專利名稱：重組枯激酶的生產(chǎn)方法及其生物活性的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物工程技術(shù)領(lǐng)域。涉及生產(chǎn)重組枯激酶的方法，具體地說是建立一整套工程菌(PBV-NK/JM109)的發(fā)酵，從培養(yǎng)的發(fā)酵液中分離純化分泌的枯激酶的層析純化方法，以及培養(yǎng)熱誘導(dǎo)后，收集包涵體，溶解包涵體的變性、復(fù)性和純化蛋白質(zhì)的方法及所獲得純化枯激酶的產(chǎn)品。
現(xiàn)有的天然枯激酶，最初是由日本學(xué)者須見洋行從納豆中分離的枯草桿菌(BacillusSubtilis)的發(fā)酵物中鑒定出的。它具有很強的纖溶活性和激活內(nèi)皮細胞產(chǎn)生內(nèi)源t-PA的功能。近年日本大力開發(fā)納豆食品作為保健食品，預(yù)防和治療血栓性疾病。但由于自然菌產(chǎn)生的枯激酶量少，發(fā)酵時間長，難以應(yīng)用于大規(guī)模生產(chǎn)。
本發(fā)明的目的是，通過在天然枯激酶基礎(chǔ)上，以獲得工程菌株，產(chǎn)生重組枯激酶，解決由于自然菌產(chǎn)生枯激酶量少，發(fā)酵時間長，難以用于生產(chǎn)的問題。
實現(xiàn)本發(fā)明的具體技術(shù)措施是首先篩選分離出枯激酶菌種，在此條件下克隆枯激酶基因，測序，構(gòu)建高效表達枯激酶的工程菌株，以獲得高表達工程菌株，并建立重組枯激酶的生產(chǎn)方法，經(jīng)提取純化，活性檢測確定。其生產(chǎn)工藝方法包括工程菌種的發(fā)酵，飽和硫酸銨沉淀目的蛋白，目的蛋白硫酸銨沉淀物的透析，用DEAE-纖維素DE-52柱層析分離目的蛋白，用CM-纖維素CM-52進一步純化目的的蛋白。用PEG-10000濃縮目的蛋白，SephadexG-100柱層析純化目的蛋白等步驟。
1．工程菌種及發(fā)酵，重組PBV-NK/JM109為本中心構(gòu)建，從4℃保存的菌種平皿中，挑取單菌落接種在5mlLB培養(yǎng)液試管中，含Amp抗菌素100μg/ml,30℃培養(yǎng)，180轉(zhuǎn)/分鐘，振蕩培養(yǎng)18小時。按1∶50接種在200mlLB培養(yǎng)液/1000ml三角瓶中，氨芐為100μg/ml。30℃,150轉(zhuǎn)/分鐘，培養(yǎng)24小時后，離心，6000轉(zhuǎn)/分鐘，20分鐘，收集上清液，電泳檢測目的蛋白在發(fā)酵液中的含量。
2．飽和硫酸銨沉淀目的蛋白以60％飽和硫酸銨沉淀枯激酶。在0℃條件下，稱取硫酸銨，經(jīng)粉碎后，緩慢地加入到上清液中，邊加邊攪拌，待全部加完后，在同樣條件，繼續(xù)攪拌2小時，4℃冰箱過夜，離心，6000rpm,20分鐘，4℃，收集沉淀，并用小量pH7.4,10mM磷酸緩沖液溶解沉淀物。
3．目的蛋白硫酸銨沉淀物的透析上述溶解的沉淀物，在4℃對蒸餾水1200ml透析，3-4小時換水1次，透析24小時以上，所得透析液，再對10MmPBS(PH7.4)透析過夜，此時獲得的透析液，供層析分離用。
4．用DEAE-纖維素DE-52柱層析分離目的蛋白，由于目的蛋白在PH7.4時帶有正電荷，菌體蛋白為負電荷，因此，經(jīng)過柱后，雜蛋白與DE-52發(fā)生離子交換而留在柱上，而目的蛋白流出，從而使大部分雜蛋白和色素被除去，獲得初步分離的枯激酶，樣品中目的蛋白濃度近50％。目的蛋白在DE-52柱層析時，保留在第2峰后部和整個第2個峰留份中。如圖2、圖4所示。從6000ml培養(yǎng)液得20-30mg目的蛋白。
5．用CM-纖維素CM-52進一步純化目的蛋白如圖3、圖4所示，用CM-52柱層析純化目的蛋白的層析曲線。
將DE-52分離的有活性餾份合并后，調(diào)PH至6.4，在4℃下，以1∶3的比例，靜態(tài)交換吸附樣品，至少在4小時以上，然后抽濾收集CM-52，并用2-5倍體積的10mMPBS(PH6.4)洗CM-52，被洗后的CM-52，裝在層析柱中(0.0cm×100cm)，連接蛋白質(zhì)檢測儀，280mM，繼續(xù)用PBS淋洗，在儀器基線走直后，改梯度洗脫，用0M與1MNaCl的10mMPBS(PH6.4)各300ml。分部收集樣品后，測定活性，并電泳檢測組分，合并單一目的蛋白餾份，轉(zhuǎn)入SephadexG-100柱純化。
6．用PEG-10000濃縮目的蛋白在CM-52柱梯度洗脫時，枯激酶在0.15-0.2MNaCl濃度時被洗下，收集后，用PEG濃縮為5ml左右，過SephadexG-100柱除鹽和進一步純化。
7．SephadexG-100柱層析純化目的蛋白SephadexG-100柱(0.8cml00cm)，經(jīng)10mMPBS(PH7.4)平衡后，將5ml濃縮的CM-52柱樣品，緩慢加入，樣品進入膠后，加入10mMPBS(PH7.4)。開始洗脫。紫外280mμ檢測，收集峰餾份，洗脫峰呈對稱狀，所得活性餾份電泳檢測為單一條帶的枯激酶。為最終產(chǎn)品。
本發(fā)明是在天然枯激酶基礎(chǔ)上，獲得的工程菌株，產(chǎn)生的重組枯激酶，其優(yōu)點在于用E.coli培養(yǎng)時間短，產(chǎn)酶量大，便于提取、純化，可工業(yè)化生產(chǎn)。
本發(fā)明所提供的附圖是

圖1，為本發(fā)明的工藝流程圖2，DE-52和柱層析純化曲線圖3，CM-52純化層析純化曲線圖4，DE-52(A)和CM-52(B)層析樣品SDS電泳5，Sephadex G-100純化蛋白電泳6，重組枯激酶包涵體的SDS-PAGE電泳7，洗滌包涵體的變性電泳8，純化枯激酶的SDS-PAGE電泳及電泳掃描圖9，體外纖溶結(jié)果圖10，純化枯激酶的活性測定結(jié)果圖11，純化枯激酶的HPLC圖12，體外溶解血塊結(jié)果本發(fā)明結(jié)合實施例1、2對附圖進一步說明。
實施例1一，本實施例的技術(shù)要點1．細菌發(fā)酵為低密度高表達。
2．包涵體變性劑為尿素。
3．包涵體復(fù)性后，柱層析純化，兩步，DE-52柱和CM-52柱。
二、實驗操作步驟(圖1)1．工程菌株，重組PBV-NK/E.coliJM109，為本中心構(gòu)建。從4℃保存的工程菌平皿上挑取單菌落接種在5mlLB培養(yǎng)液管中(含氨芐青霉素100μg/ml)30℃,180轉(zhuǎn)/分鐘，振蕩培養(yǎng)16-18小時后，按2∶50接種于搖瓶中(含氨芐青霉素100μg/ml),30℃,180轉(zhuǎn)/分鐘，振蕩培養(yǎng)16小時作為種子液。
2．發(fā)酵，按2∶50將種子液接入于200mlLB/1000ml三角瓶中(含氨芐表霉素100μg/ml)PH7.2,30℃,180轉(zhuǎn)/分，振蕩4-5小時，待菌密度達到0D600為0.3-0.4時，迅速升溫至42℃，誘導(dǎo)表達4-5小時，離心收集菌體，6000轉(zhuǎn)/分，20分鐘，電泳檢查目的蛋白表達量。濕菌體為5-7g/升。見圖6。
3．菌體的裂解離心收集菌體，棄去上清，稱菌體重量，按1∶10加入20mM/L PBS PH7.4洗菌體1次。離心后，仍按1∶10將菌體懸浮于緩沖液A中(緩沖液A50mM/L Tris HCL PH8.0 0.5mM/LEDTA,50mM/L Nacl,5％甘油，0.5mM/LDTT)，在超聲波細胞破碎儀上，超聲30分鐘，顯微鏡下檢查，破碎率在95％以上。向超聲液中加脫氧膽酸(DOC)達終濃度0.2％，混勻后，室溫放置10分鐘，4℃,12000轉(zhuǎn)/分，離心，15分鐘，棄去上清，沉淀稱重，即為包涵體。
4．包涵體的洗滌(1)以0.5％TritonX-100(用緩沖液A)配制，按1∶10重懸浮沉淀，(均勻，不得有顆粒)，室溫攪拌20分鐘，12000轉(zhuǎn)/分，20分鐘，棄上清，沉淀稱重。
(2)用2M/LNacl(緩沖液A配制)，1∶10洗滌包涵體，室溫攪拌1小時，12000轉(zhuǎn)/分，離心20分鐘，收集并稱重沉淀包涵體。
(3)用3M/L尿素(緩沖液A配制)洗滌包涵體室溫攪拌20分鐘，12000轉(zhuǎn)/分，離心20分鐘，棄上清收集沉淀包涵體，稱重。洗滌包涵體見圖7。
5．包涵體變性以8M/L尿素溶解變性包涵體。8M/L尿素(用緩沖液A配制)，按1∶5加入尿素溶液，37℃溶解2小時以上，12000轉(zhuǎn)/分，離心20分鐘，上清為包涵體變性液，應(yīng)呈無色或微黃色溶液。
6．包涵體復(fù)性(1)2M/L尿素復(fù)性，包涵體變性液，測定其蛋白濃度，復(fù)性要將其濃度稀至100μg/ml蛋白時進行。2M/L尿素復(fù)性在4℃，過夜，復(fù)性液(用緩沖液A配制)應(yīng)呈清，透明，無聚集現(xiàn)象，然后，對緩沖液A透析多次除去尿素。
(2)稀釋法復(fù)性。將變性液逐滴加入復(fù)性液中(100mM/L尿素的緩沖液A)，使蛋白質(zhì)濃度達到0.1mg/ml，充分復(fù)性后，離心除去沉淀，超滬濃縮，透析除去尿素。
7．復(fù)性蛋白的柱層純化(1)用DEAE-Cellulose DE-52柱層析分離，將平衡好的DE-52裝入柱中(4×20cm)，以20mMPBS(PH7.4)平衡后，復(fù)性樣品調(diào)PH7.4，通過該柱，收集流出部，電泳檢查，將活性部分合并(見圖2、圖4A)。
(2)用CM-Cellulose CM-52柱純化。處理好的CM-52，稱取一定量，已經(jīng)用20mMPBS PH6.5平衡的CM-52，加入到調(diào)PH6.5的上步活性餾份中，靜態(tài)交換，16小時以上。然后抽滬，保留上清，CM-52裝入柱中(0.8×60cm)，用平衡緩沖液洗去未交換或粘附的雜質(zhì)，使檢測儀基線走直，改0-1.0M/LNaCl(用20mMPBS,PH6.5配)進行梯度洗脫，收集峰餾份，活性和電泳檢測，合并有活性，單一帶部分，為精制品(見圖3、圖4B)。
(3)用SephadexG-100層析純化，將CM-52活性餾份合并，PEG濃縮至10ml以下，過平衡好的SephadexG-100柱(0.8×60cm)，用同樣20mMPBS、PH7.4洗脫，出現(xiàn)單一對稱峰，為最終產(chǎn)品，合并凍干。結(jié)果見圖5及圖8，同時枯激酶的HPLC分析結(jié)果為單峰，純度在99％以上，見圖11。
實施例2一、本實施例的技術(shù)要點1．重組枯激酶體外對纖維蛋白的溶解活性2．重組枯激酶體外對自然凝血塊的溶解作用二、實驗操作步驟1．體外對Agarose-纖維蛋白平板的溶圈活性，取Agarose(1％)溶液16.2ml，纖維蛋白原液16.2ml，凝血酶1.3ml，在45℃下，混勻后倒入到9cm×9cm×20cm的方盒中，室溫放置1小時后，將不同濃度的重組枯激酶10μl，點在平板表面，30分鐘后，放入到37℃,16-18小時，具有很大透明溶圈。表明重組枯激酶，體外對纖維蛋白的溶解作用。見圖9、圖10。
2．體外溶解凝血塊的作用，抽取一定量的兔血，倒入平皿中，4℃凝血后，用PBS,PH7.4，洗滌后，分別稱取500mg，三塊，放在三個小燒杯中，然后加入①生理鹽水10ml，②含2mg重組枯激酶的10ml同樣溶液，③含2mg重組鏈激酶的10ml同樣溶液，37℃，振蕩30分鐘稱重1次，記錄血塊重量，連續(xù)3次即90分鐘，每次稱血塊重量記錄，結(jié)果如表1和圖12所見。
表1枯激酶體外溶解血塊實驗結(jié)果
從表中結(jié)果可見，重組枯激酶具有很強的體外溶解血塊的功能。
總之，本發(fā)明公開了一種重組枯激酶的生產(chǎn)技術(shù)方法，包括工程菌的培養(yǎng)、誘導(dǎo)表達，包涵體的分離，洗滌，裂解變性，復(fù)性方法和蛋白質(zhì)的純化工藝以及體外對纖維蛋白平板的血塊的溶解活性與活性測定。
本發(fā)明純化的產(chǎn)品可作為一種新的溶解血栓制劑，可以制成凍干粉供注射用，或制成片劑和膠囊供口服治療預(yù)防心腦血管栓塞疾病。
權(quán)利要求
1．一種重組枯激酶的生產(chǎn)方法包括工程菌種的發(fā)酵，飽和硫酸銨沉淀目的蛋白，目的蛋白硫酸銨沉淀物的透析，用DEAE-纖維素DE-52柱層析分離目的蛋白，用CM-纖維素CM-52進一步純化目的的蛋白。用PEG-10000濃縮目的蛋白，Sephadex G-100柱層析純化目的蛋白等步驟，其特征在于工程菌種及發(fā)酵，從4℃保存的菌種平皿中，挑取單菌落接種在5mlLB培養(yǎng)液試管中，含Amp抗菌素100μg/ml,30℃培養(yǎng)，180轉(zhuǎn)/分鐘，振蕩培養(yǎng)18小時。按1∶50接種在200mlLB培養(yǎng)液/1000ml三角瓶中，氨芐為100μg/ml。30℃,150轉(zhuǎn)/分鐘，培養(yǎng)24小時后，離心，6000轉(zhuǎn)/分鐘，20分鐘，收集上清液，電泳檢測目的蛋白在發(fā)酵液中的含量。
2．根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種重組枯激酶的生產(chǎn)方法，其特征在于飽和硫酸銨沉淀目的蛋白。即以60％飽和硫酸銨沉淀枯激酶。在0℃條件下，稱取硫酸銨，經(jīng)粉碎后，緩慢地加入到上清液中，邊加邊攪拌，待全部加完后，在同樣條件，繼續(xù)攪拌2小時，4℃冰箱過夜，離心，6000rpm，20分鐘，4℃，收集沉淀，并用小量pH7.4,10mM磷酸緩沖液溶解沉淀物。
3．根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種重組枯激酶的生產(chǎn)工藝，其特征在于目的蛋白硫酸銨沉淀物的透析，是將溶解的沉淀物，在4℃對蒸餾水1200ml透析，3-4小時換水1次，透析24小時以上，所得透析液，再對10MmPBS(PH7.4)透析過夜，此時獲得的透析液，供層析分離用。
4．根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種重組枯激酶的生產(chǎn)工藝，其特征在于用DEAE-纖維素DE-52柱層析分離目的蛋白，選擇目的蛋白在PH7.4時帶有正電荷，菌體蛋白為負電荷時，經(jīng)過柱后，雜蛋白與DE-52發(fā)生離子交換而留在柱上，而目的蛋白流出，從而使大部分雜蛋白和色素被除去，獲得初步分離的枯激酶，此時目的蛋白濃度近50％。目的蛋白在DE-52柱層析時，保留在第2峰后部和整個第2個峰留份中。
5．根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種重組枯激酶的生產(chǎn)工藝，其特征在于用CM-纖維素CM-52進一步純化目的蛋白。即將DE-52分離的有活性餾份合并后，調(diào)PH至6.4，在4℃下，以1∶3的比例，靜態(tài)交換吸附，至少在4小時以上，然后抽濾收集CM-52，并用2-5倍體積的10mMPBS(PH6.4)洗CM-52，被洗后的CM-52，裝在層析柱中(0.0cm×100cm)，連接蛋白質(zhì)檢測儀，280mM，繼續(xù)用PBS淋洗，在儀器基線走直后，改梯度洗脫，用0M與1MNaCl的10mMPBS(PH6.4)各300ml。分部收集目的蛋白，測定活性，并電泳檢測組分，合并單一目的蛋白餾份，轉(zhuǎn)入SephadexG-100柱純化。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種重組枯激酶的生產(chǎn)工藝，其特征在于用PEG-10000濃縮目的蛋白。即在CM-52柱梯度洗脫時，枯激酶在0.15-0.2MNaCl濃度時被洗下，收集后，用PEG濃縮為5ml左右，過SephadexG-100柱除鹽和進一步純化。
7．根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種重組枯激酶的生產(chǎn)工藝，其特征在于SephadexG-100柱層析純化目的蛋白。即SephadexG-100柱(0.8cm100cm)，經(jīng)10mMPBS(PH7.4)平衡后，將5ml濃縮的CM-52柱樣品，緩慢加入，樣品進入膠后，加入10mMPBS(PH7.4)。開始洗脫。紫外280mμ檢測，收集峰餾份，洗脫峰呈對稱狀，所得活性餾份電泳檢測為單一條帶的枯激酶。
全文摘要
重組枯激酶的生產(chǎn)方法及其生物活性,本發(fā)明屬于生物工程技術(shù),其主要解決自然菌產(chǎn)生枯激酶量少、發(fā)酵時間長,難以用于生產(chǎn)等問題。在自行篩選的Batillus Subtilis發(fā)酵產(chǎn)生枯激酶的基礎(chǔ),克隆出該酶基因,建立了一整套基因工程菌發(fā)酵,誘導(dǎo)表達,包涵體分離,洗滌,裂解,變性,復(fù)性和蛋白質(zhì)純化工藝,獲得重組枯激酶純品,其體外具有溶解纖維蛋白和凝結(jié)血塊能力,體內(nèi)有促進內(nèi)皮細胞產(chǎn)生t－PA縮短優(yōu)球蛋白溶解時間,及強的纖溶酶樣活性。表明重組枯激酶可能作為新一代基因工程溶栓藥物。
文檔編號C07K1/00GK1306086SQ0011605
公開日2001年8月1日 申請日期2000年9月29日 優(yōu)先權(quán)日2000年9月29日
發(fā)明者王春生, 楊志興, 吳晶, 林元通, 程漢強, 許文娟 申請人:武漢迪普生物技術(shù)有限公司