一種水稻花粉特異表達(dá)啟動子OsPoll2及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明設(shè)及生物技術(shù)和作物基因工程技術(shù)領(lǐng)域。具體而言，本發(fā)明設(shè)及一種水稻 花粉特異表達(dá)啟動子及其應(yīng)用，該啟動子能夠在作物基因工程中驅(qū)動目標(biāo)基因在花粉中特 異表達(dá)，從而通過改變花粉活力有效防控轉(zhuǎn)基因漂移。
【背景技術(shù)】
[0002] 轉(zhuǎn)基因技術(shù)被認(rèn)為是人類解決±地資源銳減和人口急劇膨脹運一矛盾最有效的 方法之一，但由于該技術(shù)開發(fā)和利用的時間較短，人類對其生物安全性認(rèn)識十分有限，在科 學(xué)界和社會公眾中，很多人對植物轉(zhuǎn)基因技術(shù)的安全性屯、存顧慮。轉(zhuǎn)基因植物所攜帶的外 源基因可能隨花粉漂移到近緣物種或野生種，出現(xiàn)所謂的"基因漂移"，運種漂移有可能會 導(dǎo)致附近野生近緣種發(fā)生內(nèi)在的基因變化而產(chǎn)生新性狀、形成新物種，引起生態(tài)系統(tǒng)中關(guān) 系鏈的變化，特別是一些抗蟲、抗病、抗除草劑或?qū)Νh(huán)境脅迫具有耐性基因的漂移，可能會 給受體近緣物種或野生種帶來生長勢、越冬性、種子產(chǎn)量、生活力和適合度等方面的變化， 提高其入侵其他植物棲息地的能力并占據(jù)棲息地，破壞自然種群平衡，影響生物多樣性，最 后可能演變成無法控制的"超級雜草"，產(chǎn)生嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)和生態(tài)上的后果。
[0003] 轉(zhuǎn)基因漂移的途徑主要包括花粉漂移、種子傳播或擴(kuò)散和無性繁殖器官的移動 等。一般需要一定的媒介，其中風(fēng)媒和蟲媒產(chǎn)生的花粉傳播是最常見的方式。因此，為了減 少基因漂移，要么阻斷花粉傳播、要么使花粉喪失活力。而通過物理方式阻斷花粉傳播是不 現(xiàn)實的，因此，使花粉喪失活力是阻斷花粉介導(dǎo)基因漂移的重要途徑。
[0004] 要改變花粉活力，最直接的方式就是針對花粉進(jìn)行基因調(diào)控。植物基因調(diào)控主要 是在轉(zhuǎn)錄水平上進(jìn)行的，受多種順式作用因子和反式作用因子的相互協(xié)調(diào)。啟動子是重要 的順式作用元件，能活化RNA聚合酶，使之與模板DNA準(zhǔn)確地結(jié)合，確保轉(zhuǎn)錄精確而有效地起 始，在轉(zhuǎn)錄調(diào)控中起到關(guān)鍵作用。
[0005] 目前在農(nóng)業(yè)生物技術(shù)領(lǐng)域廣泛應(yīng)用的主要是一些組成型的強啟動子，比如 CaMV35S啟動子和玉米化iquitin-1啟動子，然而，在利用運些啟動子誘導(dǎo)目的基因轉(zhuǎn)化水 稻等作物進(jìn)而改良作物品質(zhì)時，往往會由于目的基因表達(dá)的時間或空間不能很好地控制而 導(dǎo)致改良效果不明顯，或者由于運些組成型啟動子誘導(dǎo)基因表達(dá)量太高而對植物的生長發(fā) 育造成影響。
[0006] 所W，為了既改變花粉的活力，又不會對植物帶來過多負(fù)面影響，發(fā)掘和研究花粉 特異表達(dá)啟動子具有重要的意義。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 本發(fā)明的目的是提供一種驅(qū)動外源基因在水稻花粉特異表達(dá)的啟動子、獲得含有 該啟動子序列的轉(zhuǎn)化子W及該啟動子的應(yīng)用。其中，本文中的啟動子可W應(yīng)用于禾本科作 物，例如水稻、小麥、玉米、大麥、高梁或燕麥，優(yōu)選為水稻。
[000引為了實現(xiàn)上述目的，一方面，本發(fā)明提供一種水稻花粉特異表達(dá)啟動子，所述水稻 花粉特異表達(dá)啟動子包含：
[0009] (a)SEQ ID No:l中所述的核巧酸序列;或者
[0010] (b)與SEQ ID No: 1中所述的核巧酸序列互補的核巧酸序列。
[0011 ] 序列表中SEQ ID No : 1所示的DNA序列為來源于日本晴水稻（0巧Za sativa L cv.Ni卵onbare)的序列，本文中稱為Os化112或啟動子Os化112。具體而言，本申請的發(fā)明人 發(fā)現(xiàn)日本晴水稻(Oirza sativa L CV.化卵onbare)中一段長度為2050bp的DNA序列具有驅(qū) 動目標(biāo)基因在水稻花粉中特異表達(dá)的作用。并且分離克隆得到了序列表中SEQ ID No: 1所 示的DNA序列。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)該理解，與其互補的核巧酸序列也具有同樣功能，因此也 包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。
[0012] 優(yōu)選地，本發(fā)明的水稻花粉特異表達(dá)啟動子的DNA序列由SEQ ID No: 1所示的序列 構(gòu)成，即0sPoll2或啟動子Os化112。
[0013] 另一方面，本發(fā)明還提供一種包含上述水稻花粉特異表達(dá)啟動子的表達(dá)盒。
[0014] 又一方面，本發(fā)明還提供一種重組表達(dá)載體，所述重組表達(dá)載體包含上述的水稻 花粉特異表達(dá)啟動子，在所述重組表達(dá)載體中，所述水稻花粉特異表達(dá)啟動子連接于待表 達(dá)的基因序列（或稱目的基因）的上游;優(yōu)選地，所述待表達(dá)的基因為Gus基因，所述重組表 達(dá)載體為pCAMB I Al 391 -Os化112，該重組表達(dá)載體為將沈Q ID No: 1所示的序列即OsPo 112 或啟動子0sPoll2構(gòu)建于PCAMBIA1391中得到的重組表達(dá)載體，本文中稱為PCAMBIA1391-0sPoll2。
[0015] 或者待表達(dá)基因可W為任何對作物的花粉性狀具有改善能力的基因。通過本發(fā)明 的啟動子驅(qū)動該基因在花粉中特異性地集中表達(dá)，從而實現(xiàn)改善水稻花粉相應(yīng)性狀的功 能。
[0016] 或者待表達(dá)基因為對花粉的活性具有抑制功能的基因，用于降低花粉活性，減少 或避免基因漂移。
[0017] 另一方面，本發(fā)明提供一種在植物的花粉中驅(qū)動特定目的基因表達(dá)的方法，其特 征在于，所述方法包括：
[0018] A)、將上述的水稻花粉特異表達(dá)啟動子Os化112連接于目的基因的上游；
[0019] B)、將所述水稻花粉特異表達(dá)啟動子OsPolU與目的基因的結(jié)合產(chǎn)物轉(zhuǎn)入到根癌 農(nóng)桿菌中；
[0020] C)、利用轉(zhuǎn)入了所述結(jié)合產(chǎn)物的根癌農(nóng)桿菌對目標(biāo)植物的種子進(jìn)行農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化；
[0021] D)、利用轉(zhuǎn)化后的種子培養(yǎng)相應(yīng)植株，在所述植株中，所述的水稻花粉特異表達(dá)啟 動子Os化112能夠驅(qū)動目的基因表達(dá)。
[0022] 優(yōu)選地，所述目的基因為結(jié)構(gòu)基因、調(diào)芐基因或者結(jié)構(gòu)基因的反義基因。
[0023] 再一方面，本發(fā)明提供上述水稻花粉特異表達(dá)啟動子在培育轉(zhuǎn)基因作物中的應(yīng) 用。所述應(yīng)用包括將本發(fā)明提供的上述水稻花粉特異表達(dá)啟動子連接于載體的待表達(dá)的基 因序列上游(例如，將所述啟動子序列置于/插入目標(biāo)基因之前），從而構(gòu)建重組表達(dá)載體， 將所述重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)化到作物細(xì)胞、組織或器官中進(jìn)行培育。然后，可W進(jìn)一步利用所培 育的細(xì)胞、組織或者器官進(jìn)行轉(zhuǎn)基因植株的培育。
[0024] 優(yōu)選地，所述應(yīng)用可W用于改良作物生長特性，所述作物為禾本科作物，例如水 稻、小麥、玉米、大麥、高梁或燕麥，優(yōu)選為水稻。
[0025] 本發(fā)巧中所提供的啟動子的DNA序列為（與序列表中沈0 ID No:l中巧同）：
[0027]需要說明的是：上述啟動子的DNA序列中，序列開頭W斜體并加粗表示的序列 "GCGCT投化腹GTfGC"為獲得啟動子過程中使用的正向引物的留存序列， 共計22bp;序列末尾W斜體并加粗表示的序列"心C投棋4C乂獻(xiàn)泌4CGyWGCTCG"為獲 得啟動子過程中使用的反向引物的留存序列(該留存序列與反向引物的相應(yīng)序列互補），共 計22bp;該DNA序列中剩余的部分則為獲自日本晴水稻中的DNA序列。需要強調(diào)的是，本文中 所提到的啟動子既可W指上述整個DNA序列，也可W指去除上述引物留存序列后的DNA序 列。即便本領(lǐng)域技術(shù)人員在本發(fā)明的基礎(chǔ)上，采用其他引物獲得了類似序列，其也落入本發(fā) 明的保護(hù)范圍之內(nèi)。
[002引綜上所述，本發(fā)明的發(fā)明人發(fā)現(xiàn)、提取并鑒定了日本晴水稻（Oryza sativa L CV.Nipponbare)中一段具有轉(zhuǎn)錄調(diào)控活性的2050bpDNA序列，并將其命名為Os化112(序列 表中的SEQ ID No:l)。具體而言，發(fā)明人發(fā)現(xiàn)該序列具有驅(qū)動基因在花粉中特異性表達(dá)的 能力，提取出該序列并對上述能力進(jìn)行了鑒定。發(fā)明人將該序列經(jīng)酶切后連接到作物雙元 表達(dá)載體pCAMBI Al 391上，獲得相應(yīng)的重組質(zhì)粒（即重組表達(dá)載體），利用該重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化根 癌農(nóng)桿菌菌株EHA105,然后用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的方法進(jìn)行水稻的轉(zhuǎn)化，得到轉(zhuǎn)基因水稻植株。對 獲得的轉(zhuǎn)基因水稻進(jìn)行組織化學(xué)檢測發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)基因植株僅在花粉中有藍(lán)色出現(xiàn)，在其他器 官組織中均沒有著色，從而證明該2050bp的序列具有驅(qū)動基因特異的在花粉中表達(dá)的活 性。
[0029] 本發(fā)明所述的啟動子序列可與作物雙元表達(dá)載體連接，用于取代組成型啟動子。 并且，該啟動子序列可W與所需的祀標(biāo)基因連接，構(gòu)建重組作物表達(dá)載體，經(jīng)轉(zhuǎn)化后，可在 花粉特異的驅(qū)動祀標(biāo)基因的表達(dá)。
[0030] 技術(shù)效果
[0031] 本發(fā)明所克隆的水稻啟動子OsPo 112能夠調(diào)控基因在植株中花粉部位集中表達(dá)， 在實際應(yīng)用中具有顯著價值。通過該啟動子代替UBI等組成型啟動子對農(nóng)作物的花粉性狀 進(jìn)行基因改造，如通過該啟動子調(diào)控目標(biāo)基因在花粉中表達(dá)，使花粉喪失生活力，是阻斷花 粉介導(dǎo)基因漂移的重要途徑。
【附圖說明】
[0032] W下，結(jié)合附圖來詳細(xì)說明本發(fā)明的實施方案，其中：
[0033] 圖1為將0sPoll2啟動子構(gòu)建于PCAMBIA1391載體質(zhì)粒中的示意圖，其中圖1中A為 PCAMBIA1391示意圖，B為pCAMBIA1391-〇sPoll2示意圖，其中示出了利用Os化112啟動子驅(qū) 動位于其下游的GUS基因表達(dá)；
[0034] 圖2為對本發(fā)明的啟動子進(jìn)行酶切驗證的結(jié)果示意圖。
[0035] 圖3為10周齡Os化112-GUS轉(zhuǎn)基因植物各組織GUS染色圖。（A)根；（B)莖；（C)成熟葉 片；（D)小花；（E)雄蕊；（F)花粉。標(biāo)尺化mm。
【具體實施方式】
[0036] W下參照具體的實施例來說明本發(fā)明。本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠理解，運些實施例僅 用于說明本發(fā)明，其不W任何方式限制本發(fā)明的范圍。
[0037] 下述實施例中的實驗方法，如無特殊說明，均為常規(guī)方法。下述實施例中所用的生 化試劑，載體耗材等，如無特殊說明，均為市售購買產(chǎn)品。
[0038] 含有酶切位點的Os化112啟動子的獲得
[0039] 步驟1、引物的設(shè)計
[0040] 根據(jù)NCBI中提供的水稻品種日本晴（0;ryza sativa L。￥.化卵〇]16日'6)全基因組 序列，依據(jù)水稻Os化112基因的序列設(shè)計擴(kuò)增引物，并根據(jù)選用的載體及祀標(biāo)基因的特點， 設(shè)計引物的酶切位點。
[0041 ] 本實施例中W水稻雙元表達(dá)載體pCAMBIAl 391 (圖1中A部分，來自于GAMBIA，公開 使用載體，安徽省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)部轉(zhuǎn)基因生物產(chǎn)品成分監(jiān)督檢驗測試中屯、水稻組保存） 為例，祀標(biāo)基因為Gus基因，具體設(shè)計的引物為:正向引