專利名稱：一種胃蛋白酶原Ⅰ的光激發(fā)化學發(fā)光檢測方法及試劑盒的制作方法
技術(shù)領域：
本發(fā)明涉及ー種血清(血漿)中胃蛋白酶原I的快速、定量、均相檢測方法及試劑盒，屬于體外試劑診斷領域中血清(漿)抗原的光激發(fā)化學發(fā)光免疫檢測分析方法，用于實施疾病診斷和治療方法的儀器或裝置，屬于光激發(fā)化學發(fā)光免疫分析技術(shù)領域。
背景技術(shù)：
胃蛋白酶原I (簡稱PG I )是反映胃部狀態(tài)的功能性指標——胃蛋白酶無活性前體，PG I由胃底腺的主細胞、頸黏液細胞分泌，大部分進入胃腔，少量進入血液循環(huán)，而胃是PG I的唯一來源，因此PG I水平的變化可以反映胃粘膜狀態(tài)和細胞數(shù)量的改變。國內(nèi)外臨床研究指出，PG I升聞，提不胃黏I旲破損可能性尚，患胃潰瘍、胃炎的風險增加；PG I降低，則患有萎縮性胃炎的可能性明顯增加，甚至有患胃癌的風險。測定PG I含量有助檢測出胃潰瘍、萎縮性胃炎、胃炎、胃癌等其他消化道疾病，供臨床檢測和體檢篩查需求。國內(nèi)外學者對胃癌患者的血清PG變化作了大量研究指出胃癌患者的血清PG含量急劇降低，低分化癌患者PG I含量更低于分化較高的胃癌患者；有數(shù)據(jù)顯示，在被確診的胃癌患者中，檢測他們幾年前的血樣品可以發(fā)現(xiàn)，1/3的患者在當時還健康的情況下血清PG水平已經(jīng)降低；PG I與PG I /PG II比值并聯(lián)使用靈敏度高，可有效應用于胃癌高發(fā)區(qū)人群的初歩篩查。因此，PG檢測被稱為胃部的“血清學活檢”，作為非侵入性方法，降低患者痛苦，簡便、經(jīng)濟，具有普查價值。在人群胃病篩查中，每個人做胃鏡是不現(xiàn)實的，可通過非侵入性血清PG檢測將淺表性胃炎、糜爛性胃炎、胃潰瘍、十二指腸潰瘍、胃癌等高危人群篩查出來，再進行胃鏡檢查是ー種切實可行的方案。光激發(fā)化學發(fā)光免疫分析技術(shù)是以納米級高分子微粒為基礎的新一代化學發(fā)光免疫技術(shù)，該項技術(shù)前景廣闊，將被廣泛地應用于研究生物分子的相互作用。又稱為AlphaLISA分析法，被譽為免洗的ELISA。其主要原理是由光激發(fā)產(chǎn)生的均相化學發(fā)光技術(shù)，它具有快速、均相(免洗)、高靈敏、量程寬和操作簡便的特點。該試劑由含有感光化合物的感光微粒和含有發(fā)光化合物的發(fā)光微粒組成，微粒直徑約188nm，表面覆蓋多糖水凝膠。水凝膠能減少非特異性結(jié)合，同吋，增加微粒的懸浮性。微粒通過水凝膠表面的功能團與生物分子共價連接。納米級微粒大大增加了反應的表面積，每個微粒表面覆蓋著成百上千個生物分子，可捕獲目標分子。該技術(shù)的核心原理是單線態(tài)氧的產(chǎn)生和傳遞。在受到紅色激光(680nm)照射后，感光微粒能使周圍環(huán)境中的氧轉(zhuǎn)化為單線態(tài)氧，單線態(tài)氧的生存時間僅為4微秒。短暫的生存時間決定了單線態(tài)氧的傳播直徑很小(約為200nm)。如果發(fā)光微粒在200nm范圍之內(nèi)就能接受單線態(tài)氧，并發(fā)出高能級的光(520nm-620nm)。反之，單線態(tài)氧就會回落到基態(tài)氧而沒有信號產(chǎn)生。這種依賴于兩種微粒相互接近的化學能量傳遞是均相反應的基礎。通常在該反應體系中，微粒的濃度是很低的。兩種微粒相互隨機碰撞的幾率很低，因此，反應體系的本底非常微弱。如果包被在微粒表面的生物分子相互作用，拉近了兩個微粒的距離，例如形成免疫夾心或受體-配體復合物，這樣就能產(chǎn)生能量的有效傳遞并發(fā)出光信號。生物素-鏈霉親和素與免疫分析試劑偶聯(lián)起來，可大大提高免疫分析的測定靈敏度因為鏈霉親和素與生物素之間極高的親和力，使反應結(jié)合更牢固穩(wěn)定，而且特異性高；每個鏈霉親和素(親和素)可結(jié)合4個生物素，可使反應明顯放大、減少反應中的空間位阻。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供ー種新型的PG I光激發(fā)化學發(fā)光免疫檢測分析方法及試劑盒，運用生物素-鏈霉親和素(包括親和素)的放大效應和先進的光激發(fā)化學發(fā)光免疫檢測技術(shù)，將雙抗夾心法的信號放大，達到高靈敏、特異性好、量程范圍寬、反應時間短的目的。本發(fā)明的技術(shù)方案ー種血清胃蛋白酶原I光激發(fā)化學發(fā)光檢測方法，基于光激發(fā)化學發(fā)光免疫分析法，將鏈霉親和素一生物素放大系統(tǒng)引入胃蛋白酶原I雙抗夾心體系中，在白色不透明微孔板中加入包被有抗胃蛋白酶原I的一株高效價單抗的發(fā)光微粒和連有生物素的抗胃蛋白酶原I的另ー株單克隆抗體溶液，及胃蛋白酶原I標準品或樣品，避光反應，隨后加入包被有鏈霉親和素的感光微粒，孵育后檢測。所述的胃蛋白酶原I光激發(fā)化學發(fā)光檢測方法所用的試劑盒，由白色不透明微孔板(1)，胃蛋白酶原I標準品(2)，連有抗胃蛋白酶原I單克隆抗體的發(fā)光微粒(3)，生物素化抗胃蛋白酶原I單克隆抗體溶液(4)和包被有鏈霉親和素的感光微粒(5)組成，胃蛋白酶原I標準品濃度范圍0-300ng/mL。將ー株抗PG I抗體與發(fā)光微粒偶聯(lián)，另ー株抗PG I抗體與生物素連接，在均相體系中形成感光微粒-抗體-抗原-抗體-生物素的復合物。通過鏈霉親和素，感光微粒與雙抗夾心復合物免疫夾心，實現(xiàn)感光微粒與發(fā)光微粒的特異性接近，從而實現(xiàn)能量傳遞，發(fā)出熒光信號，并被儀器測量出來。本發(fā)明的有益效果一、靈敏度高，檢測至2. Ong/mL ;ニ、量程寬，血清(衆(zhòng))樣本不需要稀釋，樣品濃度值介于0-300ng/mL的都能準確檢測；三、檢測時間短，從樣品孵育到檢測,約0. 5小時完成；四，樣品需求量少,一次上樣只需20ML。


圖I :PG I光激發(fā)化學發(fā)光免疫檢測分析試劑盒的組成示意 I、白色不透明微孔板，2、PG I標準品ー套，3、包被有PG I單抗的發(fā)光微粒，4、生物素化PG I單抗試劑，5、包被有鏈霉親和素的感光微粒。圖2 :PG I光激發(fā)化學發(fā)光免疫反應原理示意圖。圖3 :PG I光激發(fā)化學發(fā)光免疫反應標準曲線圖。
具體實施例方式實施例I
包被有PG I單抗的發(fā)光微粒制備
在離心管中加入Img發(fā)光微粒，加入12. 5 ML 1% Tween-20,0. 05 mg PG I單抗，IOML硼氫化氰鈉，用0. lM、pH 6. 0的2-(N-嗎啉)こ磺酸(MES)緩沖液將體積補充到200ML，37°C避光振蕩反應48小吋。加入IOML 0.3 M pH 5. 0的羧甲氧基胺半鹽酸鹽(CMO)溶液封閉未結(jié)合位點，37°C避光孵育I小時后離心，分離得到已連接PG I單抗的發(fā)光微粒，稀釋后備用。PG I光激發(fā)化學發(fā)光檢測試劑盒的制備 試劑盒的組成*
(I)、白色不透明微孔板(12X8孔，可以拆分為單孔)。(2)、1X包被有PG I單抗的發(fā)光微粒(50Pg/mL) :2mL。(3)、6XPG I 標準品，0. 5mL/ 瓶，標準液濃度為:0，10，50，100，200，300ng/mL。(4)、I X 生物素化抗 PG I 單抗溶液(10Pg/mL)，2mL。(5)、I X包被有鏈霉親和素的感光微粒(20l^g/mL) :20mL。在所有恒溫孵育過程中，避免光線照射。PG I光激發(fā)化學發(fā)光檢測步驟
取包被有PG I單抗的發(fā)光微粒、PG I標準品或處理好的樣品、一定濃度的生物素化抗PG I單抗三種試劑，各20ML加到白色不透明微孔板，37°C孵育20分鐘；加入175ML包被有鏈霉親和素的感光微粒，37°C孵育10分鐘；在光激化學發(fā)光檢測儀上檢測光信號。結(jié)果處理根據(jù)標準品濃度和對應熒光值繪制標準曲線，將樣品的熒光值代入標準曲線中，計算得到樣品中PG I含量。表I :顯不PG I光激發(fā)化學發(fā)光檢測結(jié)果,其中第一列代表PG I濃度,第二列代表熒光計數(shù)值(cps)，夾心法測試實驗結(jié)果如下表所示。表I :PG I光激發(fā)化學發(fā)光檢測結(jié)果_
權(quán)利要求
1.ー種血清胃蛋白酶原I光激發(fā)化學發(fā)光檢測方法，其特征在于基于光激發(fā)化學發(fā)光免疫分析法，將鏈霉親和素一生物素放大系統(tǒng)引入胃蛋白酶原I雙抗夾心體系中，在白色不透明微孔板中加入包被有抗胃蛋白酶原I的一株高效價單抗的發(fā)光微粒和連有生物素的抗胃蛋白酶原I的另ー株單克隆抗體溶液，及胃蛋白酶原I標準品或樣品，避光反應，隨后加入包被有鏈霉親和素的感光微粒，孵育后檢測。
2.權(quán)利要求I所述的胃蛋白酶原I光激發(fā)化學發(fā)光檢測方法所用的試劑盒，其特征在干由白色不透明微孔板(1)，胃蛋白酶原I標準品(2)，連有抗胃蛋白酶原I單克隆抗體的發(fā)光微粒(3)，生物素化抗胃蛋白酶原I單克隆抗體溶液(4)和包被有鏈霉親和素的感光微粒(5)組成，胃蛋白酶原I標準品濃度范圍0-300ng/mL。
全文摘要
一種胃蛋白酶原Ⅰ的光激發(fā)化學發(fā)光檢測方法及試劑盒，屬于光激發(fā)化學發(fā)光免疫分析技術(shù)領域。本發(fā)明方法為微量的胃蛋白酶原Ⅰ標準品或樣品、包被有抗胃蛋白酶原Ⅰ一株高效價單抗的發(fā)光微粒和生物素化抗胃蛋白酶原Ⅰ的另一株單克隆抗體，在微孔板中避光反應，隨后加入包被有鏈霉親和素的感光微粒，孵育后檢測。本發(fā)明應用光激發(fā)化學發(fā)光原理，在特定波長激發(fā)下，通過單線態(tài)離子氧的產(chǎn)生和傳遞，將能量傳遞給發(fā)光微粒產(chǎn)生熒光，儀器檢測獲得數(shù)據(jù)。利用生物素-鏈霉親和素的放大效應和高效價的單克隆抗體，及光激化學發(fā)光原理特性，達到反應時間很短、上樣量少、靈敏度高、特異性好、測量范圍寬，操作簡單，便于臨床使用，利于大規(guī)模推廣應用。
文檔編號G01N33/577GK102654499SQ201210151530
公開日2012年9月5日 申請日期2012年5月16日 優(yōu)先權(quán)日2012年5月16日
發(fā)明者周彬, 張玨, 張藝, 朱嵐, 王柯, 黃飚 申請人:無錫市江原實業(yè)技貿(mào)總公司, 江蘇省原子醫(yī)學研究所