專利名稱：微生物發(fā)酵正烷烴生產(chǎn)長鏈α，W-二羧酸的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及微生物發(fā)酵正烷烴生產(chǎn)長鏈α，W-二羧酸，尤其是發(fā)酵正十五烷，高產(chǎn)十五碳二羧酸的方法。
長鏈二羧酸是合成香料，尼成工程塑料、熱熔膠、樹脂、耐寒性增塑劑等的重要原料。十二個碳以上的長鏈二羧酸，自然界中不存在，化工上也還沒有經(jīng)濟(jì)可行的合成方法，因此利用微生物特異的氧化能力，在常溫常壓下，轉(zhuǎn)化石油中的正烷烴，生產(chǎn)長鏈二羧酸早已引起科學(xué)家們的重視和深入研究。
十五碳二羧酸是合成名貴香料環(huán)十五酮和麝香酮(即3-甲基-環(huán)十五酮)的重要原料，后者是天然麝香的主要成分之一。以人工合成的麝香酮代替稀罕難得的天然麝香，配制多種中成藥，臨床應(yīng)用試驗表明，療效與天然麝香一樣顯著。
正十五烷也是微生物容易同化的一種烷烴，因此形成和積累十五碳二羧酸，特別是高產(chǎn)十五碳二羧酸比較困難。
在專利文獻(xiàn)中，雖有有關(guān)利用微生物從正烷烴發(fā)酵生產(chǎn)長鏈二羧酸的方法，但還沒有有關(guān)從正十五烷發(fā)酵生產(chǎn)十五碳二羧酸，特別是高產(chǎn)十五碳二羧酸的方法。在US4339536中，只有生產(chǎn)十二碳和十三碳二羧酸的實施例，而且產(chǎn)酸水平不高，只達(dá)到45g/L;而在US4624920中，只有在50ml和500ml搖瓶生產(chǎn)十四碳和十六碳二羧酸的實施例，且產(chǎn)酸水平太低，每升發(fā)酵液只有3mg;申請?zhí)枮?7105445和89102548的中國專利申請，主要是有關(guān)生產(chǎn)十六碳和十七碳二羧酸的方法，在16L罐上，產(chǎn)酸量分別為120g/L和133g/L。
日本植樹南海男等人報道過用一株熱帶假絲酵母突變株M2030從正十五烷生產(chǎn)十五碳二羧酸，在3升罐上，產(chǎn)酸達(dá)到90g/L左右;上海沈永強(qiáng)等人報道過用一株熱帶假絲酵母N-15的高濃度靜止細(xì)胞(菌濃為15×108個/毫升)轉(zhuǎn)化正十五烷為十五碳二羧酸時達(dá)到109g/L，(《植物生理學(xué)報》1980.Vol.6，No1)。但實驗室發(fā)酵試驗時，發(fā)酵8天，DC15的產(chǎn)量只達(dá)到77.2g/L。其他有關(guān)發(fā)酵生產(chǎn)十五碳二羧酸的報道都只有40-50g/L。因此用微生物發(fā)酵高產(chǎn)出地生產(chǎn)DC15是一個仍需解決的問題，本發(fā)明的目的是提供一種生產(chǎn)C11-C17單一長鏈二羧酸和混合長鏈二羧酸的方法，特別是高產(chǎn)出地生產(chǎn)DC15的方法。
本發(fā)明所用的菌株為熱帶假絲酵母(Candida tropicalis)NP-6-126，是以一株氧化正烷烴生產(chǎn)混合二羧酸的熱帶假絲酵母(參見《微生物學(xué)報》20(1)88-93，1980)為出發(fā)菌株，通過亞硝酸和紫外線的多次反復(fù)誘變篩選培育出來的，能從C11-C17的各種單一正烷烴和混合正烷烴，尤其是正十五烷，高產(chǎn)出地生產(chǎn)相應(yīng)鏈長的二羧酸。熱帶假絲酵母NP-6-126(以下簡稱NP-6-126)保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏號為CGMCC NO.0206。
NP-6-126的生理特性如下一、糖類的發(fā)酵葡萄糖+，半乳糖+，蔗糖+，麥芽糖+，乳糖-。
二、同化，葡萄糖+，半乳糖+，山梨糖-，蔗糖+，麥芽糖+，纖維二糖+，海藻糖+，乳糖-，密二糖-，棉子糖-，松三糖+，菊芋糖-，可溶性淀粉+，木糖+，L-阿戊糖+，D-阿戊糖-，核糖-，鼠李糖-，α-甲基葡萄糖苷+，甘油+，乙醇+，赤蘚醇-，甘露醇+，肌醇-，核糖醇+，半乳糖醇-，葡萄糖醇+，檸檬酸鈉-，丁二酸鈉+，乳酸鈣-。
三、生長素的需要生物素++，維生素B1++，維生素B2+，維生素B6+，維生素B12+，葉酸+，煙酸+，泛酸十，肌醇十，對氨基苯甲酸十。
四、其它硝酸鹽-，凍化牛奶-，熊果酸分解-，凝固牛級-，油脂酶-。
形態(tài)特征奶油白色，皺褶型，菌落為蛋糕狀和桃酥狀。
培養(yǎng)特征在麥芽汁液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)時，假菌絲多而長;在烷烴種子培養(yǎng)基中培養(yǎng)時，有一定數(shù)量的短假菌絲;而在發(fā)酵培養(yǎng)基中發(fā)酵時，大部分是單個橢園細(xì)胞。
本發(fā)明的種子培養(yǎng)基(1)、10個巴林糖度的麥芽汗加2%瓊脂制成的固體斜面;(2)、10個巴林的麥芽汁液體培養(yǎng)基;(3)烷烴種子培養(yǎng)基包含KH2PO46-12g/L，玉米漿3-8g/L，酵母膏3-8g/L，蔗糖3-8g/L，尿素3-6g/L，重蠟或正十五烷40-70ml/L，自來水配制，自然pH。
培養(yǎng)種子的過程為取一接種環(huán)NP-6-126酵母菌體，涂布在麥芽汁固體斜面上(15×180試管，每支裝6-7ml培養(yǎng)基，放成斜面)，于28-30℃培養(yǎng)40小時。取一支上述培養(yǎng)好的NP-6-126菌種全部刮入裝有25ml烷烴種子培養(yǎng)基的250ml三角瓶中，于28-30℃220轉(zhuǎn)/分的旋轉(zhuǎn)搖床上培養(yǎng)40-48小時，作為搖瓶發(fā)酵種子或者取兩支上述培養(yǎng)好的NP-6-126菌種全部刮入裝有500ml培養(yǎng)基的5000ml三角瓶中，于180轉(zhuǎn)/分旋轉(zhuǎn)搖床上28-30℃培養(yǎng)44-48小時，作為一級種子罐的種子。
用本發(fā)明的NP-6-126菌株生產(chǎn)長鏈二羧酸，特別是十五碳二羧酸的具體方法是把發(fā)酵種子接入pH5.5-9.0，最好為6.5-7.5的含有15-45%(V/V)的C11-C19的正烷烴和85-55%(v/v)發(fā)酵培養(yǎng)基的混合液中。發(fā)酵培養(yǎng)基的組成為堿金屬磷酸鹽6-14g/L，最好為7-10g/L，氯化鈉0.5-2.0g/L、酵母膏1-6g/L，最好為3-5g/L，玉米漿0.5-2g/L，尿素0.5-2.5g/L，最好為1.0-2.0g/L，硝酸鹽5-15g/L，最好為6-12g/L，二甲基亞砜10-20ml，消泡劑400-1200ppm以及一些其他公知的營養(yǎng)源，在pH6.5-7.5下將上述混合物在25-35℃，最好在27-31℃通氣發(fā)酵48-170小時，每隔6-8小時用NaOH溶液調(diào)一次pH值，pH值控制在7.5-8.5之間。然后將產(chǎn)生的二羧酸從發(fā)酵液中分離出來。在發(fā)酵開始時，混合液中正烷烴含量為10-20%(v/v)，以后在適當(dāng)時間補(bǔ)加正烷烴，使發(fā)酵液中正烷烴濃度始終≥5%(v/v)為準(zhǔn)。堿金屬磷酸鹽可從KH2PO4、NaH2PO4，K2HPO4和Na2HPO4中選一種。硝酸鹽可從鉀或鈉鹽中選一種。
發(fā)酵結(jié)束后，加入適量的水，加堿至pH10-12，加熱至85-90℃，進(jìn)行破乳分層，上層為殘油，回收再用，放出中間清液，下層菌體層再處理一次或壓濾或離心，合并清液，加入適量活性炭，在85-90℃脫色30分鐘，除去活性炭后，脫色液加熱至60-70℃，加HCl或H2SO4至pH4-5進(jìn)行酸化結(jié)晶，冷卻至30℃后，壓濾，用空氣吹干，60℃烘干，得白色十五碳二羧酸結(jié)晶。
用本發(fā)明的NP-6-126菌株和發(fā)酵方法，可生產(chǎn)C11-C19的各種單一和混合二羧酸。其中在2.5噸罐上，從正十五烷發(fā)酵生產(chǎn)十五碳二羧酸，發(fā)酵6天，產(chǎn)酸量高達(dá)170-180g/L，后處理總收率達(dá)到80%，純度達(dá)到96%左右。
實例一(1)、取一接種環(huán)NP-6-126菌種，涂布在15×180大試管麥芽汁固體斜面上，30℃培養(yǎng)兩天。
(2)、取上述菌種一支，接入裝有25ml烷烴種子培養(yǎng)基的250ml三角瓶中于30℃在220轉(zhuǎn)/分的旋轉(zhuǎn)搖床上培養(yǎng)48小時。烷烴種子培養(yǎng)基中KH2PO48g/l，酵母膏5g/l，玉米漿3g/l，蔗糖5g/l，尿素3g/l，重蠟50ml/l，自來水配制，pH5.0。
(3)、在裝有15ml發(fā)酵培養(yǎng)基的500ml三角瓶中，接入3.5ml上述種子液，在200轉(zhuǎn)/分旋轉(zhuǎn)搖床上發(fā)酵4天，每24小時用NaOH調(diào)一次pH至7.5-8.0。發(fā)酵培養(yǎng)基含KH2PO48g/l，酵母膏2g/l，玉米漿1g/l，氯化鈉1.5g/l，尿素1g/l，正十五烷200ml/l，泡敵500ppm，KNO36g/l，自來水配制，pH7.5，在110℃下滅菌30分鐘。發(fā)酵結(jié)束后，用HCl調(diào)pH至3，用100ml乙醚提取，除去乙醚，得白色結(jié)晶，用標(biāo)準(zhǔn)NaOH溶液滴定，計算二羧酸含量。結(jié)果DC11產(chǎn)量為53.6g/l，經(jīng)氣相色譜分析，DC11純度為98.11%。
實例2按照實例1的方法，只是正烷烴用nC15，結(jié)果DC15的產(chǎn)量為73.5g/l，純度為96.31%。
實例3按照實例1的方法，只是正烷烴用nC17，結(jié)果DC17的產(chǎn)量為53.9g/l，純度為98.2%。
實例4種子培養(yǎng)基和培養(yǎng)方法同實例1，發(fā)酵培養(yǎng)基為KH2PO48g/l，NaCl lg/L，酵母膏2g/l，玉米漿1g/L，KNO39g/l，二甲基亞砜6ml/l，泡敵600ppm，尿素1.2g/L，正十五烷200ml/l，自來水配制，pH7.5。把1.5L培養(yǎng)兩天，鏡檢無雜菌的NP-6-126菌株種液接入裝有8L發(fā)酵培養(yǎng)基，經(jīng)121℃滅菌30分鐘的16L自動控制罐中，在29℃，800轉(zhuǎn)/分，罐壓1Kg/cm2，通氣量1∶1，24小時后pH控制在7.5，發(fā)酵165小時，DC15的產(chǎn)量達(dá)到130.1g/L。
實例5種子培養(yǎng)基和培養(yǎng)方法同實例一，發(fā)酵培養(yǎng)基同實例二。把培養(yǎng)兩天，經(jīng)鏡檢無雜菌的400L，NP-6-126種液接入裝有1500L發(fā)酵培養(yǎng)基，經(jīng)121℃滅菌40分鐘的2500L發(fā)酵罐中，29℃，200轉(zhuǎn)/分，罐壓0.8Kg/cm2，通氣量1∶0.8，開始時，正十五烷300L，24小時后，每隔8-6小時，用NaOH溶液調(diào)一次pH至7.5，從第三天開始，每天補(bǔ)加正十五烷120L，共3次，發(fā)酵6天(144小時)，發(fā)酵清液中十五碳二羧酸含量為178g/L。發(fā)酵結(jié)束后，加入一倍體積自來水，加熱至90℃，加堿調(diào)pH至10，冷卻降溫至50℃后，放入分層罐中靜量分層一天，放出上層殘油，共60L，下層菌層通過壓濾、除去菌體，濾清液與中層清液合并，加入0.7%活性炭，90℃脫色15分鐘，壓濾除去活性炭，脫色濾清液打入酸化罐中，加水至DC15濃度為4%，加熱至70℃，加入濃HCl酸化至pH4，冷卻降溫至30℃左右，板框壓濾，空氣吹干，固形物在60℃烘干，得白色DC15229Kg，后處理總收率85.76%，純度為96.5%。
權(quán)利要求
1.一種利用微生物發(fā)酵生產(chǎn)C11-C17長鏈α，W-二羧酸的方法，其特征在于它包括在以C11-C17的正烷烴為基質(zhì)的培養(yǎng)基中，用熱帶假絲酵母(Candida tropicalis)NP-6-126，即CGMCC NO.0206發(fā)酵然后回收所形成的二羧酸。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其特征在于所說的C11-C17的α，W-二羧酸為十五碳二羧酸，所說的正烷烴為正十五烷。
3.熱帶假絲酵母(Candida tropicalis)NP-6-126，即CGMCC NO.0206菌株。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種利用微生物發(fā)酵生產(chǎn)長鏈α，W-二羧酸的方法，特別是高產(chǎn)十五碳二羧酸(DC
文檔編號C12P7/46GK1092108SQ9410059
公開日1994年9月14日 申請日期1994年1月28日 優(yōu)先權(quán)日1994年1月28日
發(fā)明者陳遠(yuǎn)童, 劉挺, 龐月川, 郝秀珍 申請人:中國科學(xué)院微生物研究所