一種真核細(xì)胞III型啟動(dòng)子表達(dá)CRISPR sgRNA的方法及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本申請?jiān)O(shè)及基因啟動(dòng)子表達(dá)技術(shù)，屬于生物技術(shù)領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002] Drosha:-種III型核糖核酸酶，通過識(shí)別mRNAs中類似于miRNAs前體的二級(jí)莖 環(huán)結(jié)構(gòu)來定位和切割mRNAs，運(yùn)在干細(xì)胞中抑制基因表達(dá)的機(jī)制中有重要作用。
[0003] 在生物體內(nèi)，miRNA的成熟較siRNA雙鏈的形成過程要復(fù)雜，概括為：首先miRNA 的前體pri-miRNA在核內(nèi)由一種稱為化osha酶處理后成為大約70nt的帶有莖環(huán)結(jié)構(gòu) 的Pre州rsormiRNAs(pre-miRNAs)值enlietal.,2004;Gregoryetal.,2004;Hanet al. , 2004);運(yùn)些pre-miRNAs在Expodin-5幫助下轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞核外之后再由胞質(zhì)Dicer酶 進(jìn)行處理，酶切后成為成熟的miRNAs(Lundetal.，2004;Yietal.，2003)。
[0004]CRISPR:規(guī)律成簇間隔短回文重復(fù)blusteredregularlyinterspacedshort palin化omicr巧eats)，細(xì)菌的II型CRISPR/Cas系統(tǒng)逐漸成為同時(shí)打祀多個(gè)基因位點(diǎn)的 重要工具。
[0005]shRNA:sho;rthai;rpinRNA,"短發(fā)夾RNA"。shRNA包括兩個(gè)短反向重復(fù)序列，克 隆到shRNA表達(dá)載體中的shRNA包括兩個(gè)短反向重復(fù)序列，中間由一莖環(huán)（loop)序列分隔 的，組成發(fā)夾結(jié)構(gòu)，由polIII啟動(dòng)子控制。隨后再連上5-6個(gè)T作為RNA聚合酶III的轉(zhuǎn)錄終 止子。在活體中輸送"小干擾RNA"(siRNA)的一種辦法是，將SiRNA序列作為"短發(fā)夾"克隆 進(jìn)質(zhì)粒載體中。當(dāng)送入動(dòng)物體內(nèi)時(shí)，該發(fā)夾序列被表達(dá)出來，形成一個(gè)"雙鏈RNA"(shRNA)， 并被RNAi通道處理。
[0006] 高等生物通常都有復(fù)雜的基因網(wǎng)絡(luò)來確保細(xì)胞內(nèi)的生物活動(dòng)有條不素的進(jìn)行。因 此，能夠同時(shí)打祀多個(gè)位點(diǎn)的分子工具對(duì)遺傳工程的基礎(chǔ)研究和實(shí)際應(yīng)用都有巨大意義。 近年來，細(xì)菌的II型CRISPR/Cas系統(tǒng)逐漸成為達(dá)成運(yùn)一目的的重要工具。從釀脈鏈球菌 中分離得到的化s9核酸內(nèi)切酶通過人工修飾的引導(dǎo)RNA(guideRNA，gRNA)的導(dǎo)向作用可 W打祀DNA序列的5' -N20-NGG-3' (N代表任何脫氧核巧酸堿基），N20是與gRNA的5'序 列相同的20個(gè)堿基，NGG是PAM區(qū)（protospacer-adjacentmotif)?；痵9剪切的位點(diǎn)就是 PAM附近的區(qū)域。運(yùn)種可W人為修飾的導(dǎo)向RNA和基因組中PAM的高發(fā)率使得化s9-gRNA 幾乎可W打祀所有的基因元件來實(shí)現(xiàn)基因組編輯。正是由于它的簡單高效性，基于化s9的 基因編輯工具發(fā)展迅速，被用于基因組和表觀基因組編輯，轉(zhuǎn)錄調(diào)控和基因工程的其他應(yīng) 用。
[0007] 從理論上來講，多基因編輯可W通過化s9和祀向不同位點(diǎn)的多個(gè)SgRNA-起表達(dá) 來實(shí)現(xiàn)。傳統(tǒng)的方法通過顯微注射或者表達(dá)包含多個(gè)單一gRNA(SgRNA)的表達(dá)盒來實(shí)現(xiàn)。 將體外表達(dá)的曲NA和化s9蛋白（或者化s9的mRNA)注射到細(xì)胞或者胚胎只適用于很少的 一些系統(tǒng)。因此，最理想的方法就是將多個(gè)SgRNA的表達(dá)盒壓縮到一個(gè)載體上。一個(gè)典型的 SgRNA的表達(dá)盒大約是400-5(K)bp，包含RNA聚合酶III任〇1III)的啟動(dòng)子，SgRNA和化1 Ill終止子。受傳遞方式和質(zhì)粒載體承載能力的限制，對(duì)于大多數(shù)生物來說，用運(yùn)一sgRNA表達(dá)方法同時(shí)表達(dá)多個(gè)sgRNA將是一種挑戰(zhàn)。而且，真核生物III型聚合酶轉(zhuǎn)錄的RNA需 要有一個(gè)特定的核巧酸開始，運(yùn)使得化s9/gRNA祀位點(diǎn)受限。一個(gè)好點(diǎn)的方法就是將多個(gè) SgRNA的表達(dá)盒壓縮到一個(gè)合成的基因中，利用一個(gè)RNA加工系統(tǒng)從初級(jí)轉(zhuǎn)錄本中將單個(gè) SgRNA分別剪切出來。應(yīng)用到運(yùn)一方法的成功案例只有利用Csy4內(nèi)切核糖核酸酶和tRNA剪 切系統(tǒng)。（KabinXie,BastianMinkenber邑，Yinon邑Yan邑，Boostin邑CRISPR/Cas9multiplex editingcapabilitywiththeendogenoustRNA-processingsystem,PNAS)然而，還需要 更有效和精確的方法來同時(shí)產(chǎn)生多個(gè)SgRNAW提高多基因編輯的能力和充分發(fā)揮化s9系 統(tǒng)的應(yīng)用。
[000引細(xì)胞中有大量的各種的RNA。在不同組織中，RNA的合成是高度保守的，并且有各 種精細(xì)的RNA加工系統(tǒng)來確保其正確的剪切。運(yùn)一特點(diǎn)啟發(fā)我們可W用一個(gè)有內(nèi)切酶功 能的RNA加工系統(tǒng)來從一個(gè)轉(zhuǎn)錄本切出多個(gè)SgRNA。最近在植物上的一個(gè)研究表明，多個(gè) SgRNA可W由一個(gè)tRNA-gRNA結(jié)構(gòu)的合成基因通過內(nèi)源的RNase的精確剪切產(chǎn)生。化油in Xie,BastianMinkenberg,YinongYang,BoostingCRISPR/Cas9multiplexediting cap油ilitywiththeendogenoustRNA-processingsystem,PNA巧運(yùn)一研究說明在植物 中不僅可W實(shí)現(xiàn)多基因打祀，而且大大提高了CRISPR/tas9系統(tǒng)用于基因組編輯的效率。 然而，類似的方法在動(dòng)物中未見報(bào)道。
[0009] III型核糖核酸酶（RNaseIII) -直被認(rèn)為在生物正常表達(dá)小RNA(miRNAs)的 過程中有關(guān)鍵作用。多年來，人們一直忽視了它們在其他RNA(例如SgRNA、shRNA等）的 產(chǎn)生過程中的重要作用。作為RNaseIII家族的一員，化osha就可W識(shí)別并切割信使 RNA(mRNAs)，并可能在核糖體RNA(rRNA)的加工過程中起作用。Drosha通過識(shí)別mRNAs中 類似于miRNAs前體的二級(jí)莖環(huán)結(jié)構(gòu)來定位和切割mRNAs，運(yùn)在干細(xì)胞中抑制基因表達(dá)的 機(jī)制中有重要作用。Dicer則可W通過調(diào)控許多小干擾RNA(smallinte計(jì)eringRNAs， siRNAs)的產(chǎn)生來調(diào)芐基因的表達(dá)，還可W促使細(xì)胞內(nèi)有害的短RNA片段和病毒的RNA 降解來保護(hù)和維持細(xì)胞生物活動(dòng)的正常。（TimothyΜ.Johanson,An化ewΜ.Lew,Mark M.W.Chong,MicroRNA-independentrolesoftheRNaseIIIenzymesDroshaand Dicer,RoyalSocietyPublishging)

【發(fā)明內(nèi)容】

[0010] 本發(fā)明就是通過利用化osha的切割位點(diǎn)將多個(gè)SgRNA和shRNA的序列串聯(lián)起來， 通過一個(gè)真核細(xì)胞的III型啟動(dòng)子啟動(dòng)表達(dá)。從而實(shí)現(xiàn)同時(shí)產(chǎn)生多個(gè)SgRNAW提高多基因 編輯的能力和充分發(fā)揮化s9系統(tǒng)的應(yīng)用。
[0011] 本發(fā)明是利用一個(gè)真核細(xì)胞III型啟動(dòng)子扣6或H1)啟動(dòng)由化osha切割位點(diǎn)串 聯(lián)的多個(gè)發(fā)卡結(jié)構(gòu)小RNA的表達(dá)，在真核細(xì)胞內(nèi)表達(dá)后可W產(chǎn)生多個(gè)有生物活性的CRISPR SgRNA(本發(fā)明的DNA序列圖示如下）。WU6-sgRNA-shRNA-sgRNA的結(jié)構(gòu)為例，運(yùn)種U6啟 動(dòng)表達(dá)的結(jié)構(gòu)在一次轉(zhuǎn)錄中產(chǎn)生含有多個(gè)SgRNA和shRNA的初級(jí)轉(zhuǎn)錄本，在真核細(xì)胞中 運(yùn)些SgRNA經(jīng)過加工后可W分別識(shí)別各自的祀位點(diǎn)，從而指導(dǎo)化s9蛋白打祀多個(gè)位點(diǎn)，為 多基因編輯打下基礎(chǔ)。相比于傳統(tǒng)的分別表達(dá)多個(gè)單一gRNA的方法和植物上新近報(bào)道的 tRNA-gRNA系統(tǒng)，本發(fā)明的結(jié)構(gòu)更簡單，構(gòu)建更方便。此外，本發(fā)明還可W通過Golden Gate 的方法繼續(xù)串聯(lián)shRNA-sgRNA的序列打祀更多的位點(diǎn)或者表達(dá)多個(gè)shRNA干擾基因的表 達(dá)。
【附圖說明】
[001引圖1 :本發(fā)明DNA序列結(jié)構(gòu)圖；
[0013]圖 2 :Cas9 表達(dá)質(zhì)粒（pll3. 7-SpCas9(Notl))圖；
[0014]圖 3:中間載體pcDNA3. 1 (+) -CMV-3RNA質(zhì)粒圖；
[001引 圖4 :載體msgRNA-2的質(zhì)粒圖；
[001引圖5 :質(zhì)粒msgRNA-2酶切檢測結(jié)果；
[0017]圖6:雙巧光報(bào)告載體Re-SSA(CMV).VEGF的質(zhì)粒圖；
[001引圖7 :雙巧光報(bào)告載體Re-SSA牌la).CCR5a的質(zhì)粒圖；
[001引圖8 :VEGF位點(diǎn)報(bào)告載體檢測巧光效果圖（實(shí)驗(yàn)組和陽性對(duì)照組）；
[0020] 圖9 :CC貼a位點(diǎn)報(bào)告載體檢測巧光效果圖（實(shí)驗(yàn)組和陽性對(duì)照組）；
[0021] 圖10 :報(bào)告載體流式結(jié)果分析圖。
【具體實(shí)施方式】
[0022] 為使本發(fā)明的技術(shù)方案便于理解，W下結(jié)合利用III型啟動(dòng)子U6表達(dá)祀向人基因 組VEGF基因和CCR5基因的具體試驗(yàn)對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步的詳細(xì)說明，所述是對(duì)本發(fā)明的解 釋而不是限定。
[0023] 實(shí)施例1祀位點(diǎn)選擇
[0024] 基于CRISPR/Cas9系統(tǒng)打祀位點(diǎn)的特點(diǎn)，在基因組中尋找含有PAM(NGG/NGGNG)的 祀位點(diǎn)。再經(jīng)過〇?15口3〇631即網(wǎng)站化《口:/7^13口戶111^.6(111/)的篩選，選擇出^下兩個(gè) 位點(diǎn)作為祀位點(diǎn)：
[00巧]VEGF祀位點(diǎn)片段：
[0026]CTCGGCCACCACAGGGAAGCTGG(SEQIDN0:1)
[0027]CCR5a/CCR2 祀位點(diǎn)片段：
[0028]CACACTTGTCACCACCCCAAAGGTG(SEQIDNO:2)
[0029] 實(shí)施例2化s9蛋白表達(dá)載體
[0030] 將優(yōu)化過的釀脈鏈球菌化s9序列化Sp化s9)插入到骨架載體pi13. 7中。如圖2 所示。hSpCas9的序列如下（SEQIDN0:3):


[0100] 實(shí)施例3串聯(lián)多個(gè)小RNA表達(dá)載體（msgRNA-。
[0101]W實(shí)驗(yàn)載體為例，該載體設(shè)計(jì)為U6-sgRNA-shRNA-sgRNA結(jié)構(gòu)，根據(jù)選擇的兩個(gè)革己 位點(diǎn)（VEGF祀位點(diǎn)和CCR5a祀位點(diǎn)），分別設(shè)計(jì)對(duì)應(yīng)的sgRNA序列，中間用帶有化osha祀位 點(diǎn)的CD40shRNA序列。通過不同的限制性內(nèi)切酶的酶切位點(diǎn)將各個(gè)片段連在一起。本實(shí)驗(yàn) 使用的兩個(gè)化osha祀位點(diǎn)序列如下：
[0102] Drosha祀位點(diǎn)片段1:TCCGAGGCAGTAGGCA (SEQ ID NO:4)
[0103] Drosha祀位點(diǎn)片段2:TGCTGTTGACAGTGAGCG(SEQ ID NO:5)
[0104] 構(gòu)建該載體需要兩步。第一步，將3個(gè)RNA序列的基因片段插入到骨架載 體pcDNA3. 1 (+) (Invitrogen)上的多克隆位點(diǎn)Miel和Apal之間，各個(gè)片段之間分別 通過限制性內(nèi)切酶EcoRI、化〇1和Apal各自識(shí)別位點(diǎn)的序列來連接，即化el-VEGF. sgRNA-EcoRI-CD40.shRNA-XhoI-CCR5a.sgRNA-Apal的結(jié)構(gòu)。兩個(gè)sgRNA片段通過PCR引入 需要的酶切位點(diǎn)，CD40.shRNA片段通過酶切的方法獲得；第二步，用U6啟動(dòng)子替換掉CMV 啟動(dòng)子，最終獲得串聯(lián)表達(dá)多個(gè)小RNA的載體msgRNA-2。
[0105] 載體的具體構(gòu)建和檢測方法如下：
[0106] 3.1引物的設(shè)計(jì)與合成
[0107] 分別W包含目的片段的載體為模板，利用CloneManagerV7軟件進(jìn)行引物設(shè)計(jì)，設(shè) 計(jì)能夠特異擴(kuò)增VEGF.SgRNA片段的引物化el-VEGF.Sps曲.F和EcoRI-SpsgR.R，能夠特異 擴(kuò)增CCR5a.SgRNA片段的引物)(hoI-CCR5.a.SpsgRNA.F和Apal-SpsgRNA.R，能夠特異擴(kuò)增 U6啟動(dòng)子的引物Primer53(NdeI-冊L27-巧和Primer54(SacI-冊L27-R)。分別在相應(yīng)的 位置引入所需的酶切位點(diǎn)。引物序列設(shè)計(jì)如表1 :
[0108] 表1:實(shí)驗(yàn)引物設(shè)計(jì)表
[0109]
[0110] 其中：引物5'端的黑體斜體表示的堿基為酶切位點(diǎn)，前面的黑色字體為保護(hù)堿 基，帶下劃線的部分為與模板匹配的區(qū)域，剩下的黑色字體部分為引入的打祀序列。
[01川3.2 中間載體PCDNA3.1 (+)-CMV-3RNA的構(gòu)建