本發(fā)明屬于藥物負(fù)載的制備領(lǐng)域，特別涉及一種負(fù)載吲哚菁綠的鋰皂石納米顆粒icg/lap的制備方法。

背景技術(shù)：

傳統(tǒng)的腫瘤治療方法主要有手術(shù)、放療、化療等，但都有較大副作用。相較于傳統(tǒng)治療，光熱治療因?qū)φ＜?xì)胞傷害較小具有一定優(yōu)勢(shì)。吲哚菁綠(icg)是目前唯一被美國(guó)食品藥物管理局(fda)批準(zhǔn)用于臨床的近紅外成像試劑，是一種具有近紅外特征吸收峰的三碳花菁染料，最大發(fā)射波長(zhǎng)在795～845nm之間。人體組織在近紅外700至1100nm區(qū)域具有最低的吸收系數(shù)，光穿透生物組織最深，因此icg作為光熱試劑用于癌癥的光熱治療，對(duì)人體正常細(xì)胞無(wú)害，不會(huì)造成腫瘤細(xì)胞的耐藥性，不僅能夠與化學(xué)藥物治療結(jié)合提高治療效率，還可以利用光聲效應(yīng)用于腫瘤的光聲成像。與無(wú)機(jī)光熱試劑相比，吲哚菁綠在近紅外的吸光能力特別強(qiáng)，在780nm近紅外激光的照射下，相同質(zhì)量的吲哚菁綠吸收光的能力是單壁碳納米管的7倍多，是納米金棒的8500倍以上(m，y.eta1.cancerres，1986，46(12)，6387-6392)。但是icg在水溶液中的不穩(wěn)定性、在體內(nèi)的快速清除等缺陷限制了它的應(yīng)用。因此，找到合適的載體用來(lái)負(fù)載icg，提高icg在體內(nèi)的穩(wěn)定性和光熱轉(zhuǎn)換效率，成為實(shí)現(xiàn)icg腫瘤診療應(yīng)用的關(guān)鍵。

鋰皂石(lap)是一類人工合成的粘土類納米顆粒，具有良好的生物相容性，并且被證實(shí)可以高效負(fù)載藥物，并實(shí)現(xiàn)藥物的控制釋放，在藥物輸送領(lǐng)域展現(xiàn)了獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)(wu.y.l.eta1.j.mater.chem.b.2014，2，7410-7418)。

查閱國(guó)內(nèi)外相關(guān)文獻(xiàn)或?qū)＠?，?fù)載吲哚菁綠的鋰皂石納米顆粒icg/lap的制備方法未見報(bào)道。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明所要解決的技術(shù)問(wèn)題是提供一種負(fù)載吲哚菁綠的鋰皂石納米顆粒icg/lap的制備方法，lap與icg的質(zhì)量比為9：2；icg的上載效率約為94.1％；icg/lap紫外吸收峰發(fā)生紅移，光、熱穩(wěn)定性提高。

本發(fā)明的一種負(fù)載吲哚菁綠的鋰皂石納米顆粒icg/lap的制備方法，包括：

(1)將icg粉末溶于超純水中，并在常溫下避光磁力攪拌使其均勻分散成icg水溶液；

(2)將ph＝5.0的醋酸鹽緩沖液加入lap水溶液中，接著將icg水溶液逐滴到lap水溶液，室溫避光磁力攪拌反應(yīng)，離心純化得到icg/lap納米顆粒。

所述步驟(1)中避光攪拌為磁力攪拌速率為800-900r/min，時(shí)間為3-6min，優(yōu)選5min。

所述步驟(1)中icg水溶液的濃度為2mg/ml。

所述步驟(2)中l(wèi)ap溶液的濃度為6mg/ml。

所述步驟(2)中l(wèi)ap與icg的質(zhì)量比為9：1-3，優(yōu)選質(zhì)量比為9:2。

所述步驟(2)中緩沖溶液為ph＝5.0的醋酸鹽緩沖液。

所述醋酸鹽緩沖液由濃度為0.2mol/l的naac和濃度為0.3mol/l的hac制成，醋酸鹽緩沖液體積為lap水溶液體積的2倍。

所述步驟(2)中攪拌反應(yīng)為磁力攪拌反應(yīng)2-5h，優(yōu)選反應(yīng)時(shí)間為4h，攪拌速率為800-900r/min。

所述步驟(2)中離心純化轉(zhuǎn)速為8000r/min，時(shí)間為10min。

lap與icg的質(zhì)量比為9：2，所得到的icg/lap納米顆粒中，icg的負(fù)載效率為94.1％。

本發(fā)明以具有獨(dú)特層狀空間結(jié)構(gòu)的lap為載體實(shí)現(xiàn)對(duì)光熱試劑icg的高效負(fù)載，提高了icg在水溶液中的穩(wěn)定性和光熱轉(zhuǎn)換效率，而且納米尺寸的icg/lap顆粒能夠在體內(nèi)具有較長(zhǎng)的循環(huán)時(shí)間，并通過(guò)epr效應(yīng)富集在腫瘤部位。通過(guò)近紅外激光對(duì)腫瘤局部的照射，提高體系對(duì)腫瘤的光熱治療效果。

以lap為載體負(fù)載icg不僅能夠提高icg光、熱穩(wěn)定性、溶液穩(wěn)定性及在體內(nèi)的穩(wěn)定性，還有望增強(qiáng)光熱效果并借助icg/lap納米粒子的尺寸優(yōu)勢(shì)實(shí)現(xiàn)腫瘤的被動(dòng)靶向，在腫瘤組織富集、實(shí)現(xiàn)良好的光熱治療效果。

本發(fā)明經(jīng)篩選最優(yōu)負(fù)載條件后，再使用xrd(x射線衍射)、動(dòng)態(tài)光散射dls(zeta表面電勢(shì)測(cè)量)、uv-vis(紫外可見光譜)、tga(熱失重分析法)、光熱循環(huán)測(cè)試等方法表征本發(fā)明制備的具體測(cè)試結(jié)果如下：

(1)最優(yōu)負(fù)載條件篩選

為了探索lap負(fù)載icg的最優(yōu)負(fù)載條件，采用不同溶劑進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，結(jié)果如圖1所示。ph＝5.0醋酸鹽緩沖液條件下反應(yīng)后，經(jīng)離心，上層溶液為澄清無(wú)色液體。隨后，將純lap及純icg與負(fù)載了icg的lap納米顆粒在ph＝5.0醋酸鹽緩沖液中經(jīng)相同條件離心。純lap與純icg離心后未見沉淀，負(fù)載有icg的lap產(chǎn)生沉淀。因此可知在ph＝5.0醋酸鹽緩沖液條件下，lap能夠?qū)崿F(xiàn)對(duì)icg的高效負(fù)載。

(2)xrd(x射線衍射)

為了探究lap對(duì)icg的負(fù)載機(jī)理，我們進(jìn)行了xrd測(cè)試。圖2和表1給出了lap與icg/lap的xrd分析結(jié)果。負(fù)載icg后，除(001)晶面外，lap其他各晶面的位置以及晶面間距沒有明顯改變；而(001)晶面的衍射角明顯變小(從5.98°降低到4.34°)，晶面距離明顯增大(從增加到)，這證明icg分子是按照其苯環(huán)平行于lap(001)晶面的方式整齊排列于lap內(nèi)層，形成了lap/icg/lap的夾層結(jié)構(gòu)而使晶面間距增加。此外，icg/lap的衍射圖譜中出現(xiàn)了一系列新的dox晶體的衍射峰(20°到30°之間)，也證明了icg已經(jīng)成功負(fù)載到了lap的片層結(jié)構(gòu)中。

表1lap、icg/lap的衍射角和晶面間距數(shù)據(jù)

(3)dls(zeta表面電勢(shì)測(cè)量)

研究載藥前后lap的粒徑以及表面電勢(shì)均通過(guò)dls進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果如表2所示。負(fù)載icg后，鋰皂石的表面電勢(shì)從-32.5mv增長(zhǎng)到-16.1mv，同時(shí)粒徑略有增加(62.79nm增大到120.1nm)，并且pdi為0.316。結(jié)果表明，鋰皂石已經(jīng)成功負(fù)載了icg，并且藥物對(duì)納米顆粒的性質(zhì)影響較小，載藥顆粒仍具有較好的穩(wěn)定性和分散性。

表2lap、icg/lap的水合直徑和表面電勢(shì)

(4)uv-vis(紫外-可見光譜測(cè)試)

研究icg的負(fù)載效率及負(fù)載前后icg的性質(zhì)變化，進(jìn)行了uv-vis測(cè)試，結(jié)果如圖3所示。icg的紫外吸收峰位于784nm，本發(fā)明中制備得到的icg/lap紫外吸收峰位于831nm，吸收峰發(fā)生了紅移。這一結(jié)果也證實(shí)icg與lap之間具有較強(qiáng)的相互作用，說(shuō)明icg已被成功負(fù)載在鋰皂石上。附圖3中icg/lap的吸收峰比純icg吸收峰強(qiáng)度更強(qiáng)，這表明本發(fā)明中制備得到的icg/lap顆粒具有更好的近紅外光吸收性能。通過(guò)紫外吸收標(biāo)準(zhǔn)曲線定量分析，在投料比為lap：icg＝9：2的條件下，icg的負(fù)載效率為94.1％，負(fù)載率為17.3％。

(5)tga(熱重分析法)

圖4為lap與負(fù)載icg的icg/lap納米顆粒在室溫升溫到900℃過(guò)程中的失重情況。曲線中溫度低于150℃的lap與icg/lap均存在少量失重，主要源于中吸附的水分子的損失。繼續(xù)升溫到900℃過(guò)程中，lap幾乎沒有重量損失，而icg/lap的失重由91.2％降至75.4％，主要是由于負(fù)載在lap內(nèi)部icg的分解引起的。icg/lap的失重率為17.3％，說(shuō)明載藥體系中icg的載藥量約為17.3％，這與紫外-可見光譜方法測(cè)定的結(jié)果相符。

(6)光熱轉(zhuǎn)換性能測(cè)試

為驗(yàn)證負(fù)載后icg的光熱轉(zhuǎn)換性能，將含相同濃度icg的icg/lap顆粒與純icg經(jīng)808nm近紅外激光照射3min，照射過(guò)程中溫度變化經(jīng)熱電偶記錄，結(jié)果如圖5所示。在相同條件下，icg/lap在近紅外激光照射后溫度升高了26.7℃，而icg溫度升高了20.3℃。icg/lap在808nm激光照射下能引起溶液溫度的明顯增高，效果優(yōu)于相同濃度的icg水溶液，說(shuō)明本發(fā)明中制備得到的icg/lap顆粒具有優(yōu)異的光熱轉(zhuǎn)換性能。

(7)光熱穩(wěn)定性能測(cè)試

為了考察icg/lap納米材料的光熱穩(wěn)定性，將含相同濃度icg的icg/lap顆粒與純icg經(jīng)近紅外激光照射升溫循環(huán)3次測(cè)試，結(jié)果如圖6所示。icg/lap顆粒循環(huán)3次在近紅外激光照射下，溫度分別升高至52.5℃，52.1℃，51.0℃；icg循環(huán)3次在近紅外激光照射升溫，溫度分別升高至50.5℃，49.4℃，47.1℃。在激光照射多次后，icg/lap顆粒仍能具有較高的光熱轉(zhuǎn)換性能，說(shuō)明icg/lap具有優(yōu)于icg的光熱穩(wěn)定性，有望應(yīng)用于多次光熱治療。

綜合以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以認(rèn)為，本發(fā)明所報(bào)道的icg/lap顆粒提高了icg的光穩(wěn)定性與溶液穩(wěn)定性，增強(qiáng)了icg的光熱轉(zhuǎn)換效率，具有良好的應(yīng)用前景。

有益效果

(1)本發(fā)明所報(bào)道的icg/lap顆粒，提高了icg的光穩(wěn)定性與溶液穩(wěn)定性，有望實(shí)現(xiàn)icg的多次光熱治療；

(2)本發(fā)明制備方法簡(jiǎn)單，反應(yīng)條件溫和，成本低廉，易于操作，具有產(chǎn)業(yè)化實(shí)施的前景。

附圖說(shuō)明

圖1為lap，icg，icg/lap離心后的圖片；

圖2為lap(a)，icg/lap(b)的xrd分析圖譜；

圖3為lap，icg，icg/lap的紫外吸收光譜圖；

圖4為lap，icg/lap的熱失重曲線；

圖5為lap，icg，icg/lap光熱升溫曲線；

圖6為icg，icg/lap循環(huán)光熱升溫曲線；

圖7為icg/lap納米顆粒合成示意圖。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實(shí)施例僅用于說(shuō)明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。此外應(yīng)理解，在閱讀了本發(fā)明講授的內(nèi)容之后，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以對(duì)本發(fā)明作各種改動(dòng)或修改，這些等價(jià)形式同樣落于本申請(qǐng)所附權(quán)利要求書所限定的范圍。

實(shí)施例1

(1)將2mgicg水溶液溶于1ml超純水中，并在常溫下避光磁力攪拌5min使其均勻分散成icg水溶液；

(2)將ph＝5.0的醋酸鹽緩沖液3ml加入1.5ml6mg/mllap水溶液中，接著將icg水溶液逐滴到lap水溶液，使lap與icg質(zhì)量比為9：2。室溫避光磁力攪拌反應(yīng)4h后，8000r/min,10min離心純化得到icg/lap納米顆粒。

實(shí)施例2

取實(shí)施例1中制備的icg/lap，溶劑為超純水，經(jīng)凍干干燥后與lap分別進(jìn)行xrd測(cè)試，其衍射峰及峰面積均發(fā)生改變，參見圖2。

實(shí)施例3

取150μg/ml實(shí)施例1中制備的icg/lap，溶劑為超純水，測(cè)其紫外-可見吸收光譜，從譜圖中可見其峰型一致且良好，參見圖3。并通過(guò)紫外標(biāo)準(zhǔn)曲線定量，得到icg上載效率。同時(shí)測(cè)定實(shí)施例1中icg溶液的紫外-可見吸收光譜。

實(shí)施例4

取實(shí)施例1中制備的icg/lap，溶劑為超純水，經(jīng)凍干干燥后與lap分別進(jìn)行tga測(cè)試。樣品經(jīng)熱分析儀，升溫速度為10℃/min，采用流量為60ml/min的n2保護(hù)，記錄30℃-900℃升溫區(qū)間內(nèi)樣品失重曲線，計(jì)算失重率，計(jì)算負(fù)載率。

實(shí)施例5

取實(shí)施例1中制得的icg/lap與icg溶液各100μl(cicg＝0.1mg/ml)，溶劑為超純水，經(jīng)808nm，1.2w近紅外激光照射3min，熱電偶記錄溫度變化。

實(shí)施例6

取實(shí)施例1制得的icg/lap與icg溶液各100μl(cicg＝0.1mg/ml)，溶劑為超純水，經(jīng)808nm，1.2w近紅外激光照射3min，自然降溫至室溫，再次照射使升溫，熱電偶記錄溫度變化。