專利名稱：一種新型重組葡激酶及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬生物技術(shù)領(lǐng)域。
天然葡激酶(Staphylokinase，Sak)是金黃色葡萄球菌溶原性噬菌體合成的一種蛋白水解酶，由136個(gè)氨基酸組成。Sak本身并不是酶，它在人血漿中與纖溶酶原(plasminogen，plg)形成1∶1復(fù)合物，該復(fù)合物被血塊表面痕量的纖溶酶(plasmin，plm)激活為Sak·plm，Sak·plm是高效的纖溶酶原激活劑，激活游離的plg形成plm，催化血栓主要基質(zhì)纖維蛋白降解，從而溶解血栓。由于Sak激活plg具有纖維蛋白專一性，而且對(duì)陳舊性血栓和富含血小板血栓的溶解作用比其他溶栓藥物更強(qiáng)，因此Sak是一種高效特異的溶栓劑(Collen D at al.Nature Medicine.4.279-284(1998))。目前，國內(nèi)外有數(shù)家公司生產(chǎn)重組葡激酶，但在基因結(jié)構(gòu)上有所不同。比利時(shí)Collen D.等研究的重組葡激酶已進(jìn)行急性心肌梗塞(AMI)溶栓治療的臨床II期試驗(yàn)，我國成都世新中心也完成了AMI溶栓治療的I期臨床試驗(yàn)，效果良好。上海醫(yī)科大學(xué)于1994年自行構(gòu)建了Sak基因，實(shí)現(xiàn)了在大腸桿菌中的高效表達(dá)，并完成了中試研究，已申報(bào)臨床試用，即將試用于治療急性腦梗塞。但是，Sak是異體蛋白，用于人體有較強(qiáng)的抗原性，雖然臨床試用中還未發(fā)現(xiàn)有嚴(yán)重過敏反應(yīng)，然而大部分病人用藥二周后，出現(xiàn)高滴度的中和抗體，阻礙了Sak的重復(fù)使用(Declerck PJ et al.ThrombHaemost.71.129-133(1994))。而且，在重組葡激酶的研究過程中發(fā)現(xiàn)，葡激酶易形成二聚體、甚至多聚體。聚合體的形成導(dǎo)致Sak免疫原性的增強(qiáng)。
在利用溶栓藥物進(jìn)行溶栓治療的同時(shí)，通常聯(lián)合應(yīng)用肝素、阿斯匹林等抗凝血酶、抗血小板藥物，以促進(jìn)溶栓，并防止再梗塞。近年來，溶栓輔助藥的研究引人注目。Arg-Gly-Asp(RGD)或Lys-Gly-Asp(KGD)序列是對(duì)抗血小板聚集的功能序列，可競爭結(jié)合血小板膜凝聚有關(guān)的糖蛋白膜受體IIb/IIIa，從而阻止纖維蛋白原與受體結(jié)合，阻斷血栓再形成(Frishman WH et al.Am Heart J.130.877-892.(1995)；Nichols AJ et al.Trends Pharmacol Sci.13.413-417.(1992))。在一定構(gòu)象限制下，將RGD/KGD序列導(dǎo)入溶栓藥物，如尿激酶cDNA基因的一定部位，其表達(dá)產(chǎn)物具有溶栓、防栓的雙重功能(Smith J et al.J Biol Chem.270.30486-30490.(1995))?；赗GD/KGD序列，還發(fā)展了許多化學(xué)模擬物，如Tirofiban，Lamifiban，Lefradafiban，Orbofiban，Xemilofiban，Integrilin等，亦可封閉IIb/IIIa受體，與溶栓藥物合用，再梗塞發(fā)生率顯著降低(Frishman WH et al.Am Heart J.130.877-892.(1995)；Verstraete M et al.49.856-884.(1995))。
本發(fā)明的目的是提供一種防止二聚體形成并具有防栓、溶栓雙重功能的新型葡激酶蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)及其制備方法。本發(fā)明應(yīng)用結(jié)構(gòu)生物學(xué)設(shè)計(jì)新型Sak分子結(jié)構(gòu)，并利用基因工程手段生產(chǎn)，所得產(chǎn)品除了具有高效、特異的溶栓功能外，尚具有低聚合性能和抗血小板聚集等新特性，并且制備過程簡便、安全，產(chǎn)品得率、純度、活性均與野生型Sak基本相同。
本發(fā)明采用下述技術(shù)方案(1)Sak是一橢球狀分子，從第21個(gè)氨基酸殘基起，分別由五條、兩條β折疊股構(gòu)成的β折疊片包裹在一個(gè)由12個(gè)殘基構(gòu)成的α螺旋上，而N端20個(gè)氨基酸伸向球體外，非常柔韌，其功能難以從晶體結(jié)構(gòu)推測。Sak呈明顯的親疏水性的不對(duì)稱性，且活性區(qū)主要在親水一側(cè)(Zhan CH etal.
Acta Crys t.D52.564-565.(1996)；Rabi jns A et al.Nat.
Struct.Biol.5.(1997))。根據(jù)上述r-Sak精確的三維結(jié)構(gòu)模型，通過計(jì)算機(jī)分子對(duì)接手段，預(yù)測了r-Sak二聚體可能的結(jié)合方式，建立二聚體的三維結(jié)構(gòu)模型。二聚體主要通過疏水相互作用與氫鍵結(jié)合，且結(jié)合界面在非活性一側(cè)。
(2)由此設(shè)計(jì)了突變體RGD/KGD-Sak的分子結(jié)構(gòu)，并利用PCR
定點(diǎn)突變技術(shù)改變野生型Sak基因堿基序列，使其含有RGD/KGD編碼序列。即以質(zhì)粒pST-Sak為模板，上游引物、突變引物、下游引物進(jìn)行三輪PCR擴(kuò)增，獲得RGD/KGD-Sak基因，然后與質(zhì)粒pUC19重組，酶解篩選陽性克隆，核苷酸序列分析驗(yàn)證是否發(fā)生預(yù)計(jì)位置的突變。
(3)突變體RGD/KGD-Sak基因與原核表達(dá)載體pLY-4重組，形成表達(dá)質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化大腸桿菌，溫度誘導(dǎo)RGD/KGD-Sak基因表達(dá)。表達(dá)產(chǎn)物以包涵體的形式存在于工程菌內(nèi)。
(4)發(fā)酵技術(shù)用低營養(yǎng)培養(yǎng)基M9CA培養(yǎng)工程菌，溫度誘導(dǎo)前后用LB、葡萄糖、稀有元素溶液等進(jìn)行補(bǔ)料，發(fā)酵參數(shù)為溫度30-42℃，氧容量為50％-80％，pH＝6-8，攪拌速度隨DO升高而降低；(5)工程菌發(fā)酵后用高壓破碎，離心收集包涵體，包涵體經(jīng)緩沖液洗滌，尿素溶解，稀釋復(fù)性，然后用凝膠過濾和離子交換二步法純化產(chǎn)品。
(6)與野生型Sak性質(zhì)比較表明，突變體RGD-Sak纖溶活性與野生型相似，形成聚合體的能力明顯降低，并且能顯著抑制ADP誘導(dǎo)的血小板的聚集，具有溶栓、防栓雙重功能。
實(shí)施例1.r-Sak半成品的鑒定Sak半成品由上海醫(yī)科大學(xué)提供(970923)，原純度達(dá)98％以上，-70℃保存。
還原性、非還原性SDS-PAGE—按Laemmli方法進(jìn)行。
樣品溶解液含0.0625M Tris-HCl(pH6.7)，2％SDS，10％甘油，5％巰基乙醇，0.001％溴酚蘭。
樣品處理和點(diǎn)樣取半成品1瓶(3mg/瓶，-70℃保存3月以上)，溶于3ml雙蒸水中，點(diǎn)樣量為10μl。
凝膠染色考馬斯亮蘭或銀染色。
凝膠中蛋白質(zhì)帶掃描以Pharmacia公司的ImageMasterRVDS進(jìn)行掃描，并用所附軟件分析各蛋白質(zhì)條帶含量。
電泳結(jié)束后，以考馬斯亮蘭染色，在相對(duì)分子量約15.5KD、31KD、46KD、62KD處出現(xiàn)濃集的條帶。
翻轉(zhuǎn)酪蛋白凝膠板法測定活性—上述凝膠依次用2.5％TritonX-100溶液和蒸餾水充分洗滌，覆蓋于含纖維蛋白原、人纖溶酶原及凝血酶的瓊脂凝膠板上，37℃保溫8h后，在上述分子量相應(yīng)位置均有清亮的透明溶解帶。表明r-Sak半成品儲(chǔ)存過程中有形成聚合體的傾向，且聚合物非常穩(wěn)定，并保持一定活性。2.葡激酶二聚體的分子模擬及突變體的合理設(shè)計(jì)分子對(duì)接軟件是美國Rockefeller大學(xué)Vakser IA開發(fā)的GRAMMV1.03，在SGI 02圖形工作站上進(jìn)行模建工作。
為了確定Sak二聚體的結(jié)合區(qū)，在Sak單體X射線衍射晶體結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)上，以GRAMM V1.03軟件進(jìn)行分子對(duì)接，選擇一分子Sak為受體，另一分子Sak為配體，以Sak受體搜索與配體Sak的結(jié)合區(qū)。按作者推薦的整體高分辨率對(duì)接參數(shù)進(jìn)行對(duì)接(表1)，搜索了10個(gè)復(fù)合物的結(jié)構(gòu)。
表1整體高分辨率對(duì)接參數(shù)Table 1 The parameters for high-resolution generic dockingMatching mode(generic/helix)...........................mmode＝genericGridstep...........................................................eta＝1.7Repulsion(attraction is always-1)......................ro＝30Attraction double range(fraction of single range)...fr＝0Potential range type(atom radius，grid step).....crang＝atom radiusProjection(blackwhite.gray)..........................ccti＝grayRepresention(all，hydrophobic).......................crep＝allNumber of matches to output.............................maxm＝10Angle for rotations，deg(10，12，15，18，20，30，0-no rot)ai＝10靜電勢及疏水性分析表明，Sak單體呈明顯的親疏水性的不對(duì)稱性。Silence等通過隨機(jī)突變的研究表明，決定活性的氨基酸主要位于親水一側(cè)(Silence K et al.J Biol Chem.270.27192-27198.(1995))。Sak的疏水面有兩個(gè)主要的疏水區(qū)(HydrophobicRegion，HR)，分別位于47-56(HR1)，104-113(HR2)位殘基處，其中的HR2疏水性更強(qiáng)。在模建的二聚體結(jié)構(gòu)模型中，疏水區(qū)相互作用顯示重要作用，并有HR1-HR2、HR2-HR2兩種結(jié)合方式。由于HR1靠近活性區(qū)，因此若兩分子Sak通過HR1-HR2結(jié)合，則一分子Sak的活性區(qū)將被遮蔽，可能僅保留一分子Sak的活性若以HR2-HR2的方式結(jié)合，活性似乎不會(huì)受到很大影響。
蛋白質(zhì)相互作用的界面通常有600-1300A-2，每個(gè)蛋白質(zhì)提供10-30個(gè)接觸殘基，但是，界面中存在所謂“熱點(diǎn)區(qū)”，僅3-5個(gè)氨基酸就提供了80％左右的結(jié)合能，改變這些殘基，復(fù)合物的結(jié)合能力將顯著下降(Li B et al，Science.270.1657-1660.(1995))。因此，二聚體無論以何種方式結(jié)合，只要改變HR2的主要結(jié)合殘基，就可能阻止二聚體的形成。Phe111位于HR2的核心區(qū)，是強(qiáng)疏水性氨基酸，且遠(yuǎn)離活性區(qū)，本發(fā)明將其替換為強(qiáng)極性氨基酸Asp，以破壞疏水作用，并期望能保持活性。同時(shí)，鑒于RGD/KGD序列肽可抑制血小板聚集，而正好位于β-折疊的loop區(qū)，構(gòu)象比較自由，因此本發(fā)明將Lys109改變?yōu)锳rg或保持不變，形成RGD/KGD序列。3.RGD/KGD-Sak基因的克隆及原核表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建質(zhì)粒pST-SAK為模板，以上游引物、突變引物進(jìn)行第一輪擴(kuò)增，351bp擴(kuò)增片段經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳回收、純化后，與下游引物再次以質(zhì)粒pST-Sak為模板進(jìn)行第二輪擴(kuò)增。純化后，所得408bp片段為模板，以上游引物、下游引物進(jìn)行第三輪擴(kuò)增，產(chǎn)物經(jīng)Klenow酶補(bǔ)平，EcoRI、BamHI酶解后與pUC19重組，酶解篩選陽性克隆，核苷酸序列分析證實(shí)已發(fā)生設(shè)計(jì)的突變，由基康生物技術(shù)公司用ABI377測序儀完成序列分析。然后用EcoRI、BamHI將RGD/KGD-Sak基因切出，連入表達(dá)載體的相應(yīng)位點(diǎn)。
上游引物5’...CGC GAA TTC ATG TCA AGT TCA TTC GAC...3’下游引物5’...CGC GGA TCC TTA TTT CTT TTC...3’突變引物5’...TAA ATC TGG GAC GAC GTC ACC ACG TTC TGT
TAT AGG...3’引入PstI位點(diǎn)以便于篩選寡核苷酸由美國Johns Hopkins大學(xué)DNA合成組制備。
目的基因與表達(dá)載體重組，轉(zhuǎn)化大腸桿菌JF1125，提取質(zhì)粒，以相應(yīng)酶酶解鑒定，獲得特征性片段，證實(shí)獲得陽性克隆。
表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌JF1125，經(jīng)溫度誘導(dǎo)表達(dá)，SDS-PAGE分析表達(dá)產(chǎn)物。電泳結(jié)束后，一半進(jìn)行考馬斯亮蘭染色，可見誘導(dǎo)后細(xì)菌裂解液在分子量約15.5KD處有一濃集的條帶，經(jīng)掃描，重組蛋白約占全菌總蛋白的50％；另一半洗去SDS后，貼在酪蛋白凝膠板上，37℃孵育數(shù)小時(shí)后，相當(dāng)于15.5KD處有一明顯的透亮區(qū)，即此部位的酪蛋白已溶解，表明RGD/KGD-Sak具有纖溶活性。菌體經(jīng)壓榨離心后，15.5KD條帶主要位于沉淀中，而上清中幾乎未見此條帶，說明表達(dá)產(chǎn)物以包涵體形式存在。4.工程菌的誘導(dǎo)表達(dá)篩選高表達(dá)菌株作為工程菌，然后以10L發(fā)酵罐進(jìn)行低密度發(fā)酵，溫度誘導(dǎo)后，離心收集菌體，PBS洗滌后，-70℃保存待用。10L發(fā)酵液得濕菌80g。濕菌用PB緩沖液懸浮，以高壓勻漿泵壓榨，離心后，SDS-PAGE結(jié)果表明，目的蛋白存在于沉淀溶解物行內(nèi)，于分子量15.5Kda處染色很深，而上清液行內(nèi)相同部位幾乎未見染色，表明RGD/KGD-Sak主要以包涵體形式存在。5.包涵體的分離、溶解與復(fù)性80g壓榨破菌，離心，得包涵體20g。包涵體經(jīng)洗滌，離心后，以8M尿素溶解，室溫作用至澄清透明。超離后棄沉淀，取上清稀釋復(fù)性。6.Sephadex G-10及S-Sepharose FF柱層析超濾濃縮后，先以Sephadex G-10凝膠過濾，然后以10倍柱體積PB緩沖液平衡S-Sepharose FF色譜柱，凝膠過濾后溶液直接上柱，Waters色譜儀控制流速和檢測蛋白峰。上樣結(jié)束后，以PB緩沖液洗至基線，0～1MNaCl梯度洗脫，收集洗脫組分，SDS-PAGE分析目的蛋白分布，并測定蛋白濃度。7.純度鑒定及分子量測定樣品進(jìn)行15％SDS-PAGE，考馬斯亮蘭R-250染色后，Pharmacia Imagemaster VDS掃描測定純度、分子量。純度95％以上，分子量約15.5KD。8.生物學(xué)活性測定分別以酪蛋白凝膠板溶圈法、發(fā)色底物法測定。比活性9-10萬HU/mg左右。9.Sak·纖溶酶復(fù)合物和RGD/KGD-Sak·纖溶酶復(fù)合物的Km和Kcat值測定分別將2μM纖溶酶原與22μM Sak或RGD/KGD-Sak在pH7.4，0.1MPB，37℃的條件下，混合反應(yīng)30min，形成與纖溶酶的復(fù)合物。然后取催化量復(fù)合物，在pH7.4，0.1MPB，37℃條件下，按以下體系反應(yīng)0-10min，每隔30s記錄405nM OD值，每個(gè)不同的纖溶酶原濃度重復(fù)三次，取平均值。
反應(yīng)體系終濃度Sak·纖溶酶(RGD/KGD-Sak·纖溶酶) 5nM發(fā)色底物S-2390 1mM纖溶酶原 1-30μMRGD/KGD-Sak.plasmin激活纖溶酶原的反應(yīng)符合米氏方程(表2)。
表1 RGD/KGD-Sak.plasmin、Sak.plasmin激活纖溶酶原的酶促動(dòng)力學(xué)常數(shù)比較Table 1 Kinetic analysis of activation of plasminogen by SakmoietiesKm(umol.l-Kcat(s-1) Kcat/Km1)Sak.plasmin 6.42 1.03 0.16RGD/KGD-12.501.41 0.11Sak.plasmin10.聚合能力檢測實(shí)驗(yàn)野生型Sak為對(duì)照，以生理鹽水溶解，取30mg/ml、3mg/ml高、低二種蛋白質(zhì)濃度，室溫靜置。每24h取樣，電泳鑒定。
在二種蛋白質(zhì)濃度下，RGD/KGD-Sak比野生型Sak的聚合能力顯著降低。11.豚鼠致敏試驗(yàn)分別以滅菌生理鹽水溶解重組野生型Sak或突變體RGD/KGD-Sak，配成濃度0.25萬單位/ml供致敏用。每次給藥，均重新開瓶配制新鮮溶液。取健康豚鼠8只，分二組，4只/組，分別間日腹腔注射r-Sak或RGD/KGD-Sak致敏豚鼠三次(劑量0.125萬單位/只)，14日后行第一次iv攻擊，21日行第二次iv攻擊(劑量0.25萬單位/只)。并取健康未致敏豚鼠2只，靜脈注射上述樣品(劑量0.25萬單位/只)，觀察有無同類反應(yīng)，以排除供試品藥理、毒理作用的干擾。
野生型r-Sak組3只豚鼠呈IV級(jí)陽性反應(yīng)，1只呈II級(jí)陽性反應(yīng)。
RGD/KGD-Sak1只豚鼠呈I級(jí)陽性反應(yīng)，其余無明顯反應(yīng)。
以上結(jié)果表明與野生型r-Sak相比，RGD/KGD-Sak的免疫原性顯著下降。12.血小板聚集抑制試驗(yàn)將用0.1體積，110mM枸櫞酸三鈉抗凝的新鮮血液低速離心(150g，10min)，得富含血小板的血漿(HRP)。在連續(xù)攪拌條件下，RGD-Sak(終濃度2μM)與HRP 37℃孵育2min后，向HRP中加入ADP(終濃度20μM)作為誘導(dǎo)劑，以雙通道血小板聚集儀測定5min內(nèi)血小板的聚集率。分別以2μM野生型r-Sak、生理鹽水為對(duì)照。
結(jié)果顯示，RGD/KGD-Sak組的聚集率(5％±2％，n＝3)明顯低于r-Sak組(58％±3％，n＝3)和生理鹽水組(59％±3％，n＝3)。表明RGD/KGD-Sak有很強(qiáng)的抑制ADP誘導(dǎo)的血小板聚集的能力。13.動(dòng)物溶栓實(shí)驗(yàn)應(yīng)用本發(fā)明所制備的RGD/KGD-Sak進(jìn)行動(dòng)物溶栓實(shí)驗(yàn)，證實(shí)RGD/KGD-Sak保持了與野生型Sak一致的溶栓性能。(1) RGD/KGD-Sak治療實(shí)驗(yàn)性兔股動(dòng)脈血栓，用動(dòng)脈造影顯示，治療前股動(dòng)脈中段以下不顯影，靜脈注射RGD/KGD-Sak0.1mg/Kg，60分鐘后再造影，股動(dòng)脈充盈完全，循環(huán)恢治療前股動(dòng)脈中段以下不顯影，靜脈注射RGD/KGD-Sak0.1mg/Kg，60分鐘后再造影，股動(dòng)脈充盈完全，循環(huán)恢復(fù)，與野生型Sak組一致，而對(duì)照組未見股動(dòng)脈充盈。治療組6只，野生型Sak組3只，空白對(duì)照組3只。(2) RGD/KGD-Sak治療實(shí)驗(yàn)性家兔前房積血眼內(nèi)注射RGD/KGD-Sak10-20μg，4小時(shí)后可見前房血凝塊溶解，紅細(xì)胞沉降后與房水形成一界面，至24小時(shí)，眼內(nèi)積血以被清除。與野生型Sak組一致，而對(duì)照組兔前房積血未見明顯變化。治療組6只，野生型Sak組4只，對(duì)照組4只。
附圖
為RGD/KGD-Sak的氨基酸序列，斜體為突變位點(diǎn)。
權(quán)利要求
1.一種新型重組葡激酶，其特征在于改變野生型Sak二聚體結(jié)合面，即47-56位氨基酸(HR1)、104-113位氨基酸(HR2)區(qū)的疏水性氨基酸，然后構(gòu)建重組表達(dá)質(zhì)粒，制備新型葡激酶分子。
2.按權(quán)利要求1所述的新型重組葡激酶，其特征在于所述新型葡激酶分子的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)為野生型Sak肽鏈的Lys109-Gly110-Phe111替換為Arg109-Gly110-Asp111(RGD)或Lys109-Gly110-Asp111(KGD)。
3.一種新型重組葡激酶的制備方法，其特征在于采用下列步驟(1)質(zhì)粒pST-Sak為模板，以上游引物、突變引物、下游引物進(jìn)行三輪PCR擴(kuò)增，與質(zhì)粒pUC19重組，酶解篩選陽性克隆，核苷酸序列分析驗(yàn)證是否發(fā)生預(yù)計(jì)位置的突變；(2)突變體RGD/KGD-Sak基因與原核表達(dá)載體重組，形成表達(dá)質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化大腸桿菌，溫度誘導(dǎo)RGD/KGD-Sak基因表達(dá)。表達(dá)產(chǎn)物以包涵體的形式存在于工程菌內(nèi)；(3)發(fā)酵技術(shù)用低營養(yǎng)培養(yǎng)基擴(kuò)增工程菌，溫度誘導(dǎo)前后用LB、葡萄糖、稀有元素溶液等進(jìn)行補(bǔ)料，發(fā)酵參數(shù)為溫度30-42℃，氧容量為50％-80％，pH＝6-8，攪拌速度隨DO升高而降低；工程菌發(fā)酵后用高壓破碎，離心收集包涵體，包涵體經(jīng)緩沖液洗滌，尿素或鹽酸胍溶解，稀釋復(fù)性后用凝膠過濾，離子交換二步法純化RGD/KGD-Sak產(chǎn)品。
全文摘要
本發(fā)明屬生物技術(shù)領(lǐng)域,具體涉及一種低聚合能力兼具防栓功能的新型重組葡激酶(RGD/KGD－Sak)的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和制備方法。根據(jù)對(duì)重組葡激酶單體、二聚體三維結(jié)構(gòu)及其生化特性的分析,設(shè)計(jì)了新型葡激酶分子結(jié)構(gòu)。通過PCR定點(diǎn)突變構(gòu)建突變體RGD/KGD－Sak基因,然后與原核表達(dá)載體pLY－4重組,轉(zhuǎn)化大腸桿菌,篩選高表達(dá)工程菌。工程菌經(jīng)發(fā)酵擴(kuò)增,破碎細(xì)菌,離心收集包涵體,復(fù)性后經(jīng)二步法純化RGD/KGD－Sak。所得產(chǎn)品凍干后,形成聚合體的能力顯著下降,并能顯著抑制ADP誘導(dǎo)的血小板的聚集,具有溶栓、防栓雙重功能。
文檔編號(hào)C07K14/31GK1264736SQ0011162
公開日2000年8月30日 申請(qǐng)日期2000年1月28日 優(yōu)先權(quán)日2000年1月28日
發(fā)明者宋后燕, 宋鋼 申請(qǐng)人:上海醫(yī)科大學(xué)