一種非衍生快速檢測(cè)藥用植物中結(jié)合氨基酸的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種非衍生快速檢測(cè)藥用植物中結(jié)合氨基酸的分析方法，屬于中藥材 成分分析領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002] 氨基酸是含有氨基的羧酸，是生物功能大分子蛋白質(zhì)的基本組成單元。在自然界 中主要以游離氨基酸和結(jié)合氨基酸兩種形式存在。藥用植物中兩種形式皆存在，除具有營(yíng) 養(yǎng)價(jià)值外，在發(fā)揮藥效時(shí)亦起著不可或缺的作用。其次，氨基酸含量的高低，可作為藥用植 物藥性判別的依據(jù)。而且，指標(biāo)性氨基酸可用于定性鑒別中藥材。因此，藥用植物中氨基酸 分析對(duì)于藥用植物鑒別，質(zhì)量評(píng)估及其相關(guān)產(chǎn)品的開發(fā)利用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。由于大多數(shù)氨 基酸的極性高、揮發(fā)性低、無(wú)強(qiáng)發(fā)色基團(tuán)，造成其分離和檢測(cè)極具挑戰(zhàn)性。氨基酸分析儀法 和色譜法是氨基酸分析最有效和最常用的方法，分析前預(yù)處理是確保分析結(jié)果準(zhǔn)確無(wú)誤的 關(guān)鍵環(huán)節(jié)之一。
[0003] 結(jié)合氨基酸前處理方法有傳統(tǒng)的酸、堿和酶水解法，以及非傳統(tǒng)的微波酸、堿和酶 水解法。其目的在于破碎組織細(xì)胞，使結(jié)合氨基酸鍵斷裂釋放出游離氨基酸。傳統(tǒng)的酸、堿 或酶水解法水解時(shí)間長(zhǎng)，存在水解過程繁瑣，能耗高，不適宜于快速檢測(cè)大量樣品以及氨基 酸水解率較低等缺點(diǎn)。另外，微波水解較常規(guī)的酸、堿和酶水解法相比較，耗時(shí)較短，但是微 波水解方法的準(zhǔn)確度有待于實(shí)驗(yàn)對(duì)比數(shù)據(jù)的討論分析和同行的認(rèn)可。
[0004] 氨基酸類物質(zhì)的水解率很大程度上取決于對(duì)樣品材料的細(xì)胞破壁狀況，目前破 壁的方法有超聲水解和微波水解等方法，但是他們存在諸多問題，如耗時(shí)或細(xì)胞破碎不完 全，導(dǎo)致結(jié)合氨基酸水解耗時(shí)耗能，水解效率低。高壓脈沖電場(chǎng)（High-voltage pulsed electric field，簡(jiǎn)稱HPEF)技術(shù)是近年來(lái)發(fā)展起來(lái)的一種新技術(shù)，機(jī)理是利用細(xì)胞膜電穿 孔原理在瞬間使細(xì)胞破壁，造成細(xì)胞膜電位混亂，細(xì)胞壁和細(xì)胞膜發(fā)生可逆或不可逆的破 壞，細(xì)胞組分流出。HPEF法引入氨基酸分析的前處理領(lǐng)域，具有處理時(shí)間短、能耗低、不易引 起目的產(chǎn)物變性等優(yōu)點(diǎn)，對(duì)更加客觀評(píng)價(jià)和利用藥用植物資源，保護(hù)生態(tài)環(huán)境，節(jié)約能源， 降低勞動(dòng)成本具有重要的意義。
[0005] 另外，傳統(tǒng)的氨基酸水解液在上柱前往往需要使用昂貴的萃取小柱進(jìn)一步純化， 以減少后期對(duì)分析色譜柱的污染。本專利則采用將氨基酸水解液冷凍復(fù)溶的方法，使得冷 凍后不溶于水解液溶劑的部分雜質(zhì)通過過濾和離心的方式去除掉，可以大大減低純化成本 和簡(jiǎn)化操作。
[0006] 氨基酸測(cè)定的方法主要有氨基酸分析儀法和色譜法。氨基酸分析儀由于價(jià)格昂 貴和專用分析柱價(jià)格高而缺乏普遍適用性。色譜方法主要有液相色譜法（LC)、氣相色譜法 (GC)、毛細(xì)管電泳法（CE)、離子交換色譜法（IEC)及液相色譜-質(zhì)譜/質(zhì)譜法（LC-MS/MS)。 從衍生角度可總結(jié)為衍生法和未衍生法兩種。首先衍生然后通過液相色譜-紫外檢測(cè)法， 液相色譜-熒光檢測(cè)法，氣相色譜法（GC)，毛細(xì)管電泳法（CE)或液相色譜-質(zhì)譜/質(zhì)譜法 (LC-MS/MS)法進(jìn)行檢測(cè)。其次未衍生法主要是HPLC (UPLC)-ELSD法和HPLC (UPLC)-MS 法以及離子交換色譜法。
[0007] 衍生化后通過紫外，熒光和質(zhì)譜法檢測(cè)氨基酸，雖然靈敏度和分離度得到較大程 度的提高。但是，存在較多弊端，如有的衍生法不能檢測(cè)亞氨基酸及含硫氨基酸，衍生物穩(wěn) 定性差，存在過量衍生試劑及副產(chǎn)物干擾、耗時(shí)以及個(gè)別氨基酸衍生化困難和不適宜大批 次樣品的檢測(cè)等問題。另外，目前的未衍生法，大多采用專用方法包，專用色譜柱和專用流 動(dòng)相，如 WatersAccQ-TagTM Ultra C18 (1.7 μ m，2· IX 100mm)，AccQ*Tag Ultra Eluent A及AccQ .TagUltra Eluent B等由于價(jià)格昂貴而不經(jīng)濟(jì)實(shí)用。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0008] 本發(fā)明提供一種非衍生同時(shí)快速檢測(cè)藥用植物中結(jié)合氨基酸的方法。針對(duì)前期氨 基酸分析前處理及分析方面的不足，提出全新的快速檢測(cè)方法。
[0009] 本發(fā)明的技術(shù)解決方案如下：首先采用高壓脈沖電場(chǎng)法對(duì)樣品進(jìn)行組織細(xì)胞破裂 及酸水解，然后將水解液冷凍再融化，最后采用超高壓液相色譜-蒸發(fā)光散射法對(duì)樣品液 進(jìn)行氨基酸含量測(cè)定。本發(fā)明采用高壓脈沖電場(chǎng)法酸水解氨基酸具有操作簡(jiǎn)單，樣品水解 快速完全，試劑用量少，快速節(jié)能，環(huán)境污染小等優(yōu)點(diǎn)。另外，分析前處理過程利用冷凍復(fù) 溶，通過"冰吐"作用純化目標(biāo)物，減少對(duì)分離柱的污染，延長(zhǎng)色譜柱的使用壽命；分析過程 中采用耐水的C18柱，有機(jī)試劑消耗少，綠色環(huán)保；最后采用蒸發(fā)光散射檢測(cè)器無(wú)需衍生， 操作簡(jiǎn)便，不引入衍生試劑及副反應(yīng)，適宜于大批次樣品的檢測(cè)，有較好的實(shí)用價(jià)值和前 景。
[0010] 本發(fā)明所述的一種非衍生同時(shí)快速檢測(cè)藥用植物中結(jié)合氨基酸的分析方法，主要 包括以下步驟： 1. 高壓脈沖酸水解結(jié)合氨基酸和水解液的冷凍及再融化分析前處理； 取待測(cè)藥用植物1.0 g于水解管中，加入6mol X L 1鹽酸溶液，除氧密封好，設(shè)置電場(chǎng)強(qiáng) 度IOkvXcm 1IO kvXcm 1，料液比1:5-1:15和脈沖時(shí)間30-90S進(jìn)行高壓脈沖法水解，待 冷卻至室溫后將水解液放置零下20-60度冷凍2-4小時(shí)，然后取出常溫溶化，隨后過濾，取 濾液ImL氮吹儀吹干，用流動(dòng)相溶解，過0. 22 μ m濾膜過濾備用； 2. 超高壓液相色譜-蒸發(fā)光散射檢測(cè)方法建立； 準(zhǔn)確稱取各標(biāo)準(zhǔn)品用〇. ImolXL 1鹽酸配制成0. 5-10 nmol XL 1的氨基酸標(biāo)準(zhǔn)液，采 用Hilic色譜柱(請(qǐng)參見圖1)，Amide色譜柱(請(qǐng)參見圖2)以及親水性C18色譜柱(請(qǐng)參見 圖3)對(duì)其進(jìn)行分離，以乙腈-水(均含0. 1-1%九氟丁酸和三氟乙酸）為流動(dòng)相進(jìn)行梯度洗 脫，梯度洗脫（A為離子對(duì)乙腈相，B為離子對(duì)水相）：0-0. 8min，0% A ;0. 8-1. 5min，12% A ; I. 5-4min，15% A ;4-5min，61% A ;5. l-8min，61% A ;8-8. lmin，0% A ;8. l-10min，0% A ;分 析時(shí)間IOmin。設(shè)置流速0. 3-0. 5 ml Xmin \ ELSD飄移管溫度60-80 °C，載氣流量20-40 PSI上UPLC-ELSD檢測(cè)。各濃度分別進(jìn)樣2 μ L測(cè)其峰面積，以進(jìn)樣濃度的對(duì)數(shù)為橫坐標(biāo)， 峰面積的對(duì)數(shù)為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。
[0011] 3.藥用植物中氨基酸含量測(cè)定： 按照上述液相色譜條件，對(duì)藥用植物水解待測(cè)液樣品中的氨基酸進(jìn)行分離檢測(cè)。進(jìn)樣 2 μ L，測(cè)定峰面積，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算藥用植物中氨基酸的含量。
[0012] 本發(fā)明所述的步驟1高壓脈沖酸水解結(jié)合氨基酸和水解液的冷凍及再融化分析 前處理，優(yōu)選為： 取待測(cè)藥用植物1.0 g于水解管中，加入6mol X L 1鹽酸溶液，除氧密封好，設(shè)置電場(chǎng)強(qiáng) 度為20kvX cm \料液比1:10和脈沖時(shí)間為90S進(jìn)行高壓脈沖法水解，待冷卻至室溫后將 水解液放置零下20-60度冷凍2-4小時(shí)，然后取出常溫溶化，隨后過濾完取濾液ImL氮吹儀 吹干，流動(dòng)相溶解后，過0. 22 μ m濾膜過濾備用。
[0013] 本發(fā)明所述的步驟2超高壓液相色譜-蒸發(fā)光散射檢測(cè)方法建立優(yōu)選為： 準(zhǔn)確稱取各標(biāo)準(zhǔn)品用〇. ImolXL1鹽酸配制成0.5-10 nmol XL 1的氨基酸標(biāo)準(zhǔn)液，采用 親水性C18色譜柱分離(請(qǐng)參見附圖3)，以乙腈-水(均含0. 7%九氟丁酸和0. 5%三氟乙 酸）為流動(dòng)相進(jìn)行梯度洗脫，梯度洗脫（A為離子對(duì)乙腈相，B為離子對(duì)水相）:0-0. 8min，0% A；0. 8-1. 5min,12% A；I. 5-4min,15% A；4-5min,61 % A；5. l-8min,61 % A；8-8. lmin,0% △ ;8.1-1011^11，0%4;分析時(shí)間10 1^11。設(shè)置流速0.4 1111\1^11141^0飄移管溫度70°(：，載 氣流量30 PSI上UPLC-ELSD檢測(cè)。各濃度分別進(jìn)樣2 μ L測(cè)其峰面積，以進(jìn)樣濃度的對(duì)數(shù) 為橫坐標(biāo)，峰面積的對(duì)數(shù)為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。
[0014] 按照上述液相色譜條件，對(duì)藥用植物水解待測(cè)液樣品中的氨基酸進(jìn)行分離檢測(cè)。 進(jìn)樣2 yL，測(cè)定峰面積，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算藥用植物中氨基酸的含量。各氨基酸出峰順序 為1.甘氨酸，2.絲氨酸，3.天冬氨酸，4.谷氨酸，5.蘇氨酸，6.丙氨酸，7.胱氨酸，8.脯氨 酸，9.纈氨酸，10.蛋氨酸，11.賴氨酸，12.組氨酸，13.異亮氨酸，14.精氨酸，15.亮氨酸， 16.苯丙氨酸，17.色氨酸。
[0015] 本發(fā)明的積極效果在于：采用高壓脈沖電場(chǎng)法酸水解氨基酸具有操作簡(jiǎn)單，樣品 水解快速完全，試劑用量少，快速節(jié)能，環(huán)