薏苡仁水提物在制備雌激素類藥物中的應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種薏苡仁水提物在制備雌激素類藥物中的應(yīng)用，薏苡仁水提物是將薏苡仁每次用其10-12倍重量的水先浸泡0.5-0.7h，然后煎煮3-4次，每次煎煮50-60min，合并煎煮液，減壓濃縮干燥得到薏苡仁水提物；所述薏苡仁水提物用于制備雌激素類藥物。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明水提物制備方法簡單，穩(wěn)定可靠，并經(jīng)多次以上試驗，均取得了相同或相近似的結(jié)果，方便，成本低，其水提物有效用于制備雌激素類藥物，開辟了薏苡仁藥用新用途，臨床意義巨大。
【專利說明】薏苡仁水提物在制備雌激素類藥物中的應(yīng)用

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及醫(yī)藥領(lǐng)域，特別是一種薏苡仁水提物在制備雌激素類藥物中的應(yīng)用， 可有效用于制備治療體內(nèi)雌性激素分泌不足而引起的相關(guān)疾病，如婦女更年期綜合癥等。

【背景技術(shù)】
[0002] 寬想夭熱雇規(guī)寬取Coixlacroyma-jobi L. var· ma-yuen (Roman. ) Stapf 的干燥成熟種仁?！侗静菥V目》列為上品，野生者少，主為栽培。其性涼，味甘、淡，歸脾、胃、 肺經(jīng)。具有利水滲濕，健脾止瀉，除搏，排膿，解毒散結(jié)的功效。主治水腫，腳氣，小便不利， 脾虛泄瀉，濕痹拘攣，肺癰，腸癰，癌腫等病癥?，F(xiàn)代藥理研究表明薏苡仁具有抗腫瘤，增強 機體免疫力，抗炎，降血糖，抑制骨骼肌收縮及鎮(zhèn)靜、鎮(zhèn)痛等作用。但尚未有關(guān)于薏苡仁雌激 素樣活性方面的研究報道。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0003] 針對現(xiàn)有技術(shù)中存在的問題，本發(fā)明的目的就是提供一種薏苡仁水提物在制備雌 激素類藥物中的應(yīng)用，可有效解決由于體內(nèi)雌性激素分泌不足而引起的相關(guān)疾?。ㄈ鐙D女 更年期綜合癥等）的用藥問題。以及給臨床醫(yī)生提供參考，旨在中藥配伍時考慮該因素提 商處方療效。
[0004] 為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案是： 薏苡仁水提物在制備雌激素類藥物中的應(yīng)用，所述薏苡仁水提物用于制備雌激素類藥 物。
[0005] 所述薏苡仁水提物是將薏苡仁每次用其10-12倍重量的水先浸泡0. 5-0. 7h，然后 煎煮3-4次，每次煎煮50-60min，合并煎煮液，減壓濃縮干燥得到薏苡仁水提物；所述薏苡 仁水提物用于制備雌激素類藥物，該薏苡仁水提物可有效用于制備治療由于體內(nèi)雌性激素 分泌不足而引起的相關(guān)疾病的藥物，實現(xiàn)薏苡仁水提物在制備治療由于體內(nèi)雌性激素分泌 不足而引起的相關(guān)疾?。ㄈ鐙D女更年期綜合癥等）藥物中的應(yīng)用。
[0006] 與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明水提物制備方法簡單，穩(wěn)定可靠，并經(jīng)多次試驗，均取得 了相同或相近似的結(jié)果，藥物制備方便，成本低。其水提物有效用于制備雌激素類藥物，開 辟了薏苡仁藥用新用途，臨床意義巨大。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0007] 圖1為本發(fā)明實施例3中薏苡仁水提物對MCF-7增殖的影響（^ ±s，n=6)示意 圖，注：與空白對照組比較，#表示P〈〇. 05, ##表示P〈0. 01 ;與陽性組比較，*表示P〈0. 05， ** 表示 Ρ〈〇· 01。
[0008] 圖2為本發(fā)明實施例3中薏苡仁水提物對性未成熟小鼠子宮系數(shù)的影響±s， n=10)示意圖，注：與空白對照組比較，#表示P〈0. 05, ##表示P〈0. 01 ;與陽性組比較，*表 示 Ρ〈0· 05, ** 表示 Ρ〈0· 01。
[0009] 圖3為本發(fā)明實施例3中ER α介導時，薏苡仁水提物對ERE調(diào)控的報告基因 Luc 瞬時表達結(jié)果（i±s，n=3)示意圖，注：與空白對照組比較，#表示P〈0. 05，##表示P〈0. 01 ; 與陽性組比較，*表示P〈〇. 05, **表示P〈0. 01。
[0010] 圖4為本發(fā)明實施例3中ERi3介導時，薏苡仁水提物對ERE調(diào)控的報告基因 Luc 瞬時表達結(jié)果（i±s，n=3)示意圖，注：與空白對照組比較，#表示P〈0. 05，##表示P〈0. 01 ; 與陽性組比較，*表示P〈〇. 05, **表示P〈0. 01。

【具體實施方式】
[0011] 以下結(jié)合實施例和試驗相關(guān)資料對本發(fā)明的具體情況作詳細說明。
[0012] 本發(fā)明在具體實施中，所述的薏苡仁水提物在制備雌激素類藥物中的應(yīng)用，該薏 苡仁水提物是由以下實施例給出： 實施例1 本實施例所用的材料與儀器： 1.實驗材料 1. 1實驗藥物與主要試劑 為無 Jf·"擎(墻勢]著? Coixlacroyma-jobi L. var. ma-yuen (Roman. ) Stapf 飽 干燥成熟種仁。秋季果實成熟時采割植株，曬干，打下果實，再曬干，除去外殼、黃褐色種皮 和雜質(zhì)，收集種仁，即為薏苡仁原藥材；試劑均為國產(chǎn)分析純。
[0013] 1.2主要儀器 純水儀（Sartorius 611VF) ;90-3磁力攪拌器（上海振捷實驗設(shè)備有限公司）； ZRD-7080全自動新型鼓風干燥箱（上海智城分析儀器制造有限公司）；AB204-N電子讀數(shù) 分析天平（梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司產(chǎn)品）；SK6200H型超聲波清洗器（上 海科導超聲儀器有限公司）。
[0014] 本實施例薏苡仁水提物是將薏苡仁l〇〇g每次用其10倍重量的水l〇〇〇g(即 1000ml)先浸泡0. 5h，然后煎煮3次，每次煎煮50min，合并三次水煎液，減壓濃縮干燥得到 薏苡仁水提物，平均得率為10. 38%，該水提物可制備雌激素類藥物，用于治療由于體內(nèi)雌性 激素分泌不足而引起的疾病，如婦女更年期綜合癥藥。
[0015] 實施例2 本實施例所用的材料與儀器： 1.實驗材料 1. 1實驗藥物與主要試劑 為無 Jf·"擎(墻勢]著? Coixlacroyma-jobi L. var. ma-yuen (Roman. ) Stapf 飽 干燥成熟種仁。秋季果實成熟時采割植株，曬干，打下果實，再曬干，除去外殼、黃褐色種皮 和雜質(zhì)，收集種仁，即為薏苡仁原藥材；試劑均為國產(chǎn)分析純。
[0016] 1.2主要儀器 純水儀（Sartorius 611VF) ;90-3磁力攪拌器（上海振捷實驗設(shè)備有限公司）； ZRD-7080全自動新型鼓風干燥箱（上海智城分析儀器制造有限公司）；AB204-N電子讀數(shù) 分析天平（梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司產(chǎn)品）；SK6200H型超聲波清洗器（上 ?？茖С晝x器有限公司）。
[0017] 本實施例薏苡仁水提物是將薏苡仁500g每次用其11倍重量的水5500g(即 5500ml)先浸泡0. 6h，然后煎煮3次，每次lh，合并三次水煎液，減壓濃縮干燥得到薏苡仁水 提物，平均得率為10. 98%，該水提物可制備雌激素類藥物，用于治療由于體內(nèi)雌性激素分泌 不足而引起的疾病，如婦女更年期綜合癥藥。
[0018] 實施例3 本實施例薏苡仁水提物是將薏苡仁l〇〇〇g每次用其12倍重量的水12000g(即 12000ml)先浸泡0. 7h，然后煎煮4次，每次lh，合并四次水煎液，減壓濃縮干燥得到薏苡仁 水提物，平均得率為11. 62%，該水提物可制備雌激素類藥物，用于治療由于體內(nèi)雌性激素分 泌不足而引起的疾病，如婦女更年期綜合癥藥。
[0019] 根據(jù)本實施例中的方法按薏苡仁和水的比例可以通過工業(yè)化生產(chǎn)制得任意量的 薏苡仁水提物，用于制備雌激素類藥物，有效解決由于體內(nèi)雌性激素分泌不足而引起的疾 ?。ㄈ鐙D女更年期綜合癥等）的用藥問題，并經(jīng)試驗得到了充分證明。
[0020] 本實施例試驗資料如下： 采用細胞增殖實驗、動物實驗及報告基因技術(shù)研究薏苡仁水提物的雌激素樣作用，其 有關(guān)試驗資料如下： 首先，通過MCF-7細胞增殖實驗（E-SCREEN)，發(fā)現(xiàn)薏苡仁水提物能夠促進MCF-7細胞的 增殖，提示其在體外具有雌激素樣作用。
[0021] 其次，通過小鼠子宮增重實驗，證明薏苡仁水提物能夠顯著增加性未成熟雌性小 鼠的子宮系數(shù)，提示其在體內(nèi)具有雌激素樣作用。
[0022] 最后，通過ERE調(diào)控的報告基因瞬時表達檢測，進一步說明薏苡仁水提物是通過 與雌激素受體ERa和ERi3的結(jié)合而發(fā)揮雌激素樣作用。
[0023] 本實施例已通過實驗證明了本發(fā)明藥物在制備雌激素類藥物中的新用途，其主要 實施方案如下： 一、實驗材料與方法 1.實驗藥物 為無 Jf·"擎(墻勢]著? Coixlacroyma-jobi L. var. ma-yuen (Roman. ) Stapf 飽 干燥成熟種仁。秋季果實成熟時采割植株，曬干，打下果實，再曬干，除去外殼、黃褐色種皮 和雜質(zhì)，收集種仁，即為薏苡仁原藥材。
[0024] 2.實驗動物與細胞株及質(zhì)粒 昆明種小鼠，雌性，出生21天（剛斷乳），體重9?12g，購于河南省實驗動物中心。 人乳腺癌細胞（MCF-7)購自中國醫(yī)學科學院基礎(chǔ)醫(yī)學研究所細胞資源中心。HEK293細 胞株購于中國典型培養(yǎng)物保藏中心。β -半乳糖苷酶（β -galactosidase，β-gal)對 照質(zhì)粒Ρ β gal-Contro 1、重組報告基因 pERE-TAL-luc由軍事醫(yī)學科學院生物工程研究 所葉棋濃博士惠贈。重組人ER a (humanER a，hER α )表達載體pCXN2_hER α和重組人 ERi3(humanERi3, hERP)表達載體 pCXN2_hERi3 由東京大學醫(yī)學系 Satoshi Inoue 博士惠 贈。
[0025] 3.主要試劑 DMEM高糖培養(yǎng)基和陽離子脂質(zhì)體LipofectamineTM2000 Reagent購自Gibco Invitrogen公司；胎牛血清購自廣州四季青公司；無酚紅DMEM高糖培養(yǎng)基、葡聚糖-活 性炭去激素胎牛血清購自Hyclone公司；17 β -雌二醇（17 β -estrogen, E2)、氨節(jié)青霉素 (Amp)、Tris堿均購自Sigma公司；戊酸雌二醇片（拜耳醫(yī)藥）；鄰-硝基苯-β -D-半乳批 喃糖苷（〇_Nitrophenyl-β -D-galactopyranoside，ONPG)、EDTA、ΜΤΤ 及 DMS0 為 Amresco 公司產(chǎn)品；Steady-Glo穩(wěn)定突光素酶檢測系統(tǒng)試劑盒（Steady-Glo Luciferase Assay Systerm)、閃亮裂解緩沖液（Glolysis Buffer)購自Promega公司；酵母粉（0X0ID公司）； 胰蛋白胨（0X0ID公司）；瓊脂糖（Biowest公司）；感受態(tài)大腸桿菌DH5a (TransGen公司）； 質(zhì)粒小提試劑盒（天根公司）；其余試劑均為國產(chǎn)分析純。
[0026] 4.所用主要儀器 普通手術(shù)器械；二氧化碳培養(yǎng)箱（STIK);倒置顯微鏡（NIKON ECLIPSE TS100); SORVALL ST16R Centrifuge 高速低溫冷凍離心機（Thermo Fisher Scientific 公司）；酶標 儀（BIO-RAD 680);純水儀（Sartorius 611VF) ;90-3磁力攪拌器（上海振捷實驗設(shè)備有限 公司）；ZRD-7080全自動新型鼓風干燥箱（上海智城分析儀器制造有限公司）；微量加樣 器（Nichipet EX PLUS) ;AB204-N電子讀數(shù)分析天平（梅特勒-托利多儀器（上海）有限 公司產(chǎn)品）；l〇cm培養(yǎng)皿、96孔培養(yǎng)板、凍存管均為Corning公司生產(chǎn)；超凈工作臺（江蘇 蘇凈集團）；Bio Mate 3S 紫外分光光度計（Thermo Fisher Scientific 公司）；VeritasTM 微板光度計（TurnerBioSystems公司）；SK6200H型超聲波清洗器（上海科導超聲儀器有限 公司）；LRH系列生化培養(yǎng)箱（上海一恒科技有限公司）。
[0027] 5.實驗方法 5. 1 MCF-7細胞增殖實驗 MCF-7細胞（人乳腺癌細胞）經(jīng)無酚紅含5%去雌激素血清的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)1周 后，選取對數(shù)生長期細胞，PBS洗兩次，用0.05%胰蛋白酶消化后，加入無酚紅DMEM培養(yǎng)基 吹打均勻，以6X 104個/ml的濃度接種于96孔板內(nèi)，每孔培養(yǎng)總體積為20〇μ1。培養(yǎng)24h 待細胞貼壁后，換為含藥培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)。37°C、5%C02培養(yǎng)48h后，每孔加入MTT溶液 (5mg · ml-1) 2〇μ1，37°C繼續(xù)培養(yǎng)4h，小心吸凈培養(yǎng)液，每孔加入15(^1DMS0,震蕩5-10min，使 紫色結(jié)晶完全溶解。以DMS0調(diào)零，用酶標儀在490nm下測定各孔吸光度值（A)，計算平均A 值和增殖率（Proliferation Rate，RP)。實驗平行重復(fù)三次。
[0028] RP%=(實驗組A值-空白組A值）X空白組A值-X 100% 5. 2小鼠子宮增重實驗 將小鼠按體重均衡和隨機的原則分組。給藥持續(xù)7天。空白對照組每日蒸餾水 0.2ml，10g4灌胃；陽性對照組每日戊酸雌二醇（O.SSmg^kgH.cr1)灌胃；薏苡仁水提物按 臨床用藥的20倍量X提取率為低劑量，臨床用藥的40倍量X提取率為高劑量計算，配成 相應(yīng)濃度的混懸液，每日按〇. 2ml · 10g4灌胃。最后一次給藥24h后，脫頸處死小鼠，立即 摘取子宮稱重，計算子宮系數(shù)（子宮濕重X(體重ΓΧ 100%)。實驗平行重復(fù)三次。結(jié)果 與空白組相比，計算Ρ值，考察有無統(tǒng)計學意義。
[0029] 5. 3 ERE調(diào)控的報告基因瞬時表達檢測 5. 3. 1細胞接種 于轉(zhuǎn)染前24h將處于對數(shù)生長期的HEK293細胞（人胚腎細胞）接種于24孔板，密度 為16. OX 104個/0. 5ml/孔，且培養(yǎng)液為含10%去雌激素血清的不含抗生素的無酚紅DMEM 培養(yǎng)液，分別設(shè)置空白對照孔、雌二醇孔及待測藥物孔。
[0030] 5. 3. 2質(zhì)粒的轉(zhuǎn)染 (1) 待細胞布皿80%-90%時，小心吸出原培養(yǎng)基，加入42〇μ1含10%去雌激素血清的不 含抗生素的無酚紅DMEM培養(yǎng)基。
[0031] (2)取 3 只 ΕΡ 管，ER α 管中加 49〇μ1 無酚紅 DMEM 培養(yǎng)基、9PlpCXN2_hER α 質(zhì)粒（80ng · yrOdKlpERE-TAL-luc 質(zhì)粒（400ng · yrOjKlpPgal-Control 質(zhì) 粒（200ng · μ Γ1) ;ERP 管中力口 49〇μ1 無酚紅 DMEM 培養(yǎng)基、9PlpCXN2-hER3 質(zhì) 粒（80ng · μ Γ1)、9KlpERE-TAL_Iuc 質(zhì)粒（400ng · μ Γ1)、9μ1 β gal-Control 質(zhì)粒 (200ng · μ Γ1);脂質(zhì)體管中加入100〇μ1無酚紅DMEM培養(yǎng)基和36μ1脂質(zhì)體。
[0032] (3)倒轉(zhuǎn)混勻脂質(zhì)體管，室溫放置5min,取51〇μ1分別加入ERa和ERP管，輕輕 混勻，室溫放置20min ; (4)取8〇μ1ΕΙ?α管中脂質(zhì)體/DNA復(fù)合物分別加入24孔板ERa實驗孔，取8〇μ1ΕΙ?β 管中脂質(zhì)體/DNA復(fù)合物分別加入24孔板ERi3實驗孔。前后搖勻，放入培養(yǎng)箱。
[0033] (5) 4_6h后加入對照藥物和檢測藥物。
[0034] 5. 3. 3 ERE調(diào)控的報告基因瞬時表達檢測 加藥后24h的細胞，從培養(yǎng)箱中取出細胞，室溫平衡20min，吸去培養(yǎng)液。按照 Steady-Glo穩(wěn)定突光素酶檢測系統(tǒng)試劑盒（Steady-Glo Luciferase Assay Systerm)及閃 亮裂解緩沖液（Glolysis Buffer)改良操作步驟操作，收集細胞裂解上清液，加入熒光素酶 反應(yīng)底物（熒光素），置于暗處，用VeritasTM微板光度計檢測熒光強度。
[0035] 5. 3. 4 β -gal 活性檢測 為了考察轉(zhuǎn)染效率，對內(nèi)參照β-gal活性進行檢測。
[0036] (1) 54μ1 β -巰基乙醇加入40ml Z-buffer中，混勻，取EP管，每管加1800μ1 ; (2) 每管加2〇μ1裂解上清液； (3) 每管加40〇μ1 0NPG，倒轉(zhuǎn)混勻； (4) 放置37°C溫箱，至顯黃色； (5) 加 Na2C03lml終止反應(yīng)； (6) 測 0D420 值； (7) 計算標準化的熒光素酶活性； 二、統(tǒng)計處理 實驗數(shù)據(jù)以^ ±s表示，SPSS18. 0進行單因素方差分析統(tǒng)計處理。
[0037] 三、實驗結(jié)果 1.給藥48小時后薏苡仁水提物對MCF-7細胞增殖的影響 結(jié)果顯示，薏苡仁水提物在l、〇. l、〇. 〇l、〇. 〇〇l、〇. 〇〇〇l、〇. OOOOlmg^mr1時與空白對照 組比，對MCF-7細胞均有極顯著的促增殖作用（P〈0. 01)。提示薏苡仁水提物在體外具有雌 激素樣活性。見表1，圖1。
[0038] 表1薏苡仁水提物對MCF-7增殖的影響（^ ± s, n=6)

【權(quán)利要求】
1. 苡仁水提物在制備雌激素類藥物中的應(yīng)用，其特征在于：所述薏苡仁水提物用于制 備雌激素類藥物。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的薏苡仁水提物在制備雌激素類藥物中的應(yīng)用，其特征在于： 所述薏苡仁水提物是將薏苡仁每次用其10-12倍重量的水先浸泡0. 5-0. 7h，然后煎煮3-4 次，每次煎煮50-60min，合并煎煮液，減壓濃縮干燥得到薏苡仁水提物；所述薏苡仁水提物 用于制備雌激素類藥物。
【文檔編號】A61P15/12GK104138547SQ201410349638
【公開日】2014年11月12日 申請日期:2014年7月22日 優(yōu)先權(quán)日:2014年7月22日
【發(fā)明者】鄭曉珂, 張娜, 王小蘭, 王曉帆, 赫金麗, 劉小盼, 李鵬飛, 婁永, 馮衛(wèi)生, 匡海學 申請人:河南中醫(yī)學院, 黑龍江中醫(yī)藥大學