一種高純度雷帕霉素的制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種高純度雷帕霉素的制備方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 雷帕霉素（Rapamycin，RPM，PAPA),又名西羅莫司（Sirolimus)，是 1975 年由加 拿大Ayerst研究所從吸水鏈霉菌（Strepomyces hygroscopicus)中分離出來的Η帰大 環(huán)內(nèi)醋類抗生素。雷帕霉素的分子式為Cs化gN〇i3,分子量914,為白色固體結(jié)晶，烙點(diǎn)為 183-185°C，親脂性，溶解于甲醇、己醇、丙麗、氯仿等有機(jī)溶劑，極微溶于水，幾乎不溶于己 離。其結(jié)構(gòu)式為：
西羅莫司具有異構(gòu)體B和異構(gòu)體C，其中異構(gòu)體B為主要活性成分，上述結(jié)構(gòu)式為異構(gòu) 體B，異構(gòu)體C結(jié)構(gòu)式如下：
1977年發(fā)現(xiàn)其具有重要的免疫抑制作用，1989年開始把其作為用于抗器官移植排斥 反應(yīng)的新型高效免疫抑制劑進(jìn)行研究，1999年9月美國FDA批準(zhǔn)其適用于在臨床上的腎移 植病人。在中國，西羅莫司口服液作為二類新藥2002年獲準(zhǔn)進(jìn)入國內(nèi)臨床。2005年6月福 建省微生物研究所研制研發(fā)的國產(chǎn)西羅莫司經(jīng)S抑A批準(zhǔn)投放市場?，F(xiàn)在西羅莫瓦器已成 功開發(fā)為新型強(qiáng)效的免疫抵制劑，用于器官移植搞排斥反應(yīng)，用于治療自身免疫性疾??；用 于涂層支架，防止必臟血管再狹窄；作為mTOR祀向抗腫瘤藥物，抑制腫瘤的生長等 CN102433364B提供了一種微生物發(fā)酵法制取雷帕霉素的工藝，其中，包括W下步驟： 先在斜面培養(yǎng)基中培養(yǎng)吸水鏈霉菌，然后轉(zhuǎn)接于新鮮種子培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)；將經(jīng)所述種 子培養(yǎng)基培養(yǎng)的菌株按照2%的接種量接種至新鮮的發(fā)酵培養(yǎng)基中進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)，得到含 雷帕霉素的發(fā)酵液；將雷帕霉素發(fā)酵液加入娃藻±過濾，得到濕菌絲體，萃取、濃縮、結(jié)晶， 得到雷帕霉素粗品；然后再講雷帕霉素粗品經(jīng)硅膠柱層析純化，最后重結(jié)晶得到雷帕霉素 終產(chǎn)品，純度在95% W上。
[0003] 專利CN101133065A公開了一種通過化學(xué)方法來純化雷帕霉素的方法。該方法純 化方法包括用Η甲基氯娃焼處理雷帕霉素得到31，42-雙-Η甲基甲娃基離，庚焼萃取，并 使31，42-雙-Η甲基甲娃焼離脫保護(hù)從而產(chǎn)生純化的雷帕霉素產(chǎn)物。該方法操做復(fù)雜，成 本較高，回收率低只能獲得98. 7%純度的雷帕霉素。
[0004] 專利CN 102464668 A公開了一種通過制備色譜純化得到高純度雷帕霉素的方法。 該方法用到了制備色譜，其設(shè)備、填料價(jià)格昂貴，生產(chǎn)成本高。
[0005] 專利CN 102070652 B公開了一種從發(fā)酵液中快速分離提取西羅莫司的方法，包括 將西羅莫司從發(fā)酵液中提取得到菌絲體，然后將菌絲體進(jìn)行萃取、脫色得到粗提物，粗提物 通過高速逆流色譜分離，收集西羅莫司分離樣品溶液，濃縮干燥，得到成品，該方法具有提 取步驟簡單、節(jié)省溶劑等優(yōu)點(diǎn)，但其采用高速逆流色譜分離，設(shè)備投入成本大，色譜上樣量 小（目前到克級)，不適合工業(yè)規(guī)模生產(chǎn)，并且經(jīng)過該方法只能得到純度為90%的雷帕霉素產(chǎn) 品。
[0006] 專利CN102372726A公開了一種通過將西羅莫司菌絲體的浸提液進(jìn)行吸附、萃取、 洗涂濃縮、洗涂、結(jié)晶、洗晶干燥等步驟，即可得到西羅莫司粗晶，該方法只能得到純度為 95%的雷帕霉素。
[0007] 雷帕霉素的發(fā)酵產(chǎn)量低，從發(fā)酵液中分離提取雷帕霉素的難度大，現(xiàn)有工藝均存 在分離效率低，能耗高，隨著雷帕霉素越來越多的進(jìn)入臨床的使用，急需找到一種成本低、 操作簡單、高純度的制備方法。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0008] 為了解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明提供了一種產(chǎn)品純度高，生產(chǎn)成本低的從發(fā)酵液 中分離純化雷帕霉素的方法，包括：從雷帕霉素發(fā)酵液中分離得到菌絲體，然后將菌絲體用 丙麗浸提，固液分離得到浸提液；將雷帕霉素浸提液采用下述步驟進(jìn)行操作： (1 )、萃取、脫色：將浸提液濃縮后，用己酸己醋萃取，得到己酸己醋相；向己酸己醋相 加入活性炭脫色，無水硫酸鋼干燥； (2) 、硅膠柱層析；向步驟（1)干燥后的己酸己醋相中加入空白硅膠，濃縮成干粉，作為 上樣硅膠擊油離/己酸己醋作為洗脫劑，收集洗脫液，濃縮，得到粗品I ; (3) 大孔吸附樹脂吸附；將步驟（2)得到的粗品I用己臘水溶液溶解，通過大孔吸附樹 脂吸附，己臘水溶液作為解吸液，收集含雷帕霉素純度高的解吸液；將解吸液真空濃縮，然 后加入二氯甲焼萃取，合并二氯甲焼相，濃縮至干，得到粗品II ; (4) 結(jié)晶；將粗品II用己離溶解，4°C 攬拌結(jié)晶，過濾收集晶體，在常溫下真空干燥 得到純化的雷帕霉素。
[0009] 其中，從雷帕霉素發(fā)酵液中分離得到菌絲體所用方法可W為壓濾、抽濾或離必中 的一種或多種方式結(jié)合；浸提菌絲體所用丙麗的量約為菌絲體重量的：Γ4倍（v/w)。
[0010] 進(jìn)一步的，所述步驟（1)萃取、脫色，優(yōu)選將浸提液在5(TC下真空濃縮至幾乎不含 有丙麗，然后將濃縮液用：Γ4倍（￥；^88；^@旨/胖,&^胃51.；*)己酸己脂萃取，分離得到己酸己醋相；將 己酸己醋相用0. 5^5倍（V自胃弱堿性溶液洗涂：Γ5次，直到下層水溶液無明顯顏 色，所述所堿性溶液為質(zhì)量濃度Ρ/Γ10%碳酸鋼、碳酸氨鋼、磯酸二氨鋼或磯酸二氨鋼的水 溶液；所述向己酸己醋相加入活性炭脫色，無水硫酸鋼干燥，優(yōu)選向己酸己醋相加入活性炭 后，加熱到4(TC，脫色約30分鐘，過濾，己酸己醋層加入無水硫酸鋼干燥，過濾，收集己酸己 醋溶液；其中，活性炭的用量優(yōu)選為0. 5%~10% (W活性炭/V己酸己J旨)，優(yōu)選活性炭用量為1%-3% 活性炭/V己酸己醋)°
[0011] 進(jìn)一步的，所述步驟（2)硅膠柱層析，優(yōu)先將己酸己醋相中加入空白硅膠，然后 在小于5(TC下真空濃縮成干粉，作為上樣硅膠，所述空白硅膠為球形非鍵合硅膠，粒徑為 50-300目，用量為己酸己醋相中所含雷帕霉素質(zhì)量的2^20倍，優(yōu)選?Τ?Ο倍；裝柱完成后， 優(yōu)選采用干法上樣；洗脫之前，優(yōu)選先用石油離與己酸己醋的混合溶劑對硅膠柱進(jìn)行梯度 預(yù)洗，所述預(yù)洗液石油離與己酸己醋體積比為2:8~5:5 ;該比例不是2:8~1:1范圍中的某一 個(gè)比例，而是梯度洗脫的溶劑比例在此范圍。所述預(yù)洗方法，例如可W是，在預(yù)洗過程中先 用2:8的石油離與己酸己醋預(yù)洗兩倍柱體積；然后用3:7的石油離與己酸己醋預(yù)洗兩倍柱 體積；再用4:6的石油離與己酸己醋預(yù)洗兩倍柱體積；再用5:5的石油離與己酸己醋預(yù)洗 兩倍柱體積，完成預(yù)洗。
[0012] 預(yù)洗完畢后，用石油離與己酸己醋的混合溶劑作為洗脫液對硅膠柱進(jìn)行洗脫，，其 中，石油離與己酸己醋體積比為5: 5^3:7,最優(yōu)選7:13洗脫完畢后收集洗脫液，將洗脫液在 溫度小于5(TC真空濃縮至干粉，得到雷帕霉素粗品I，純度為85% W上的雷帕霉素。
[0013] 進(jìn)一步的，所述步驟（3)大孔吸附樹脂吸附，優(yōu)選將粗品I用己臘水溶液溶解，然 后通過大孔樹脂吸附，其中，所述的己臘水溶液的濃度為40%~60%，優(yōu)選50%，每克粗品I約 用40m廣60ml，優(yōu)選50ml所述的己臘水溶液。例如，2g粗品I先加入50ml己臘，溶解后攬 拌下加入等量的純化水，攬拌均勻得到上柱液。所述大孔吸附樹脂為一種聚苯己帰二己帰 基苯形成的大孔樹脂，選自DIAI0N監(jiān)20SS、化iPS40、監(jiān)20SS和化iPS50組成的組，用量為 粗品II重量的100~500倍（W/V);更進(jìn)一步的，優(yōu)選大孔樹脂為化iPS40。
[0014] 吸附完畢后，用己臘水溶液作為洗脫液進(jìn)行洗脫，優(yōu)先洗脫液優(yōu)選濃度為40%~70% 的己臘水溶液，更優(yōu)選，洗脫液濃度為63%的己臘水溶液。收集純度較高組份，將純度較高 組份在低于4(TC下真空濃縮至己臘濃度低于10%后迅速降溫至4°C ^8°C。然后向濃縮液 中加入與濃縮液等體積的預(yù)先冷至4°C -8°C的二氯甲焼。攬拌30分鐘，分層收集二氯甲焼 層。
[0015] 向二氯甲焼層中加入無水硫酸鋼干燥，抽濾，將濾液在溫度低于45°C下真空濃縮 至干。得到雷帕霉素粗品II。
[0016] 進(jìn)一步的，所述步驟（4)結(jié)晶，優(yōu)先將粗品II用己離溶解，攬拌下緩慢降溫至 4Γ -8Γ攬拌結(jié)晶。過濾收集晶體，在25Γ下真空干燥得到純化的雷帕霉素，其中優(yōu)選所用 己離體積為粗品II重量的5~15倍粗品II)，更優(yōu)選為8-10倍粗品II);所述純 化的雷帕霉素 HPLC純度高于99%。
[0017] 所述HPLC檢測條件為：色譜柱；Kromasil C18柱；色譜柱規(guī)格；5 μ m， 4. 6mmX250mm ;流動(dòng)相：體積比為甲醇：己臘：水=70:15:30的甲醇、己臘和水的混合溶 液；檢測波長：277皿；柱溫；40°C ;流速；Iml/min。
[0018] 本發(fā)明所用到的硅膠柱層析方法中，所用空白硅膠為一球形的非鍵和硅膠，其料 徑為50~300目，優(yōu)選200~300目；硅膠柱的規(guī)格為：徑高比為1:5~1:15。優(yōu)選1:8~1:10。 用量為雷帕霉素質(zhì)量的50~150倍，最優(yōu)選100~120倍。
[0019] 本發(fā)明提供的高純度的雷帕霉素制備方法是一種具有工業(yè)化生產(chǎn)價(jià)值的新工藝， 主要具有如下優(yōu)點(diǎn)和積極效果： 第一，在制備的過程中，兩次柱層析都采用普通的常壓柱而沒有采用中壓制備色譜，從 而大大減少了生產(chǎn)的前期設(shè)備投入，有效的降低了生產(chǎn)成本； 第二，本發(fā)明采用采用柱層析結(jié)合大孔吸附樹脂的方法純化雷帕霉素原理簡單，操作 方便，對設(shè)備要求低，適合應(yīng)用于工業(yè)化生產(chǎn)，柱層析采用石油離與己酸己醋的混合液做洗 脫液，相對現(xiàn)有技術(shù)中使用丙麗/己焼做洗脫液，分離效果好； 第H，本發(fā)明純化效率高，純化后得到的雷帕霉素 HPLC純度在99% W上； 第四，與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明不僅得到的產(chǎn)品的純度高，而且收率高。
【附圖說明】
[0020] 圖1顯示實(shí)施例1中所用發(fā)酵液的HPLC圖譜，雷帕霉素的保留時(shí)間約為4. 98min。 [002。 圖2顯示實(shí)施例1中己酸己醋經(jīng)洗涂后的HPLC圖譜，雷帕霉素的保留時(shí)間約為 6. 38min。
[002引圖3顯示按實(shí)施例2所制得的粗品I的HPLC圖譜，雷帕霉素的保留時(shí)間約為 5. 37min。
[002引圖4顯示按實(shí)施例3所制的粗品II的HPLC圖譜，雷帕霉素的保留時(shí)間約