(-)-γ-內(nèi)酰胺酶、基因、突變體、載體及其制備與應(yīng)用
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種(?)?γ?內(nèi)酰胺酶、其基因及突變體，含有該基因及突變體的重組表達(dá)質(zhì)粒和重組表達(dá)轉(zhuǎn)化體，該重組(?)?γ?內(nèi)酰胺酶的制備，以及該(?)?γ?內(nèi)酰胺酶在制備(+)?γ?內(nèi)酰胺中的應(yīng)用。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的(?)?γ?內(nèi)酰胺酶具有酶活性高、底物濃度耐受性好的特點，使用該酶催化制備(+)?γ?內(nèi)酰胺具有反應(yīng)條件溫和、底物濃度高、催化劑用量少等優(yōu)勢，因此在碳環(huán)核苷類藥物中間體(+)?γ?內(nèi)酰胺的工業(yè)生產(chǎn)中具有很好的應(yīng)用前景。
【專利說明】
(-)-γ -內(nèi)酰胺酶、基因、突變體、載體及其制備與應(yīng)用
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明屬于生物工程技術(shù)領(lǐng)域，尤其是涉及一種(-)-γ-內(nèi)酰胺酶、其基因及突變 體，含有該基因及突變體的重組表達(dá)質(zhì)粒和重組表達(dá)轉(zhuǎn)化體，該重組(-)-γ-內(nèi)酰胺酶的制 備，以及該(-)-γ-內(nèi)酰胺酶在制備(+)-γ-內(nèi)酰胺中的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] γ-內(nèi)酰胺是化合物2-氮雜二環(huán)[2.2.1]庚-5-烯-3-酮的簡稱（亦俗稱為文斯內(nèi) 酯），其分子式為UHyNOj-內(nèi)酰胺的兩個對映異構(gòu)體都是有用的醫(yī)藥中間體，其中(-)-γ-內(nèi)酰胺可用于合成抗逆轉(zhuǎn)錄病毒藥物阿巴卡韋和抗流感病毒藥物帕拉米韋；而( + )-γ-內(nèi) 酰胺可用于合成趨化因子受體CCR2拮抗劑ΜΚ-0812和二肽基肽酶抑制劑美羅利汀。
[0003] 采用生物催化法制備( + )-γ-內(nèi)酰胺或(-)-γ-內(nèi)酰胺，一般采用的是水解酶，目 前對(+)-γ-內(nèi)酰胺酶研究比較廣泛，其中許多已被用于(-)-γ-內(nèi)酰胺的制備。例如:來源 于Comamonas acidovorans的( + )-γ -內(nèi)酰胺酶能有效地催化拆分4.6M(500g L-D的消旋體 γ-內(nèi)酰胺，剩余的（-)-γ-內(nèi)酰胺 ee 值 >98 % (Bioorg.Med.Chem ·，1999,7,2163-2168)0 200g I/1纖維素固定化的來源于嗜熱菌Sulfolobus solfataricus的( + )- γ -內(nèi)酰胺酶能有 效地催化拆分〇.6M(65g I/1)的消旋γ -內(nèi)酰胺，9h時消旋γ -內(nèi)酰胺的轉(zhuǎn)化率達(dá)到49.5%， 剩余(_)_ y _內(nèi)酰胺的ee值可達(dá)到99 · 5%。將Sulfolobus solfataricus的（ + )- γ -內(nèi)酰胺 酶通過大腸桿菌表面展示技術(shù)固定在大腸桿菌細(xì)胞表面后，40g I/1的重組細(xì)胞可以催化 0 · 92M( 100g L-1)消旋 γ -內(nèi)酰胺（Appl .Microbiol · Biotechnol ·，2014，98,6991-7001)的水 解拆分，4h時轉(zhuǎn)化率達(dá)到49.5 %，（-)- γ -內(nèi)酰胺的ee值可達(dá)到99.5 %。250g L-1 (+)- γ -內(nèi) 酰胺固定化酶RutB可催化2.0M(218g L-〇消旋γ-內(nèi)酰胺的水解拆分，4h轉(zhuǎn)化率可達(dá)到 50%，（-)- γ -內(nèi)酰胺的ee值可達(dá)到99.5% (Appl .Microbiol .Biotechnol · ,2015,99,4691-4700)。來源于Nocardia farcinica的酰胺酶NfpolyA在純酶上載量為0.25g L-1時，可催化 水解0.46M(50g L-1)的底物（ChemCatChem, 2014，6,2517-2521 )<a〇g L-1 的Baci 11 ius subtilisl68/pMA5-delm凍干細(xì)胞可以水解0.92M(100g L-〇消旋γ-內(nèi)酰胺，22.5h轉(zhuǎn)化率 可達(dá)到55.2%，（-)-γ-內(nèi)酰胺的ee 值達(dá)到99 % (Appl. Biochem. Biotechnol. ,2015,176， 1687-1699)。與(+)-γ-內(nèi)酰胺酶相比，（-)-γ-內(nèi)酰胺酶的研究較少，且目前已報道的(-)-γ-內(nèi)酰胺酶的研究重點主要集中于酶學(xué)性質(zhì)的表征，較少應(yīng)用于(+)-γ-內(nèi)酰胺的制備。 來源于Bradyrhizobium japonicum USDA 6的（-)-γ-內(nèi)酰胺酶在0.5mL反應(yīng)體系中拆分消 旋γ-內(nèi)酰胺，37°C反應(yīng)24h后，（ + )-γ-內(nèi)酰胺的ee值〉99% (中國發(fā)明專利，公開號CN 103966192六）。3(^ L-1商業(yè)化的Lipolase(CAL-B)在異丙醚-水兩相體系中，可以拆分0.2M (22.2g L-1)消旋 γ-內(nèi)酰胺（Eur.J.Org.Chem. ,2008,5263-5268;發(fā)明專利 W0 2009/ 007759A1)。經(jīng)戊二醛交聯(lián)的來源于Aureobacterium sp.的（-)-γ -內(nèi)酰胺酶，在連續(xù)化反 應(yīng)中可以拆分〇. 46M(50g L-1)消旋γ -內(nèi)酰胺，96h轉(zhuǎn)化率可達(dá)到50 %，（ +)- γ -內(nèi)酰胺的ee 值>99% (Tetrahedron-Asymmetry，1993，4，1117-1128)。這些酶都具有較高的立體選擇性， 反應(yīng)轉(zhuǎn)化率達(dá)到50%時，剩余的（ + )- γ -內(nèi)酰胺的ee值〉99%。盡管如此，由于這些酶活性 低，底物濃度耐受性差，因此難以大規(guī)模應(yīng)用。
[0004] 與傳統(tǒng)化學(xué)合成法相比，生物催化消旋γ -內(nèi)酰胺水解拆分制備(+)- γ -內(nèi)酰胺的 方法具有反應(yīng)條件溫和、環(huán)境友好、操作簡單等優(yōu)點，但是目前(+)-γ -內(nèi)酰胺的生物催化 合成方法僅限于實驗室規(guī)模，存在酶活性低、催化劑使用量大、產(chǎn)物濃度不高的缺陷，不適 合工業(yè)化生產(chǎn)。因此，需要篩選活性高、穩(wěn)定性好且能耐受高濃度產(chǎn)物/產(chǎn)物的酶，以滿足工 業(yè)化生產(chǎn)(+)-γ-內(nèi)酰胺的需求。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明針對現(xiàn)有技術(shù)中酶法制備( + )-γ-內(nèi)酰胺上的不足，提供了一種催化活性 高、熱穩(wěn)定性好、對映選擇性高以及底物耐受性高的（-)-γ -內(nèi)酰胺酶SvGL及其突變體，含 有該酶及突變體基因的重組表達(dá)質(zhì)粒和重組表達(dá)轉(zhuǎn)化體，重組SvGL及其突變體酶粉的制 備，以及在制備( + )- Y _內(nèi)酰胺中的應(yīng)用。
[0006] 本發(fā)明的目的可以通過以下技術(shù)方案來實現(xiàn)：
[0007]技術(shù)方案之一：
[0008] -種(-)-γ-內(nèi)酰胺酶，其是如下(a)或(b)的蛋白質(zhì)：
[0009]蛋白質(zhì)(a):如序列表中SEQ ID No. 2所不氣基酸序列構(gòu)成的蛋白質(zhì)；
[0010]蛋白質(zhì)(b):在(a)的氨基酸序列中經(jīng)過一個或幾個氨基酸取代且(-)-γ-內(nèi)酰胺 酶活性提高的衍生蛋白質(zhì)。
[0011 ] 所述蛋白質(zhì)(a)的制備可以是從產(chǎn)綠色鏈霉菌Streptomyces viridochromogenes CGMCC 4.692中分離獲得，或者從重組表達(dá)該(-)-γ -內(nèi)酰胺酶的轉(zhuǎn)化體中分離獲得，也可 以是人工合成獲得。
[0012] 所述產(chǎn)綠色鏈霉菌Streptomyces viridochromogenes CGMCC 4.692為本實驗室 從中國普通微生物菌種保藏管理中心購買，并自行保藏。本發(fā)明中，發(fā)明人對實驗室保藏的 100余株細(xì)菌進(jìn)行培養(yǎng)，培養(yǎng)液離心，取適量靜息細(xì)胞，懸浮于含有10mM消旋γ-內(nèi)酰胺的磷 酸鉀緩沖液(l〇〇mM，pH 7.0)中，振搖反應(yīng)，檢測水解反應(yīng)底物的轉(zhuǎn)化率，對這些菌株催化水 解反應(yīng)的活性進(jìn)行評價，其中Streptomyces viridochromogenes CGMCC 4.692表現(xiàn)出最好 的反應(yīng)效果。進(jìn)而采用鳥槍法對Streptomyces viridochromogenes CGMCC 4.692的（-)-γ-內(nèi)酰胺酶進(jìn)行了克隆，獲得一個具有高活性的重組(-)-γ-內(nèi)酰胺酶，命名為SvGL，其氨 基酸序列如序列表中SEQ ID No.2所示。
[0013] 所述蛋白質(zhì)（b)是在蛋白質(zhì)（a)的基礎(chǔ)上經(jīng)過一個或幾個氨基酸取代而得到的 (-)-γ -內(nèi)酰胺酶活性顯著提高的衍生蛋白質(zhì)。在篩選獲得高活性及高立體選擇性(-)-γ-內(nèi)酰胺酶SvGL的基礎(chǔ)上，發(fā)明人對野生型SvGL進(jìn)行蛋白質(zhì)改造，以進(jìn)一步提高該酶的活性。
[0014] 將野生型SvGL在Genebank數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行同源搜索，將獲得的序列進(jìn)行同源比對， 對保守位點進(jìn)行定點飽和突變，發(fā)現(xiàn)在SEQ ID No. 2所示氨基酸序列的基礎(chǔ)上對第188位的 苯丙氨酸進(jìn)行單點替換后，具有較高的(-)-γ-內(nèi)酰胺酶活性。此外通過對SvGL的活性口袋 和底物通道附近的氨基酸殘基進(jìn)行半理性設(shè)計和單點飽和突變，發(fā)現(xiàn)在SEQ ID No.2所示 氨基酸序列的第188位的苯丙氨酸進(jìn)行單點替換的基礎(chǔ)上對第130位的亮氨酸進(jìn)行單點替 換后，同樣具有更高的（-)-γ-內(nèi)酰胺酶活性。其中，將SEQ ID No.2所示氨基酸序列的第 188位的苯丙氨酸殘基替換為色氨酸殘基獲得的突變體蛋白SvGLF1884崔化(-)-γ-內(nèi)酰胺水 解的活性提高了 1.3倍。將SEQ ID No.2所示氨基酸序列第188位的苯丙氨酸殘基替換為色 氨酸殘基、第130位的亮氨酸殘基替換為異亮氨酸殘基獲得的突變體蛋白SvGLmoimssW崔化 (-)-γ-內(nèi)酰胺水解的活性提高了2.2倍，將SEQ ID No.2所示氨基酸序列第188位的苯丙氨 酸殘基替換為色氨酸殘基、第130位的亮氨酸殘基替換為酪氨酸殘基，獲得的突變體蛋白 SVGLl13qY/f188W催化(-) -γ -內(nèi)酰胺水解的活性提高了3 · 2倍。
[0015] 其中（-)-γ -內(nèi)酰胺酶的活性測定在30°C下進(jìn)行，反應(yīng)體系：10mM磷酸鉀緩沖液 (pH 7 · 0)、1 OmM的消旋γ -內(nèi)酰胺，及適量的（-)-γ -內(nèi)酰胺酶，反應(yīng)20min后，通過液相色譜 (HPLC)測定γ -內(nèi)酰胺的減少量從而確定初始反應(yīng)速率。一個酶活單位(U)的定義為在上述 反應(yīng)條件下，每分鐘催化水解1 .Owiiol的γ -內(nèi)酰胺所需要的酶量。
[0016] 技術(shù)方案之二：
[0017] -種分離的核酸，所述核酸是編碼如技術(shù)方案一所述(-)-γ-內(nèi)酰胺酶的核酸。具 體的，其是如下（1)或(2)的核酸：
[0018] (1)如序列表中SEQ ID No. 1所示核苷酸序列組成的核酸；
[0019] (2)編碼如下蛋白質(zhì)(a)或蛋白質(zhì)(b)的核酸：
[0020]蛋白質(zhì)(a):由序列表中SEQ ID No.2所不氣基酸序列組成的蛋白質(zhì)；
[0021] 蛋白質(zhì)(b):在(a)的氨基酸序列中經(jīng)過一個或幾個氨基酸取代且(-)-γ-內(nèi)酰胺 酶活性提高的衍生蛋白質(zhì)。
[0022] 本發(fā)明所述核酸的制備方法為本領(lǐng)域常規(guī)制備方法，所述制備方法較佳地為:從 Streptomyces viridochromogenes CGMCC 4.692中提取編碼SvGL的核酸分子，或通過基因 克隆技術(shù)獲得編碼SvGL及其突變體的基因核酸分子，或通過人工全序列合成的方法得到編 碼SvGL及其突變體的核酸分子。
[0023]本發(fā)明所述通過基因克隆技術(shù)獲得編碼SvGL及其突變體的基因核酸分子的方法 為：以正向引物（Primer F) 5 '-CGGAATTCATGCCGTACATCACCGTG-3 '（EcoR I)，反向引物 (Primer R)5'-CCCAAGCTTTCACTTCTCCAGGAAGGC-3'（Hind III)，利用PCR技術(shù)對技術(shù)方案一 中獲得的SvGL及其突變體的的基因 DNA序列進(jìn)行擴(kuò)增。
[0024] PCR體系（50yL):rTaq 0.25yL，10XBuffer 5yL，dNTP Mix 4yL，模板質(zhì)粒約 100ng，Primer F 2yL，Primer R 2yL，ddH2〇補足至50yL〇
[0025] PCR 反應(yīng)程序：（1)98°C 變性 3min;(2)98°C 變性 30s;(3)55°C 退火 30s;(4)72°C 延伸 lmin;步驟(2)~(4)共進(jìn)行30個循環(huán)，最后72°C延伸10min，4°C保存產(chǎn)物。
[0026]技術(shù)方案之三：
[0027] -種包含本發(fā)明（-)-γ-內(nèi)酰胺酶的核酸序列的重組表達(dá)質(zhì)粒。
[0028] 其可通過本領(lǐng)域常規(guī)方法將本發(fā)明的(-)-γ-內(nèi)酰胺酶基因的核酸序列連接于各 種常規(guī)質(zhì)粒載體上構(gòu)建而成。所述質(zhì)粒優(yōu)選ρΕΤ系列質(zhì)粒，更優(yōu)選質(zhì)粒pET28a。所述(-)-γ -內(nèi)酰胺酶基因可以操作性地連接于適合表達(dá)的調(diào)控序列的下游，以實現(xiàn)所述(-)-γ-內(nèi)酰 胺酶的誘導(dǎo)型表達(dá)。
[0029]技術(shù)方案之四：
[0030] -種包含本發(fā)明（-)-γ-內(nèi)酰胺酶基因或其重組表達(dá)質(zhì)粒的重組表達(dá)轉(zhuǎn)化體。
[0031] 其可通過將本發(fā)明的重組表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至合適的宿主細(xì)胞中來制得所述重組表 達(dá)轉(zhuǎn)化體。所述宿主細(xì)胞可以是本領(lǐng)域的各種常規(guī)宿主細(xì)胞，前提是能使所述重組表達(dá)載 體穩(wěn)定地自行復(fù)制，且其所攜帶的(-)-γ-內(nèi)酰胺酶基因可被有效表達(dá)。本發(fā)明優(yōu)選大腸桿 菌，更優(yōu)選大腸桿菌BL21 (DE3)或大腸桿菌DH5a。
[0032]技術(shù)方案之五：
[0033] -種重組(-)-γ -內(nèi)酰胺酶的制備方法，其包括如下步驟:培養(yǎng)本發(fā)明的重組表達(dá) 轉(zhuǎn)化體，獲得重組(-)-γ-內(nèi)酰胺酶。其中，培養(yǎng)所述重組表達(dá)轉(zhuǎn)化體所用的培養(yǎng)基可選自 本領(lǐng)域的常規(guī)培養(yǎng)基，前提是可使重組表達(dá)轉(zhuǎn)化體生長并產(chǎn)生本發(fā)明所述的（-)-γ-內(nèi)酰 胺酶。其他培養(yǎng)轉(zhuǎn)化體的具體操作均可按本領(lǐng)域常規(guī)操作進(jìn)行。優(yōu)選的，將上述技術(shù)方案構(gòu) 建的含有(-)-γ-內(nèi)酰胺酶基因的重組大腸桿菌，接種至含50yg ml/1硫酸卡那霉素的LB培 養(yǎng)基(蛋白胨l〇g Γ1，酵母膏5g L'NaCl g L'pH 7.0)中，按1%(v/v)的接種量接入裝有 100mL LB培養(yǎng)基的500mL三角瓶中，置于37°C、180rpm搖床振蕩培養(yǎng)，當(dāng)培養(yǎng)液的OD600達(dá)到 0.6時，加入終濃度為0.2mM的異丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG)作為誘導(dǎo)劑，16°C誘導(dǎo)24h 后，將培養(yǎng)液離心，收集細(xì)胞，并用生理鹽水洗滌兩次，獲得靜息細(xì)胞。將所得的靜息細(xì)胞懸 浮于10mL的緩沖液(pH 8.0)中，在冰浴中超聲破碎，離心收集上清液，即得到重組(-)-γ-內(nèi)酰胺酶的粗酶液。
[0034] 本發(fā)明獲得的（-)-γ-內(nèi)酰胺酶在Ν端含有組氨酸標(biāo)簽，故采用鎳柱進(jìn)行蛋白純 化。以下為緩沖液配方:Α液：Tri s-HCl緩沖液（20mM，pH 8.0)，含有0.5Μ NaCl、20mM咪唑和 10% (w/v)的甘油;B液:Tris-HCl緩沖液(20mM，pH 8·0)，含有0· 5M NaCl、500mM咪唑和 10% (w/v)的甘油。將表達(dá)的（-)-γ-內(nèi)酰胺酶的粗酶液上樣到鎳柱上，首先用A液洗脫雜蛋白， 隨后用B液洗脫目標(biāo)蛋白，根據(jù)SDS-PAGE檢測的結(jié)果收集純化的蛋白質(zhì)，加入終濃度為20% (w/V)的甘油，于-70°C保存?zhèn)溆谩?br>[0035]技術(shù)方案之六：
[0036] 將本發(fā)明的（-)-γ-內(nèi)酰胺酶應(yīng)用于催化消旋γ-內(nèi)酰胺的水解反應(yīng)以制備光學(xué) 活性的(+)-γ-內(nèi)酰胺，（+)-γ-內(nèi)酰胺可作為制備碳環(huán)核苷類藥物中間體使用。
[0037] 水解反應(yīng)的底物為消旋γ-內(nèi)酰胺。反應(yīng)條件如反應(yīng)溫度、底物濃度、緩沖液組成、 ΡΗ、酶用量等可按本領(lǐng)域此類反應(yīng)的常規(guī)條件進(jìn)行優(yōu)化、選擇。
[0038]比如反應(yīng)溫度為30°C時，消旋γ -內(nèi)酰胺底物濃度為10mM，考察了SVGLL13QY/F188W(指 的是如序列表中SEQ ID No.2所示氨基酸序列的第188位苯丙氨酸替換為色氨酸，同時第 130位亮氨酸替換為酪氨酸后所得氨基酸序列構(gòu)成的蛋白質(zhì))在不同pH緩沖液中的活性。所 用的緩沖液體系為:檸檬酸鈉緩沖液(pH 5.0-6.0);磷酸鈉緩沖液(pH 6.0-8.5);Tris-HCl 緩沖液(pH 8.0-9.0)和Gly-NaOH緩沖液(9.0-12.0)。結(jié)果如表1所示，SvGLli3〇y/fi88w的最適 pH在8.0左右。
[0039] 表1(-)- γ -內(nèi)酰胺酶SvGLl13QY/F188W在不同pH緩沖液中的活性
[0042] 典型的酶促消旋γ -內(nèi)酰胺水解的條件如下：將0.2~lmg重組SvGL或其突變體溶 解于10ml緩沖液中，優(yōu)選pH 7.0的磷酸鉀緩沖液，加入底物外消旋γ -內(nèi)酰胺的濃度為1~ 4Μ，反應(yīng)液充分混合反應(yīng)。反應(yīng)在20°C~70°C下進(jìn)行，優(yōu)選30°C。反應(yīng)結(jié)束后用二氯甲烷萃 取4次，合并萃取液，加無水硫酸鈉干燥過夜。旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去溶劑即可得到(+)-γ-內(nèi)酰胺。
[0043] 與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的積極進(jìn)步效果在于：使用本發(fā)明的（-)-γ-內(nèi)酰胺酶 SvGL及其突變體催化(-)-γ-內(nèi)酰胺水解，制備光學(xué)活性( + )-γ-內(nèi)酰胺具有催化劑活性 高，用量少的顯著優(yōu)勢。底物γ -內(nèi)酰胺濃度高達(dá)4Μ，催化劑使用量為0.2g Γ1時，反應(yīng)1 lh轉(zhuǎn) 化率接近50%，產(chǎn)物的分離得率高于47.5%。相對于其它制備方法，使用本發(fā)明方法制備所 得的(-)-γ-內(nèi)酰胺酶具有催化劑用量少、底物濃度高、反應(yīng)條件溫和，產(chǎn)品光學(xué)純度好，工 藝環(huán)境友好，操作簡便，易于工業(yè)放大等優(yōu)勢，因此具有很好的工業(yè)應(yīng)用前景。
【具體實施方式】
[0044]下面結(jié)合具體實施例對本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)說明。
[0045] 實施例內(nèi)酰胺酶SvGL基因的克隆
[0046] 將菌株Streptomyces viridochromogenes CGMCC 4.692在1^5培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)， 采用高鹽法提取高純度、大片段的基因組總DNA，溶于TE緩沖液(pH8.0)中，置于-20°C保藏， 具體方法參考F ·奧斯伯等編的《精編分子生物學(xué)實驗指南》。
[0047] 采用限內(nèi)酶Sau3AI對提取的總DNA進(jìn)行部分酶切，酶切后的DNA片段通過電泳進(jìn)行 純化，采用膠回收純化試劑盒回收大約4~6kb的片段，回收的DNA溶解于TE緩沖液（10mM，pH 8.0)中，置于_20°C保藏。
[0048]按如下反應(yīng)體系與載體pUCl 18進(jìn)行連接：
[0051 ] 16°C溫育6小時，取10yL酶連產(chǎn)物轉(zhuǎn)化200yL大腸桿菌DH5a感受態(tài)細(xì)胞（TaKaRa， Code: D9057)，挑取單克隆到加有300yL含有100yg ml/1氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基的深孔板，37 °C振蕩培養(yǎng)過夜，接種50yL至加有600yL含有100yg ml/1氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基的二級深孔 板，37°C振蕩培養(yǎng)3h后加入終濃度為0.2mM的IPTG，16°C誘導(dǎo)24h。取50yL菌液加入到300yL 含有終濃度為10mM消旋γ -內(nèi)酰胺的反應(yīng)混合液中，37°C振蕩反應(yīng)lh，加入等體積甲醇終止 反應(yīng)，薄板層析檢測產(chǎn)物的生成，有明顯產(chǎn)物生成的定義為陽性克隆子。將陽性克隆子委托 上海桑尼生物技術(shù)有限公司進(jìn)行序列測定，對獲得的DNA序列進(jìn)行分析，對其中的開放閱讀 框編碼序列進(jìn)行表達(dá)、反應(yīng)比較，最終獲得如SEQ ID NO. 1所示的核苷酸序列，根據(jù)該核苷 酸序列所推測的氨基酸序列如SEQ ID N0.2所示，將該序列表達(dá)的（-)-γ-內(nèi)酰胺酶命名為 SvGL〇
[0052]以正向引物（Primer F)5'-CGGAATTCATGCCGTACATCACCGTG-3'，反向引物（Primer R) 5 ' -CCCAAGCTTTCACTTCTCCAGGAAGGC-3 '，利用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)技術(shù)對陽性克隆子中 的SvGL核苷酸序列進(jìn)行擴(kuò)增，將獲得的含有SvGL基因序列的DNA片段分別用EcoR I和Hind III雙酶切，隨后與同樣經(jīng)過EcoR I和Hind III雙酶切的質(zhì)粒pET28a進(jìn)行連接，獲得質(zhì)粒 pET28a-SvGL。將獲得的質(zhì)粒pET28a-SvGL轉(zhuǎn)化到大腸桿菌E.coli BL21中，并均勻涂布于含 有50yg ml/1卡那霉素的LB瓊脂平板。37°C過夜培養(yǎng)后，挑選單克隆送上海桑尼生物科技有 限公司進(jìn)行測序，結(jié)果正確。
[0053]實施例2 188位苯丙氨酸的定點飽和突變
[0054] 米用QuikChange? II Site-Directed Mutagenesis Kit(Stratagene，Catalog# 200522 )所述方案進(jìn)行操作。設(shè)計含有突變點的引物：正向引物（？4111^?)5'-GCCGTCCGCAACAGCNNKAACGTCGCCGCGGGC-3 ' 和反向弓| 物（Primer R)5'_ GCCCGCGGCGACGTTMNNGCTGTTGCGGACGGC-3' JCR反應(yīng)體系（50yL):模板0.5~20ng，5yL 10X K0D plus buffer，5yL dNTP(各2.0mM)，2yL MgS〇4(25mM)，一對突變引物各1μL(20μΜ)，1個 單位的K0D酶(Τ0Υ0Β0 CO.，LTD.，0saka，Japan)，加滅菌蒸餾水至50yL。其中所述的模板為 實施例1獲得的質(zhì)粒pETSSa-SvGLlCR反應(yīng)程序 ：（1)94°(：變性5!1^11;(2)94°(：變性3(^(3，（3) 55°C退火lmin，（4)68°C延伸7min，步驟（2)~（4)共進(jìn)行30個循環(huán)，最后68°C延伸10min，4°C 保存產(chǎn)物。擴(kuò)增得到的PCR產(chǎn)物在37°C經(jīng)內(nèi)切酶Dpn I消化2h后轉(zhuǎn)化E.coli BL21感受態(tài)細(xì) 胞，并均勻涂布于含有50yg ml/1卡那霉素的LB瓊脂平板。37°C過夜培養(yǎng)后，挑選單克隆，進(jìn) 行活性檢測，其中活性最高者送上海桑尼生物科技有限公司進(jìn)行測序，結(jié)果表明第188位苯 丙氨酸替換為色氨酸，將其命名為SvGLfissw。
[0055] 實施例3 130位亮氨酸的定點飽和突變
[0056] 米用QuikChange?.II Site-Directed Mutagenesis Kit(Stratagene，Catalog# 200522 )所述方案進(jìn)行操作。設(shè)計含有突變點的引物：正向引物（？4111^?)5'-TCGCTGGAGCCCTGCNNKCTCAAGTCCGACGAC-3 ' 和反向弓| 物（Primer R)5'_ GTCGTCGGACTTGAGMNNGCAGGGCTCCAGCGA-3 ' JCR反應(yīng)體系（50yL):模板0 · 5~20ng，5yL 10 X KOD plus buffer，5yL dNTP(各2.0mM)，2yL MgS〇4(25mM)，一對突變引物各1μL(20μΜ)，1個 單位的K0D酶(Τ0Υ0Β0 CO.，LTD.，0saka，Japan)，加滅菌蒸餾水至50yL。其中所述的模板為 實施例 2 獲得的質(zhì)粒 pET28a-SvGLFi88LPCR 反應(yīng)程序：（1)94°(：變性5!1^11;(2)94°(：變性3(^(3， (3)55°C退火lmin，（4)68°C延伸7min，步驟(2)~(4)共進(jìn)行30個循環(huán)，最后68°C延伸lOmin， 4 °C保存產(chǎn)物。擴(kuò)增得到的PCR產(chǎn)物在37 °C經(jīng)內(nèi)切酶Dpn I消化2h后轉(zhuǎn)化E. co 1 i BL21感受態(tài) 細(xì)胞，并均勻涂布于含有50yg ml/1卡那霉素的LB瓊脂平板。37°C過夜培養(yǎng)后，挑選單克隆進(jìn) 行活性檢測，其中活性最高者送上海桑尼生物科技有限公司進(jìn)行測序，結(jié)果表明活性最高 的兩個突變體中亮氨酸分別突變?yōu)槔野彼岷彤惲涟彼幔謩e命名為SvGLL13QY/F188W和 SvGLl130I/F188W〇
[0057]實施例4重組酶的制備以及活性測定
[0058]將如實施例1-3所述方法獲得的表達(dá)野生型以及突變體SvGL的重組大腸桿菌接種 至含50yg ml/1硫酸卡那霉素的LB培養(yǎng)基中，37°C振蕩培養(yǎng)過夜，按1 % (v/v)的接種量接入 裝有600mL LB培養(yǎng)基的2L三角瓶中，置37°C、180rpm搖床振蕩培養(yǎng)，當(dāng)培養(yǎng)液的OD600達(dá)到 1.5時，加入終濃度為0.2mM的IPTG作為誘導(dǎo)劑，16 °C誘導(dǎo)24h后，將培養(yǎng)液離心，收集細(xì)胞， 并用生理鹽水洗滌兩次，獲得靜息細(xì)胞。將所得的靜息細(xì)胞懸浮于磷酸鉀緩沖液(20mM，pH 7.0) 中，高壓勻漿機(jī)破碎，冷凍干燥即得相應(yīng)的重組酶粉。
[0059] 采用鎳柱進(jìn)行蛋白純化。以下為緩沖液配方：A液：Tr i s-HC1緩沖液（20mΜ，pΗ 8.0) ，含有0.5Μ NaCl、20mM咪唑和 10% (w/v)的甘油;Β液:Tris-HCl緩沖液(20mM，pH 8.0)， 含有0.5Μ NaCl、500mM咪唑和10%(w/v)的甘油。將表達(dá)的（-)-γ-內(nèi)酰胺酶的粗酶液上樣 到鎳柱上，首先用Α液洗脫雜蛋白，隨后用Β液洗脫目標(biāo)蛋白，根據(jù)SDS-PAGE檢測的結(jié)果收集 純化的蛋白質(zhì)，加入終濃度為20% (w/v)的甘油，于-70°C保存?zhèn)溆谩?br>[0060] 用磷酸鉀緩沖液（100mM，pH 7.0)將經(jīng)過鎳柱純化的純酶稀釋至O.lmg ml/1，吸取 1 〇yL酶液加到lmL含有1 OmM消旋γ -內(nèi)酰胺的磷酸鉀緩沖液（100mM，pH7.0)中，30 °C、 lOOOrpm振搖反應(yīng)20min，加入600yL乙酸乙酯萃取，加無水硫酸鈉干燥過夜，HPLC (Chiralpark AS-H)分析測定γ -內(nèi)酰胺的減少量從而確定初始反應(yīng)速率。一個酶活單位 (U)的定義為在上述條件下，每分鐘水解Ι.Ομ mol的γ-內(nèi)酰胺所需要的酶量。各重組純酶的 比活力列于表2中。
[0061] 表2野生型(-)-γ-內(nèi)酰胺酶與其突變體的純酶活性比較
[0063] 實施例5溫度對重組(-)_ γ -內(nèi)酰胺酶SvGLmQY/Fissw活性的影響
[0064] 用磷酸鉀緩沖液（100mM，pH 7.0)將經(jīng)過鎳柱純化的純酶稀釋至0.5mg ml/1，吸取 1 OOyL酶液加到0.5mL含有1 OOmM消旋γ -內(nèi)酰胺的磷酸鉀緩沖液（1 OOmM，pH 7.0)中，不同溫 度（20~70°C )下，lOOOrpm振搖反應(yīng)20min，加入600yL乙酸乙酯萃取，加無水硫酸鈉干燥過 夜，HPLC(Chiralpark AS-H)分析測定γ -內(nèi)酰胺的減少量從而確定初始反應(yīng)速率。結(jié)果如 表3所不，SvGLli3〇y/fi88w在40 °C時催化活性最尚。
[0065] 表3(-)- γ -內(nèi)酰胺酶SvGLli3〇y/fi88w在不同溫度下的活性
[0068] 實施例6pH對重組(-)-γ -內(nèi)酰胺酶SvGLli3〇y/fi88w活性的影響 [0069] 將0.2mg重組SvGLli3〇y/fi88w酶加入到10mL磷酸鉀緩沖液（100mM，pH 7.0)中，加入 ( + )-γ-內(nèi)酰胺至終濃度為3.4M，在40°C下混勻反應(yīng)。反應(yīng)8h后取樣500yL，加入600yL乙酸 乙酯萃取，加無水硫酸鈉干燥過夜，手性HPLC(Chiralpark AS-H)分析測定轉(zhuǎn)化率和立體選 擇性。具體分析條件為:檢測波長230nm，柱溫30°C，流動相為乙腈:異丙醇(9:l，v/v)，流速 為0.8mL mirT1。結(jié)果如表4所示，pH 5.0-7.0反應(yīng)條件下，緩沖液的pH對反應(yīng)的轉(zhuǎn)化率沒有 明顯的影響，當(dāng)pH>7時反應(yīng)速率開始急劇下降。
[0070] 表4不同pH對重組酶SvGLli3〇y/fi88w催化(+ )- γ -內(nèi)酰胺水解反應(yīng)的影響
[0072]實施例7重組酶SvGL催化消旋體γ -內(nèi)酰胺的水解反應(yīng)
[0073] 將O.lmg如實施例4獲得的重組E.coli BL21(DE3)pET28a-SvGL凍干酶粉、1Μ (1. lg)消旋體γ -內(nèi)酰胺加入到10mL磷酸鉀緩沖液（100mM，pH 7.0)中，在40°C下混勻反應(yīng)。 定時取樣5yL，加入600yL乙酸乙酯萃取，加無水硫酸鈉干燥過夜，手性HPLC(Chiralpark AS-H)分析測定轉(zhuǎn)化率和立體選擇性。具體分析條件為:檢測波長230nm，柱溫30°C，流動相 為乙腈:異丙醇(9:1，v/v)，流速為0.8mL mirT1。轉(zhuǎn)化8h，反應(yīng)轉(zhuǎn)化率接近50%，剩余( + )- γ - 內(nèi)酰胺的光學(xué)純度高于99%。
[0074] 實施例8重組酶SvGL L13QY/F188W催化消旋體γ -內(nèi)酰胺的水解反應(yīng) [0075]將0.2mg如實施例4獲得的重組E.coli BL21(DE3)pET28a-SvGL L13QY/F188W凍干酶 粉、4M(4.4g)消旋γ -內(nèi)酰胺加入到10mL磷酸鉀緩沖液（100mM，pH 7.0)中，在40°C下混勻反 應(yīng)。定時取樣5yL，加入600yL乙酸乙酯萃取，加無水硫酸鈉干燥過夜，手性HPLC(Chiralpark AS-H)分析測定轉(zhuǎn)化率和立體選擇性。具體分析條件為:檢測波長230nm，柱溫30°C，流動相 為乙腈:異丙醇(9:1，v/v)，流速為0.8mL mirT1。轉(zhuǎn)化llh，反應(yīng)轉(zhuǎn)化率接近50%，終止反應(yīng)， 反應(yīng)液用10mL二氯甲烷萃取4次，分離有機(jī)相，加入無水硫酸鈉干燥過夜，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去溶 劑，重結(jié)晶，獲得2.1 g(+) - γ -內(nèi)酰胺，分離得率47.7 %，光學(xué)純度為99 %。
[0076] 實施例9重組酶SvGUi3〇y/fi88w催化消旋體γ -內(nèi)酰胺的水解反應(yīng)
[0077]將2mg如實施例5獲得的重組E.coli BL21(DE3)pET28a-SvGLLi3QY/Fi88w凍干酶粉、2Μ (22g)消旋體γ -內(nèi)酰胺加入到100mL磷酸鉀緩沖液(lOOmM，pH 7.0)中，在40°C下混勻反應(yīng)。 定時取樣5yL，加入600yL乙酸乙酯萃取，加無水硫酸鈉干燥過夜，手性HPLC(Chiralpark AS-H)分析測定轉(zhuǎn)化率和立體選擇性。具體分析條件為:檢測波長230nm，柱溫30°C，流動相 為乙腈:異丙醇(9:1，v/v)，流速為0.8mL mirT1。轉(zhuǎn)化6h，反應(yīng)轉(zhuǎn)化率接近50%，終止反應(yīng)，反 應(yīng)液用100mL二氯甲烷萃取4次，分離有機(jī)相，加入無水硫酸鈉干燥過夜，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去溶 劑，重結(jié)晶，獲得10.5g(+) - γ -內(nèi)酰胺，分離得率47.7 %，光學(xué)純度為99 %。
[0078] 實施例10重組酶SvGUi3〇y/fi88w催化消旋體γ -內(nèi)酰胺的水解反應(yīng)
[0079]將20mg如實施例5獲得的重組E.coli BL21(DE3)pET28a-SvGLLi3QY/Fi88w凍干酶粉、 3.4M(370g)消旋體γ -內(nèi)酰胺加入到1L磷酸鉀緩沖液（100mM，pH 7.0)中，在40°C下混勻反 應(yīng)。定時取樣5yL，加入600yL乙酸乙酯萃取，加無水硫酸鈉干燥過夜，手性HPLC(Chiralpark AS-H)分析測定轉(zhuǎn)化率和立體選擇性。具體分析條件為:檢測波長230nm，柱溫30°C，流動相 為乙腈:異丙醇(9:1，v/v)，流速為0.8mL mirT1。轉(zhuǎn)化8h，反應(yīng)轉(zhuǎn)化率接近50%，終止反應(yīng)，反 應(yīng)液用1L二氯甲烷萃取，分離有機(jī)相，加入無水硫酸鈉干燥過夜，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去溶劑，重結(jié) 晶，獲得18(^( + )-丫-內(nèi)酰胺，分離得率48.6%，光學(xué)純度為99%。
[0080]上述的對實施例的描述是為便于該技術(shù)領(lǐng)域的普通技術(shù)人員能理解和使用發(fā)明。 熟悉本領(lǐng)域技術(shù)的人員顯然可以容易地對這些實施例做出各種修改，并把在此說明的一般 原理應(yīng)用到其他實施例中而不必經(jīng)過創(chuàng)造性的勞動。因此，本發(fā)明不限于上述實施例，本領(lǐng) 域技術(shù)人員根據(jù)本發(fā)明的揭示，不脫離本發(fā)明范疇所做出的改進(jìn)和修改都應(yīng)該在本發(fā)明的 保護(hù)范圍之內(nèi)。


【主權(quán)項】
1. 一種(-)-γ-內(nèi)酰胺酶，其特征在于，其是如下(a)或(b)的蛋白質(zhì)： (a) :如序列表中SEQ ID No.2所示氨基酸序列構(gòu)成的蛋白質(zhì)； (b) :在(a)的氨基酸序列中經(jīng)過一個或幾個氨基酸取代且(-)-γ-內(nèi)酰胺酶活性提高 的衍生蛋白質(zhì)。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種(-)-γ-內(nèi)酰胺酶，其特征在于，所述蛋白質(zhì)(b)為由SEQ ID No. 2所示氨基酸序列的第130位的亮氨酸、第188位的苯丙氨酸經(jīng)過一個或幾個氨基酸 取代后形成的新氨基酸序列構(gòu)成的衍生蛋白質(zhì)。3. 根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的一種(-)-γ-內(nèi)酰胺酶，其特征在于，所述蛋白質(zhì)（b)具有 如下序列： (1) 將如序列表中SEQ ID No.2所示氨基酸序列的第188位苯丙氨酸替換為色氨酸;或， (2) 將如序列表中SEQ ID No. 2所示氨基酸序列的第188位苯丙氨酸替換為色氨酸，同 時第130位亮氨酸替換為異亮氨酸;或， (3) 將如序列表中SEQ ID No. 2所示氨基酸序列的第188位苯丙氨酸替換為色氨酸，同 時第130位亮氨酸替換為酪氨酸。4. 一種分離的核酸，其特征在于，所述的核酸是編碼如權(quán)利要求1-3中任一項所述(-)-γ-內(nèi)酰胺酶的核酸分子。5. -種包含如權(quán)利要求4所述核酸的重組表達(dá)質(zhì)粒。6. -種包含如權(quán)利要求5所述重組表達(dá)質(zhì)粒的重組表達(dá)轉(zhuǎn)化體。7. -種如權(quán)利要求1-3中任一項所述(-)-γ-內(nèi)酰胺酶的制備方法，其特征在于，包含 如下步驟:培養(yǎng)如權(quán)利要求6所述的重組表達(dá)轉(zhuǎn)化體，獲得重組表達(dá)的(-)-γ-內(nèi)酰胺酶。8. -種如權(quán)利要求1-3中任一項所述(-)-γ-內(nèi)酰胺酶催化消旋γ-內(nèi)酰胺對映選擇性 水解，制備( +)_ Y _內(nèi)酰胺的應(yīng)用。9. 根據(jù)權(quán)利要求8所述的應(yīng)用，其特征在于，包括以下步驟:使用如權(quán)利要求1-3中任一 項所述的（-)-γ -內(nèi)酰胺酶作為催化劑，催化消旋γ -內(nèi)酰胺對映選擇性水解，然后從反應(yīng) 液中提取、純化未反應(yīng)的高光學(xué)純度的(+)-γ-內(nèi)酰胺。10. 根據(jù)權(quán)利要求9所述的應(yīng)用，其特征在于，（-)-γ-內(nèi)酰胺酶催化消旋γ-內(nèi)酰胺對 映選擇性水解反應(yīng)的條件為：γ -內(nèi)酰胺酶的濃度為1~l〇〇mg/L，消旋γ -內(nèi)酰胺的濃 度為1~4Μ，反應(yīng)溫度為20~80°C，反應(yīng)液pH為5~9。
【文檔編號】C12P41/00GK105950595SQ201610331002
【公開日】2016年9月21日
【申請日】2016年5月18日
【發(fā)明人】許建和, 殷金崗, 鄭高偉, 潘江
【申請人】華東理工大學(xué)