間點(diǎn)(240min)血糖下降百分率與給藥劑量相關(guān)的回歸方程Y＝8.8533x+92.92(R2＝0.0867)。這說(shuō)明Ins-O在1.5u/kg～4.5u/kg劑量范圍內(nèi)，對(duì)正常大鼠的降血糖作用呈明顯的量效關(guān)系。四、Ins-O對(duì)正常大鼠降血精作用的時(shí)效曲線40只正常雄性Wistar大鼠，隨機(jī)均分為4組，禁食2小時(shí)后取0min血，對(duì)照組以等體積水灌胃，陽(yáng)性對(duì)照藥組皮下注射R-Ins 0.5u/kg，兩組以不同劑量的Ins-O(1.5u/kg、3.0u/kg)灌胃，于給藥后間隔一定時(shí)間(30min、60min、120min、240min、360min和480min)采血測(cè)定血糖，觀察血糖變化，結(jié)果如下表6所示。并根據(jù)血糖曲線下面積的變化，計(jì)算出Ins-O不同時(shí)間的相對(duì)藥效利用度，結(jié)果如下表7所示。
表6、Ins-對(duì)正常大鼠降血糖作用的時(shí)效變化(％)血糖變化(％)時(shí)間 R-Ins 0.5u/kg Ins-O 1.5u/kg Ins-O 3.0u/kg對(duì)照(min.)(s.c.) (p.o.) (p.o.)0 100100 10010030 113.0±8.9 66.0±8.8***93.6±6.6***72.8±9.4***60 84.3±6.4 50.3±16.7***65.0±6.6***45.2±6.5***12064.4±8.6 61.9±14.1 45.7±5.6***27.8±9.3***18071.5±5.4 64.4±5.4*48.1±7.6***33.8±17.2***24076.3±8.1 77.2±7.9 54.0±11.7***39.7±12.2***36071.7±5.3 71.8±8.7 49.5±6.7***39.6±6.5***48075.5±5.7 69.6±11.2 60.2±7.3***53.6±8.8***與對(duì)照相比，*P＜0.05，***P＜0.001；n＝10。表7、口服重組人胰島素對(duì)正常大鼠血糖降低的時(shí)效曲線下面積、曲線上面積及相對(duì)藥效利用度(AUC，AAC，D)

AAC(曲線上面積)＝對(duì)照組AUC-給藥組AUC以上表6和7的結(jié)果顯示，陽(yáng)性對(duì)照藥R-Ins(s.c.)組血糖的谷值在注射后30min，下降幅度為41.4％，120min基本恢復(fù)至正常水平；口服重組人胰島素Ins-O(p.o.)不同劑量組均在口服后30min開(kāi)始起效，120min或240min為降血糖作用最強(qiáng)點(diǎn)，下降幅度分別為57.2％和32.8％，480min血糖逐步恢復(fù)，表現(xiàn)出了中效胰島素的作用特點(diǎn)。藥效相對(duì)利用度在口服后0～4小時(shí)為37.5％或39.6％，0～8小時(shí)高達(dá)56.7％或65.9％。五、Ins-O對(duì)正常家兔降血糖作用的時(shí)效曲線及藥效相對(duì)利用度三組新西蘭兔，禁食過(guò)夜，取0小時(shí)血后，對(duì)照組用4號(hào)導(dǎo)尿管以水灌胃(n＝6)，陽(yáng)性對(duì)照藥組用微量注射器直接吸取中效胰島素優(yōu)泌林(N-Ins，0.5u/kg，n＝7)皮下注射同時(shí)以水灌胃，口服重組人胰島素組(Ins-O)以1u/kg劑量灌胃(n＝7)。于給藥1、2、3、4、6、8、10、12、20、28、38小時(shí)從耳緣靜脈采血測(cè)定血糖水平，給藥后動(dòng)物繼續(xù)禁食直至試驗(yàn)結(jié)束，但前12小時(shí)同時(shí)禁水，以后自由飲水。結(jié)果如下表8所示。
表8、Ins-O對(duì)正常家兔降血糖作用時(shí)效變化(％)時(shí)間 血糖變化(％)(小時(shí)) 對(duì)照N-Ins 0.5u/kg，s.c. Ins-O 1.0u/kg，p.o0100 100 1001109.0±5.3 64.1±6.8***84.4±8.2***2102.0±6.3 53.9±7.8***73.0±8.9***3101.5±4.8 63.9±13.5***67.5±10.8***4102.1±7.7 78.8±17.7*65.7±7.1***6100.5±9.1 89.6±9.4 59.9±7.0***897.1±7.0 91.4±8.8 58.0±8.0***10 100.3±6.2 93.3±8.7 55.6±8.1***12 102.0±9.2 97.4±8.5 52.4±8.9***20 103.2±9.0 98.5±11.060.8±9.6***28 106.6±10.1 103.0±6.562.3±19.0***38 102.7±17.8 95.5±8.8 74.1±16.5*與對(duì)照相比，*P＜0.05，***P＜0.001
由以上表8的結(jié)果可以看出，陽(yáng)性對(duì)照藥組血糖在2小時(shí)降至最低，下降幅度為472％，8小時(shí)基本恢復(fù)至正常；Ins-O組血糖在1小時(shí)已開(kāi)始下降，12小時(shí)降至最低點(diǎn)，下降幅度為48.6％，28小時(shí)血糖繼續(xù)維持在較低水平，38小時(shí)有所回升。另外，計(jì)算Ins-O組在不同時(shí)間點(diǎn)的降血糖相對(duì)藥效利用度，其結(jié)果見(jiàn)下表9。表9、口服重組人胰島素對(duì)家兔血糖降低的時(shí)效曲線下面積、曲線上面積及相對(duì)藥效利用度(AUC，AAC，D)

AAC(曲線下面積)＝對(duì)照組AUC-給藥物AUC六、Ins-O對(duì)比格犬的降血糖作用8條比格犬試驗(yàn)前禁食過(guò)夜，對(duì)照組口服熟牛肉夾輔料，陽(yáng)性對(duì)照藥組皮下注射中效胰島素優(yōu)泌林(N-Ins，0.5u/kg)，同時(shí)喂與其它組相等量的熟牛肉，Ins-O組口服熟牛肉夾Ins-O(3.0u/kg)，每次試驗(yàn)均有對(duì)照組、陽(yáng)性對(duì)照藥組、口服重組人胰島素組，共進(jìn)行3次交叉試驗(yàn)，每次間隔一周。于給藥后0、20、40、60、90、120、180、240、360、480min靜脈采血測(cè)定血糖，結(jié)果如下表10所示。
表10、Ins-O對(duì)比格犬降血糖作用的時(shí)效變化(％)血糖變化(％)時(shí)間N-Ins 0.5u/kg， Ins-O 3.0u/kg，(min.)對(duì)照s.c. p.o.0 100 100 1002098.5±12.0809±14.8*102.8±4.740102.7±8.762.5±12.4***83.3±13.5*60103.6±7.055.7±8.7***61.3±12.4***90100.8±7.848.8±8.0***53.7±5.4***120 99.7±7.0 48.3±8.6***54.3±7.7***180 95.2±10.249.5±8.6***55.6±10.3***240 98.8±9.8 51.7±10.2***60.9±7.0***360 93.8±7.5 63.9±15.8***56.7±8.2***480 93.4±7.8 103.2±16.4 64.6±11.5***與對(duì)照相比，*P＜0.05，***P＜0.001從以上表10的結(jié)果可以看出，陽(yáng)性對(duì)照藥組血糖在給藥后20min已開(kāi)始下降，90min降至最低，下降幅度為51.6％，480min恢復(fù)至正常；Ins-O組血糖在40min開(kāi)始下降，90min降至最低點(diǎn)，下降幅度為46.7％，480min血糖逐步回升。另外計(jì)算出Ins-0降血糖相對(duì)藥效利用度，結(jié)果見(jiàn)下表11。)為13.4％(0～4)和17.3％(0～8小時(shí))。表11、口服重組人胰島素對(duì)比格犬血糖降低的時(shí)效曲線下面積、曲線上面積及相對(duì)藥效利用度(AUC，AAC，D)

AAC(曲線下面積)＝對(duì)照組AUC-給藥組AUC實(shí)驗(yàn)小結(jié)及討論實(shí)驗(yàn)選用4種動(dòng)物模型(1型糖尿病NOD小鼠、正常大鼠、家兔及比格犬)，口服不同劑量的口服重組人胰島素(Ins-0)后，均有明顯的降血糖作用，使自發(fā)性1型NOD小鼠的葡萄糖耐量明顯改善。正常大鼠口服Ins-O(4.5、3.0、1.5u/kg)后，在180及240min時(shí)，血糖均顯著下降；240min時(shí)血糖下降幅度分別為45.4％、36.5％及19.2％。用回歸分析法證明Ins-O在1.5～4.5u/kg劑量范圍內(nèi)，降血糖作用呈明顯的量效關(guān)系。
正常大鼠、家兔及比格犬口服Ins-O后0.5～1小時(shí)起效，但血糖降至谷值及降血糖持續(xù)時(shí)間在不同種屬動(dòng)物間不相一致。大鼠及比格犬血糖下降達(dá)谷值時(shí)間分別為2小時(shí)及1.5小時(shí)，降血糖持續(xù)至8小時(shí)后開(kāi)始恢復(fù)，二者結(jié)果比較接近，但家兔血糖達(dá)谷值時(shí)間為12小時(shí)，降血糖作用延續(xù)至38小時(shí)后開(kāi)始恢復(fù)。
權(quán)利要求
1.一種重組人胰島素復(fù)合物，其包括重組人胰島素、天然大豆磷脂以及硫酸魚(yú)精蛋白，其中重組人胰島素、天然大豆磷脂與硫酸魚(yú)精蛋白的重量比為1∶60-100∶1-5。
2.如權(quán)利要求1所述的重組人胰島素復(fù)合物，其為凍干粉末的形式。
3.制備重組人胰島素復(fù)合物的方法，該方法包括以下步驟A、原料液的制備(1)重組人胰島素水溶液將注射用水添加至重組人胰島素中，緩慢滴加鹽酸，使pH為3-5，然后攪拌溶解；(2)硫酸魚(yú)精蛋白水溶液將注射用水添加至硫酸魚(yú)精蛋白中使其溶解；(3)磷脂混懸液在天然大豆磷脂中添加注射用水，充分?jǐn)嚢?，使其呈均勻粘稠的白色乳狀液體，并控制pH為5-7之間，其中重組人胰島素、天然大豆磷脂與硫酸魚(yú)精蛋白的重量比為1∶60-100∶1-5；B、在不超過(guò)37℃的溫度下對(duì)上述制得的磷脂混懸液進(jìn)行多次超聲、間隔連續(xù)超聲處理，使白色乳狀液體轉(zhuǎn)變?yōu)榘胪该饕后w；C、在快速攪拌條件下將重組人胰島素水溶液和硫酸魚(yú)精蛋白水溶液添加到磷脂半透明溶液中，充分?jǐn)嚢瑁缓箪o置至變?yōu)榘咨闋钜后w，并冷卻至室溫，接著按照凍干曲線操作，經(jīng)反復(fù)凍融形成重組人胰島素復(fù)合物球狀顆粒，再加溫形成穩(wěn)定復(fù)合物。
4.一種包含胰島素復(fù)合物以及藥物學(xué)上可接受的載體的藥物組合物，其中所述胰島素復(fù)合物包括重量比為1∶60-100∶1-5的重組人胰島素、天然大豆磷脂以及硫酸魚(yú)精蛋白。
5.如權(quán)利要求4所述的藥物組合物，其中，所述賦形劑為甘露糖、微晶纖維素、二氧化硅、PVP。
全文摘要
本發(fā)明涉及包含一種重組人胰島素復(fù)合物，其包含重組人胰島素、磷脂及硫酸魚(yú)精蛋白，它們的重量比為1∶60－100∶1－5。本發(fā)明還涉及該復(fù)合物的制備方法以及包含所述復(fù)合物的藥物組合物。本發(fā)明的復(fù)合物增加了胰島素在胃腸道的穩(wěn)定性，避免或減少低pH值、胃蛋白酶的破壞，并且能夠確定恒定量效關(guān)系，質(zhì)量可控，而且最終可制成凍干粉和口服膠囊。
文檔編號(hào)A61K38/28GK1421246SQ0114004
公開(kāi)日2003年6月4日 申請(qǐng)日期2001年11月22日 優(yōu)先權(quán)日2001年11月22日
發(fā)明者沃維漢 申請(qǐng)人:北京沃華生物科技股份有限公司