基于近紅外光鑷激發(fā)上轉(zhuǎn)換發(fā)光的定量檢測裝置及檢測方法
【專利說明】基于近紅外光鑷激發(fā)上轉(zhuǎn)換發(fā)光的定量檢測裝置及檢測方法
[0001]
技術(shù)領(lǐng)域
[0002]本發(fā)明屬于微納操作技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種基于近紅外光鑷激發(fā)上轉(zhuǎn)換發(fā)光的定量檢測裝置及檢測方法。
【背景技術(shù)】
[0003]光鑷即單光束梯度力光阱，是基于散射力和輻射壓梯度力相互作用而形成的能夠捕獲整個米氏和瑞利散射范圍粒子的勢阱。對粒子起捕獲作用的是梯度力，將粒子穩(wěn)定地束縛在光場勢阱中的前提是軸向梯度力能夠克服散射力。所以通常需要使用較大數(shù)值孔徑的顯微物鏡將激光束高度會聚，從而產(chǎn)生足夠強的梯度力來實現(xiàn)粒子的捕獲。在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，光鑷技術(shù)往往和光學(xué)顯微鏡技術(shù)相結(jié)合，實現(xiàn)單個微粒的觀察、捕獲和操縱。光鑷對微粒最常見的捕獲是當(dāng)散射力小于梯度力時，微粒被梯度力穩(wěn)定在溶液之中，形成懸浮的狀態(tài)，稱為二維捕獲。
[0004]上轉(zhuǎn)換發(fā)光納米材料是一種特殊的稀土發(fā)光材料，它可以通過雙光子或多光子機制將低頻率的激發(fā)光轉(zhuǎn)化成高頻率的發(fā)射光。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是提供一種基于近紅外光鑷定量檢測裝置及檢測方法。
[0006]本發(fā)明將光鑷技術(shù)和上轉(zhuǎn)換發(fā)光技術(shù)相結(jié)合，提出一種通過采用近紅外激發(fā)光以避免激發(fā)試樣中自發(fā)熒光(提高信背比)，從而提高檢測靈敏度的定量檢測裝置及檢測方法，用于各類復(fù)雜樣品中的金屬離子、生物分子和病毒粒子等的檢測。
[0007]一種基于近紅外光鑷定量檢測裝置，包括近紅外半導(dǎo)體激光器，所述近紅外半導(dǎo)體激光器發(fā)出激光束經(jīng)單模光纖、光纖準(zhǔn)直器后，由望遠鏡透鏡組擴束，再經(jīng)過二向色鏡反射進入物鏡后瞳，經(jīng)物鏡聚集在樣品池中形成光鑷，光阱中微球的前向散射光經(jīng)過聚光鏡，再由二向色鏡反射，透鏡匯聚后，照射到散射光檢測器上；
光阱中微球的上轉(zhuǎn)換發(fā)光經(jīng)阻擋濾光片和透鏡后，通過針孔照射到上轉(zhuǎn)換發(fā)光檢測器上。
[0008]還包括支撐樣品池的電動平移臺和照明LED。
[0009]所述近紅外半導(dǎo)體激光器為功率可調(diào)的多種類型的近紅外半導(dǎo)體激光器，波長975nm_989nm。
[0010]所述近紅外半導(dǎo)體激光器發(fā)出激光束經(jīng)過單模光纖，在其出口處的能量分布為高斯分布。
[0011]所述散射光檢測器為四象限光電檢測器(QPD)。
[0012]所述上轉(zhuǎn)換發(fā)光信號檢測器可以是點式光電檢測器(如PMT和APD)，也可以采用成像器件(如CCD或CMOS等)。本發(fā)明中所有光電檢測器均具有將光信號轉(zhuǎn)化成電信號輸出的能力。
[0013]所述樣品池為覆蓋蓋玻片的載玻片，或無機高分子材料的透明容器，其體積為微升級。
[0014]使用上述裝置的定量檢測方法，包括步驟:
步驟一，利用微球特異性捕獲待測物，并用上轉(zhuǎn)換發(fā)光探針對富集于微球表面的待測物進行標(biāo)記，形成微球-待測物-上轉(zhuǎn)換發(fā)光探針復(fù)合物，即富集待測物的微球；
步驟二，將富集待測物的微球置于樣品池中，利用物鏡聚焦近紅外半導(dǎo)體激光器產(chǎn)生的滿足上轉(zhuǎn)換發(fā)光探針激發(fā)條件的激光束并于樣品池中形成光鑷；
步驟三，利用電動平移臺移動樣品池，捕獲富集待測物的微球，散射光檢測器同步檢測來自樣品池的散射光；當(dāng)檢測到的散射光強度達到預(yù)設(shè)閾值時，電動平移臺停止移動，開始進行上轉(zhuǎn)換發(fā)光信號的檢測；
步驟四，根據(jù)上轉(zhuǎn)換發(fā)光檢測器檢測到的上轉(zhuǎn)換發(fā)光強度對待測物進行定量分析。
[0015]所述待測物為金屬離子、生物分子或病毒粒子等多種可以通過特異性生物親和或化學(xué)偶聯(lián)方式富集到微球表面的待測成分。
[0016]所述微球為透明的無機微球或透明的高分子微球，無機微球可以是二氧化硅等材料制備的微球，高分子微球可以是聚苯乙烯等材料制備的微球。
[0017]所述的上轉(zhuǎn)換發(fā)光探針為稀土摻雜的上轉(zhuǎn)換發(fā)光納米粒子。
[0018]本發(fā)明檢測方法可以采用多種方法特異性富集待測物。如通過雙抗免疫夾心法，利用微球和上轉(zhuǎn)換發(fā)光探針特異性識別并捕獲待測物，形成微球一待測物一上轉(zhuǎn)換發(fā)光探針復(fù)合物；然后通過聚焦近紅外激光的電控樣品池的二維自動精密移動和采用Qro檢測器定量監(jiān)測微球表面散射光以逐一捕獲多個復(fù)合物微球，同時利用上轉(zhuǎn)換發(fā)光檢測器對復(fù)合物微球進行上轉(zhuǎn)換發(fā)光探測以實現(xiàn)待測物的定量分析。
[0019]本發(fā)明裝置采用的光鑷捕獲和上轉(zhuǎn)換發(fā)光平臺為顯微鏡，采用二維電動平移臺達到移動樣品的需求。同時，本發(fā)明檢測方法用不同上轉(zhuǎn)換發(fā)光探針來標(biāo)記用微球富集的不同待測物，采用高靈敏度點式光電檢測器檢測單個微球的上轉(zhuǎn)換發(fā)光信號的強度，也可采用成像器件獲取單個微球的上轉(zhuǎn)換發(fā)光圖像。
[0020]與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有以下特點和有益效果:
1、本發(fā)明裝置將光鑷技術(shù)和上轉(zhuǎn)換發(fā)光技術(shù)結(jié)合，提出一種新型的定量檢測裝置，該裝置可對多種待測成分進行定量檢測。
[0021]2、本發(fā)明檢測方法具有靈敏度高、選擇性好、速度快、樣品用量少且無需預(yù)處理等優(yōu)勢。
[0022]3、本發(fā)明裝置采用的980nm近紅外激光不會激發(fā)生物體系中的自發(fā)熒光，避免了自發(fā)熒光的干擾，顯著提高了檢測的信背比，從而提高檢測靈敏度，因此可適用于復(fù)雜樣品中的多種成分的檢測，無需分離待測微球，有效簡化了檢測流程。
【附圖說明】
[0023]圖1為本發(fā)明裝置光路及結(jié)構(gòu)示意圖； 圖2為工作曲線示意圖。
【具體實施方式】
[0024]如圖1所示，一種基于近紅外光鑷定量檢測裝置，包括近紅外半導(dǎo)體激光器，所述近紅外半導(dǎo)體激光器發(fā)出激光束經(jīng)單模光纖、光纖準(zhǔn)直器后，由望遠鏡透鏡組擴束，再經(jīng)過二向色鏡反射進入物鏡后瞳，經(jīng)物鏡聚集在樣品池中形成光鑷，光阱中微球的前向散射光經(jīng)過聚光鏡，再由二向色鏡反射，透鏡匯聚后，照射到散射光檢測器上；
光阱中微球的上轉(zhuǎn)換發(fā)光經(jīng)阻擋濾光片和透鏡后，通過針孔照射到上轉(zhuǎn)換發(fā)光檢測器上。
[0025]本發(fā)明的近紅外半導(dǎo)體激光器產(chǎn)生的激光束經(jīng)準(zhǔn)直鏡和望遠鏡透鏡組(L1，L2)調(diào)整光束匯聚程度，使激光束充滿物鏡的后瞳，經(jīng)望遠鏡透鏡組調(diào)整后的激光束射入二向色鏡(DM) ο
[0026]二向色鏡反射激光進入合適數(shù)值孔徑的物鏡，經(jīng)物鏡聚焦在樣品池底部并形成光阱即光鑷。來自微球的散射光信號(波長和激光相同)經(jīng)過聚光鏡匯聚為平行光，再由DM反射，經(jīng)過透鏡L3匯聚，落射到散射光檢測器上。
[0027]本發(fā)明中采用高數(shù)值孔徑物鏡。本發(fā)明中的樣品池為蓋玻片或材質(zhì)為無機高分子透明材料的微小容器。
[0028]二向色鏡DM為短通濾光片，可以透過可見光，反射近紅外光。因此激光束被二向色鏡DM反射至物鏡聚焦形成光鑷；由樣品池中微球散射的近紅外前向散射光信號經(jīng)過聚光鏡的匯聚，由一個同樣的二向色鏡DM反射，經(jīng)過透鏡L3聚焦落射到散射光檢測器。同時，由微球表面返回的位于可見光區(qū)的上轉(zhuǎn)換發(fā)光信號則透過DM，通過阻擋濾光片(BF)和聚焦鏡L4聚焦后，通過針孔并由上轉(zhuǎn)換發(fā)光檢測器進行檢測。
[0029]本裝置采用二維電動平移臺來實現(xiàn)多微球的逐一快速捕獲和上轉(zhuǎn)換發(fā)光測定，且捕獲和上轉(zhuǎn)換發(fā)光檢測可以同時進行。
[0030]當(dāng)樣品池內(nèi)溶液中存在一定濃度的微球一待測物一上轉(zhuǎn)換發(fā)光探針復(fù)合物微球，且光阱力足夠時，移動中的某一微