酵母重組表達(dá)門冬胰島素的制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于生物技術(shù)下重組蛋白的制備領(lǐng)域。本發(fā)明公開了由酵母重組表達(dá)門冬 胰島素的制備方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 糖尿病是胰島素分泌缺陷或胰島素抵抗導(dǎo)致的以高血糖為特征的代謝紊亂病癥。 目前，中國已成為世界上糖尿病患者人數(shù)最多的國家。糖尿病已成為僅次于心腦血管疾病 和腫瘤的第三大危害性疾病。糖尿病患者常常伴有多種并發(fā)癥，容易導(dǎo)致腎臟、眼、心臟和 血管等眾多器官損害、功能性障礙和衰竭，危害性極大。
[0003] 由于飯后葡萄糖的峰值與注射胰島素的峰值到達(dá)時(shí)間的偏離，給胰島素注射液的 應(yīng)用帶來困難，從而推動了單體胰島素類似物的產(chǎn)生。上世紀(jì)末，人們開發(fā)出了速效胰島 素一重組門冬胰島素，是將人胰島素B鏈B28位脯氨酸（Pro)突變?yōu)樘扉T冬氨酸（Asp)。此 改變，破壞了兩個(gè)胰島素單體分子在形成二聚體時(shí)重要的范德華力，使其不易形成二聚體。 重組門冬胰島素制劑注射后，其藥代動力學(xué)接近人胰島素的生理分泌曲線。與常規(guī)人胰島 素相比，其藥代動力學(xué)特性是常規(guī)人胰島素的一半左右，起效時(shí)間為10~20分鐘，達(dá)到峰值 時(shí)間為40分鐘，作用持續(xù)時(shí)間:T5小時(shí)，既有效控制了血糖，也不會造成夜間嚴(yán)重的低血糖 事件。
[0004] 在中國專利CN98813941. 3中，公開了一種制備重組胰島素類似物的方法，該方法 在獲得正確構(gòu)象的胰島素原后，先用胰蛋白酶酶切，形成具有正確構(gòu)象的Arg(B31)-胰島 素，純化后再用羧肽酶B去除Arg(B31)-胰島素C端的Arg，形成正確構(gòu)象的胰島素，最后再 用HPLC純化。
[0005] 在中國專利CN103305581A中，公開了一種制備重組胰島素的方法，該方法中通過 用胰蛋白酶酶切，然后偶聯(lián)B30的蘇氨酸，最后得到普通胰島素。但其方法不適合門冬胰島 素的制備，因胰蛋白酶無法酶切B28-29為Asp-Lys的Lys的羧基端肽鍵。
[0006] 在中國專利CN102159588A中，公開了一種制備門冬胰島素的方法，該方法中通過 構(gòu)建含有B30蘇氨酸的門冬胰島素原，然后胰蛋白酶和羧肽酶B同時(shí)酶切門冬胰島素原的 方法，獲得門冬胰島素。該方法的得率低于70%，且酶用量偏高。
[0007] 在中國專利CN1589328A中，公開了一種制備門冬胰島素的方法，該方法中通過選 用無色桿菌蛋白酶I酶切，酶切完成后直接改變條件轉(zhuǎn)肽，偶聯(lián)蘇氨酸酯。
[0008] 本發(fā)明專利中公開了重組門冬胰島素的制備方法。該方法通過巴斯德畢赤酵母分 泌表達(dá)含有三對二硫鍵正確構(gòu)象的門冬胰島素原后，用賴氨酰內(nèi)肽酶高效單一酶切，得到 缺失B30位的門冬胰島素，然后在賴氨酰內(nèi)肽酶作用下偶聯(lián)叔丁醚蘇氨酸叔丁酯(蘇氨酸 酯);再脫去保護(hù)基團(tuán)，經(jīng)反相精純化和結(jié)晶，得到重組門冬胰島素。本發(fā)明工藝中，酶切、偶 聯(lián)效率高，且偶聯(lián)后相關(guān)物質(zhì)的反相色譜中行為差異顯著，易于精純化，更適合工業(yè)化制備 重組門冬胰島素。
[0009]

【發(fā)明內(nèi)容】

[0010] 本發(fā)明提供了重組門冬胰島素新的表達(dá)途徑，以及重組門冬胰島素原單一酶切和 偶聯(lián)方法，從而提高重組門冬胰島素的工藝水平和生產(chǎn)能力。
[0011] 本發(fā)明中，重組門冬胰島素制備工藝具體包括以下步驟： i) 通過酵母發(fā)酵獲得正確構(gòu)象的門冬胰島素原； ii) 金屬螯合層析和陽離子交換層析純化門冬胰島素原； iii) 選用賴氨酰內(nèi)肽酶酶切門冬胰島素原，獲得缺失B30位的門冬胰島素； iv〇>B30位偶聯(lián)蘇氨酸酯； V) 反相純化步驟辦樣品； VI)步驟V樣品的脫保護(hù)及反相精純化； 油.）結(jié)晶步驟遠(yuǎn)樣品。
[0012] 本發(fā)明中，步驟i)的重組門冬胰島素是通過畢赤酵母或釀酒酵母發(fā)酵獲得，優(yōu)選巴 斯德畢赤酵母。
[0013] 步驟ii)中，采用銅離子螯合層析和SP陽離子交換層析純化重組門冬胰島素原。螯 合層析用IOOmM咪唑洗脫，陽離子交換層析用I.OMNaCl洗脫。
[0014]步驟iii)中賴氨酰內(nèi)肽酶（LysylEndopeptidase，Lys-C),也被稱為賴氨酰肽鏈內(nèi) 切酶酶切重組門冬胰島素。該酶可以特異性切除賴氨酸殘基羧基端肽鍵，其最適活性PH為 9. (T9. 5。酶切緩沖可以為Tris-HCl緩沖液、磷酸鹽緩沖、硼酸鹽緩沖，優(yōu)選Tris-HCl緩沖 鹽；其離子強(qiáng)度為20~100禮，優(yōu)選30~60禮。賴氨酰內(nèi)肽酶與門冬胰島素原的質(zhì)量比介于 1:3000~30000,優(yōu)選1:5000~20000時(shí)酶切效率達(dá)95%左右。
[0015] 步驟SO中，酶切獲得的缺失B30門冬胰島素偶聯(lián)蘇氨酸酯。具體為反應(yīng)體系中蛋 白濃度為l(T30g/L，DMF/EtOH(V/V)體積分?jǐn)?shù)為40-70%，去離子水為10-30%，蛋白與叔丁 醚蘇氨酸叔丁酯(蘇氨酸酯）質(zhì)量之為l:3~20，pH為5. 5~8. 5,反應(yīng)溫度為20~37°C;蛋白濃 度優(yōu)選l(T20g/L，DMF/EtOH(V/V)為優(yōu)選50-60%，去離子水含量優(yōu)選15-20%，蛋白與叔丁 醚蘇氨酸叔丁酯(蘇氨酸酯)質(zhì)量之為l:5~15，pH優(yōu)選6.5~8.0,反應(yīng)溫度優(yōu)選25~30°C。此 步驟中B30位蘇氨酸偶聯(lián)率達(dá)到85~90%。
[0016]步驟W)反相純化步驟樣品。樣品偶聯(lián)完成后，補(bǔ)加2倍體積冷乙腈，在Waters SunfireC8反相色譜層析柱中，用含有0. 1~0. 2M硫酸銨的乙腈緩沖液梯度洗脫，目的蛋白產(chǎn) 物的純度達(dá)到98%。
[0017] 步驟訪，步驟V純化樣品脫保護(hù)。選取3(Tl00%TFA的二氯甲烷（DCM)，按蛋白含量 (mg)與DCM/TFA混合液體積（ml)比為10~50 :1補(bǔ)加DCM/TFA混合液，反應(yīng)溫度為10~25°C，反應(yīng)時(shí)間0. 5~1. 5小時(shí)。優(yōu)選5(Tl00%TFA的DCM，蛋白與TFA/DCM混合液之比優(yōu)選10~30:1， 反應(yīng)溫度優(yōu)選15~20°C，反應(yīng)時(shí)間優(yōu)選0. 5~1小時(shí)。反應(yīng)完全后，用去離子水稀釋30~40倍， 補(bǔ)加5%乙腈，在SP-120-5-C8-BI0 (Daisogel)的色譜柱中，按照步驟w的方法洗脫樣品。 精純化獲得重組門冬胰島素的純度達(dá)到99%。
[0018] 步驟沾）結(jié)晶，先將步驟政樣品真空低溫凍干，在10~30°C條件下，配置含20~200mM 檸檬酸三鈉、3. (TlO.Og/L重組門冬胰島素、體積分?jǐn)?shù)為10~30%的乙醇、0. 2~0. 5%的間甲 酚、0. 2~1.OM氯化鈉結(jié)晶液、并調(diào)節(jié)結(jié)晶液pH至6. (T6. 5、按鋅離子與門冬胰島素的摩爾比 為2~15:1補(bǔ)加鋅離子，結(jié)晶3~6小時(shí)，然后降溫至2~8°C靜置10~20小時(shí)，獲得門冬胰島素 結(jié)晶。
[0019] 本發(fā)明相對于現(xiàn)有技術(shù)具有如下的優(yōu)點(diǎn)： (1)賴氨酰內(nèi)肽酶單一酶切門冬胰島素原，酶切效率高和錯切率極低的優(yōu)點(diǎn)。
[0020] (2)B30位蘇氨酸酯的偶聯(lián)率高。
[0021] (3)反相粗純化和精純化的分離效果高且具有較高回收率。
[0022]
【附圖說明】
[0023] 圖1:重組人門冬胰島素原酶切前后反相色譜圖。其中，圖a是門冬胰島素原酶切 前的RP-HPLC分析圖；圖b為門冬胰島素原酶切后的RP-HPLC分析圖。
[0024] 圖2 :DesB30-門冬胰島素偶聯(lián)蘇氨酸酯的RP-HPLC檢測圖。
[0025] 圖3 :DesB30-門冬胰島素偶聯(lián)產(chǎn)物反相純化圖。
[0026] 圖4 :DesB30-門冬胰島素偶聯(lián)產(chǎn)物純化后RP-HPLC分析圖。
[0027] 圖5 :DesB30-門冬胰島素偶聯(lián)產(chǎn)物脫去保護(hù)基團(tuán)并反相純化后RP-HPLC分析圖。
[0028] 圖6:重組門冬胰島素結(jié)晶后在顯微鏡下64倍放大圖。
[0029] 圖7 :重組門冬胰島素的質(zhì)譜。
[0030] 具體實(shí)施方案
[0031]以下結(jié)合具體實(shí)施例來進(jìn)一步描述本發(fā)明。本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)和特點(diǎn)將隨著描述而更 為清楚。但這些實(shí)例僅是范例，不對發(fā)明的范圍構(gòu)成任何限制。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)該理解 的是，在不偏離本發(fā)明的精神和范圍下可以對本發(fā)明技術(shù)方案的細(xì)節(jié)和形式進(jìn)行修改或替 換，但這些修改或替換均落入落入本發(fā)明的保護(hù)范圍內(nèi)。
[0032] 實(shí)例1.重組門冬胰島素上游構(gòu)建與篩選 (1)以重組人門冬胰島素原氨基酸序列設(shè)計(jì)其cDNA序列，并在序列后面設(shè)計(jì)TGA和TAA兩個(gè)終止密碼子序列，在序列3 '端和5 '端分別設(shè)計(jì)XhoI(CTCGAG)和NtoI(GCGGCCGC) 限制性酶切位點(diǎn)。委托大連TAKARA工程有限公司進(jìn)行全基因合成。
[0033] (2)將上述全基因合成的Pro-AspcDNA插入PMD18-T-Pro-Asp質(zhì)粒。用限制性內(nèi) 切酶分別酶切PMD18-T-Pro-Asp和pPICZaA后回收兩個(gè)目的片段（Pro-Asp和pPICZaA 大片段)，經(jīng)T4鏈接并轉(zhuǎn)化到P.PastorisX-33宿主菌中，得到工程菌（pPICZaA-Pro-Asp/ X-33)〇
[0034] (3)通過篩選高效表達(dá)的工程菌，并優(yōu)化發(fā)酵工藝，獲得重組門冬胰島素原。
[0035]SEQIDNO:I(InsulinAspart氨基酸序列 1):

實(shí)例2.門冬胰島素制備 (1)純化獲得門冬胰島素原和酶切獲得缺失B30-門冬胰島素：巴斯德畢赤酵母發(fā)酵液 5L，離心，上清過銅離子螯合層析和SP陽離子交換層析獲得門冬胰島素原；然后補(bǔ)加20mM Zn離子沉淀門冬胰島素原，離心，沉淀用100mL50mMTris溶解，蛋白含量為lg，pH調(diào)到 8.8,按酶與蛋白質(zhì)量比為1:5000補(bǔ)加賴氨酰內(nèi)肽酶（Lys-C)O. 2mg，30°C攪拌酶切。16小 時(shí)后，取樣RP-HPLC分析，酶切效率達(dá)到90%，調(diào)pH5. 5等電點(diǎn)沉淀。
[0036] (2) desB30-門冬胰島素偶聯(lián)，得到門冬胰島素酯：取等電點(diǎn)沉淀desB30-門冬胰 島素離心，用5ml 10%冰醋酸溶解，蛋白濃度為80mg/ml，6ml，緩慢補(bǔ)加DMF/EtOH(V/V=l:l) 混合液18ml，補(bǔ)加叔丁醚蘇氨酸叔丁酯6ml (6g左右），pH調(diào)到8.0,按1:500補(bǔ)加Lys-C lmg，30 °C攪拌偶聯(lián)。
[0037] (3)門冬胰島素酯的純化及脫酯：偶聯(lián)反應(yīng)48小時(shí)后，取樣RP-HPLC分析，偶聯(lián)率 為85%。補(bǔ)加120ml冷乙腈沉淀門冬胰島素酯，用400ml 20%乙腈溶解沉淀，pH調(diào)到2. 5。 樣品用Waters Sunfire C8純化（A液：0. 2M硫酸銨，pH2. I ;B液：0.1 M硫酸銨，40%乙腈）回 收門冬胰島素酯。取純度95%以上樣品低溫真空凍干。取300mg門冬胰島素酯，補(bǔ)加15ml 含50%三氟乙酸（TFA)的二氯甲烷（DCM)，15°C反應(yīng)1小