線粒體毒性檢測(cè)的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明提供了用于藥物篩選的新方法。特別地，該方法對(duì)于檢測(cè)物質(zhì)對(duì)線粒體的 作用，尤其是藥物物質(zhì)或候選藥物物質(zhì)的毒性或有益作用是有用的。該方法是基于體外活 的人線粒體中的測(cè)量，但是在盡可能接近體內(nèi)狀態(tài)的環(huán)境中。該方法還可用于檢測(cè)物質(zhì)對(duì) 線粒體呼吸的影響。
【背景技術(shù)】
[0002] 在藥物開發(fā)中，難以估計(jì)當(dāng)在人體中使用時(shí)，藥物是否會(huì)影響產(chǎn)生能量的線粒體。 由于如心臟或肝毒性作用，近年來由FDA批準(zhǔn)的多種新藥隨后被撤回。因此，在1994年和 2006年之間由FDA登記的新藥中，38種藥物均由于對(duì)肝和心臟的毒性作用被撤回，這是線 粒體毒性的典型癥狀。顯然，這些新藥通過了批準(zhǔn)以前進(jìn)行的標(biāo)準(zhǔn)毒性檢測(cè)，并且在用藥物 治療了大量患者之后才觀察到毒性作用。Dykens&Will(2007)指出，有證據(jù)表明，線粒體功 能障礙在從市場(chǎng)上撤回的以及再次引入的具有嚴(yán)格限制的多種藥物物質(zhì)的毒性中起作用。
[0003] 此外，在近幾年，線粒體功能已經(jīng)引起了很大的興趣，并且通常認(rèn)為線粒體功能障 礙對(duì)于大量疾病的發(fā)病機(jī)制（例如肌肉疾病、神經(jīng)病變、心肌病、腦病、敗血癥引起的多臟 器功能衰竭）是起作用的因素。
[0004] 目前，藥物候選物的線粒體毒性大部分是在動(dòng)物和細(xì)胞培養(yǎng)物中進(jìn)行評(píng)價(jià)，其結(jié) 果難以轉(zhuǎn)化為未來的人類應(yīng)用。
[0005] 因此，存在對(duì)于開發(fā)用于線粒體毒性的檢測(cè)（其是敏感的、可重復(fù)的、可靠的和容 易的，并且其可以用于藥物開發(fā)的檢測(cè)）的需要。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明涉及涉及含有線粒體的人血液成分的方法。開發(fā)的方法的優(yōu)點(diǎn)是體外測(cè)量 活的人線粒體中的藥物毒性（或有益的影響），但是在盡可能接近體內(nèi)的環(huán)境中。研宄了血 漿（這提供與體內(nèi)環(huán)境非常接近的關(guān)聯(lián)）中含線粒體的的人血液成分（白血細(xì)胞和/或血 小板）。因此，所有的緩沖能力、血清白蛋白、電解質(zhì)、水解酶等在測(cè)量期間存在。
[0007] 該新穎的方法將直接導(dǎo)致人體中真實(shí)的毒性血液濃度的評(píng)估，這在作為當(dāng)前使用 方法的細(xì)胞培養(yǎng)和動(dòng)物研宄中是不可能的。因此，在相比現(xiàn)在顯著更早的階段檢測(cè)和篩選 候選藥物物質(zhì)的人類毒性是可能的。反過來，這將允許在更早的階段排除有毒的候選藥物， 從而避免許多動(dòng)物試驗(yàn)以及將來人的痛苦。這將促進(jìn)在早期階段選擇候選藥物物質(zhì)，從而 降低藥物開發(fā)的總的時(shí)間和成本。
[0008] 取決于試驗(yàn)的目的，該方法可用于具有不同的設(shè)定的不同環(huán)境。
[0009] 因此，根據(jù)本發(fā)明的方法可用于以下各項(xiàng)，而不將范圍限制于此：
[0010] 1.篩選并選擇來自健康個(gè)體血液或所謂的血沉棕黃層（buffycoat)(其是血小 板和白血細(xì)胞的濃縮溶液）的細(xì)胞中的早期或晚期階段的候選藥物。
[0011] 2.檢測(cè)患者對(duì)于已知的線粒體毒物（mitochondrialtoxicant)的敏感性。
[0012] 3.在臨床試驗(yàn)中分析線粒體藥物毒性。
[0013] 4.分析預(yù)期改善線粒體功能的藥物的有益作用。
[0014] -種合適的用于篩選和選擇候選藥物或檢測(cè)人對(duì)作用于線粒體的物質(zhì)的敏感性 (即，上面的項(xiàng)目1和2)的方法是包括以下（步驟）：
[0015] i)使分離自人血液樣品的含有活線粒體（livemitochondria)的細(xì)胞樣品進(jìn)行 高分辨率呼吸測(cè)量（high-resolutionrespirometry)
[0016] ii)使細(xì)胞樣品與提高線粒體內(nèi)膜對(duì)質(zhì)子的滲透性的物質(zhì)接觸，
[0017] iii)加入包含介質(zhì)（載體、媒介物，vehicle)中的檢測(cè)物質(zhì)的檢測(cè)樣品，
[0018] iv)比較加入檢測(cè)樣品之前和之后的耗氧量（氧消耗）并且比較檢測(cè)樣品耗氧量 與介質(zhì)的對(duì)照樣品的耗氧量，其中，耗氧量下降表明對(duì)線粒體的負(fù)面作用，
[0019] V)使來自iii)的樣品與線粒體復(fù)合物I-功能抑制齊I」，如魚藤酮接觸，以表明依賴 于復(fù)合物II-底物氧化的細(xì)胞呼吸，
[0020] 和
[0021] vi)使來自V)的樣品與線粒體復(fù)合物III-功能抑制劑，如抗霉素A接觸以測(cè)定任 何非線粒體耗氧活性，如所述樣品的自動(dòng)氧化（auto-oxidation)。
[0022] 用于篩選和選擇潛在的候選藥物或用于檢測(cè)人對(duì)具有線粒體作用的物質(zhì)的靈敏 性（即，上面的項(xiàng)目1和2)的替代方案，是研宄這類檢測(cè)物質(zhì)在復(fù)合物II篩選試驗(yàn)中的效 果。在圖11中示出了這種方法，并且包括：
[0023] i)使分離自人血液樣品的含有活線粒體的細(xì)胞樣品進(jìn)行高分辨率呼吸測(cè)量，
[0024] ii)使細(xì)胞樣品與抑制復(fù)合物I呼吸的物質(zhì)接觸，
[0025] iii)加入包含介質(zhì)中的檢測(cè)物質(zhì)的檢測(cè)樣品，
[0026] iv)加入使質(zhì)膜透化（permeabilize)的物質(zhì)，
[0027] V)將參比物質(zhì)加入至iv)中得到的樣品，以及
[0028] vi)加入抑制復(fù)合物III呼吸作用的物質(zhì)。
[0029] 比較檢測(cè)的結(jié)果與由該方法獲得的結(jié)果，其中，使用的檢測(cè)物質(zhì)與參比物質(zhì)是相 同的。在圖11中示出了典型的結(jié)果，這表明候選藥物能夠，在一定程度上滲入質(zhì)膜（即，實(shí) 現(xiàn)呼吸的增加）。加入洋地黃皂苷（digitonin)，這使得質(zhì)膜是可滲透的，并不導(dǎo)致呼吸的 進(jìn)一步增加，即沒有來自檢測(cè)物質(zhì)的進(jìn)一步的作用。當(dāng)加入?yún)⒈任镔|(zhì)（復(fù)合物II相關(guān)的底 物（complexII-Iinkedsubstrate)，如琥I自酸）時(shí)，這通常是一種內(nèi)源性底物，如琥J白酸 鹽，觀察到呼吸增加并且實(shí)現(xiàn)最大容量（capacity)。然后將復(fù)合物III如抗霉素A加入，以 測(cè)定任何非線粒體耗氧活性，如所述樣品的自動(dòng)氧化。
[0030] 與來自參比物質(zhì)（其是內(nèi)源性底物，如琥珀酸）的結(jié)果比較可以看出參比物質(zhì)并 不會(huì)滲透質(zhì)膜。只有當(dāng)例如使用洋地黃皂苷使膜透化時(shí)，呼吸才增加。進(jìn)一步加入內(nèi)源性 物質(zhì)并不改變呼吸，而加入復(fù)合物III抑制劑則阻斷了線粒體呼吸。
[0031] 用檢測(cè)物質(zhì)所觀察到的圖像明顯地不同于圖11中所示的圖像。方法提供了有關(guān) 檢測(cè)物質(zhì)是否能滲透質(zhì)膜并且以積極方式影響線粒體耗氧活性（即，增加復(fù)合物II線粒體 呼吸）的有價(jià)值的信息。因此，最理想的檢測(cè)物質(zhì)具有比a'高的水平（level)a，并且在這 種情況下，水平a是水平b'或接近水平b'。在本文實(shí)施例中給出了更詳細(xì)的描述。
[0032] 另一種方法是研宄檢測(cè)物質(zhì)對(duì)復(fù)合物I、復(fù)合物II和/或復(fù)合物IV呼吸的影響。 通過研宄復(fù)合物I、II和/或IV呼吸作用，可以獲得關(guān)于特定物質(zhì)對(duì)線粒體呼吸的影響的 更多細(xì)節(jié)并且從而評(píng)價(jià)對(duì)于線粒體功能的任何正面或負(fù)面影響。圖14示出了升高濃度的 二甲雙胍對(duì)復(fù)合物I、II和IV線粒體呼吸的影響。圖中示出了隨著二甲雙胍濃度的增加， 復(fù)合物I呼吸的特定的功能障礙，而復(fù)合物II和IV呼吸作用似乎不受影響。
[0033] 通過隨后加入ADP以及之后的額外的復(fù)合物I底物谷氨酸鹽（見圖3)以及之后 加入升高量的檢測(cè)物質(zhì)（例如，二甲雙胍）刺激復(fù)合物I的呼吸（OXPHOSa)。
[0034] 通過將復(fù)合物I抑制劑（例如，魚藤酮）加入至細(xì)胞樣品隨后加入增加量的檢測(cè) 物質(zhì)實(shí)現(xiàn)復(fù)合物II呼吸作用。
[0035] 通過將^^，^-四甲基-對(duì)苯二胺（11^)，0.51111)電子供體加入至復(fù)合物1￥實(shí) 現(xiàn)復(fù)合物IV呼吸作用。由于TMPD的高水平的自動(dòng)氧化，加入疊氮化鈉（IOmM)，復(fù)合物IV 抑制劑，將獲得的這兩種水平之間的差計(jì)算為特定的復(fù)合物IV活性。
[0036] 一種用于研宄候選藥物在臨床試驗(yàn)或在治療方案（即，以上項(xiàng)目3和4)中對(duì)線粒 體的作用的合適的方法是包括以下各項(xiàng)的方法：
[0037] i)使分離自人血液樣品的含有活線粒體的細(xì)胞樣品進(jìn)行高分辨率呼吸測(cè)量，其 中，細(xì)胞樣品來自進(jìn)行臨床研宄或進(jìn)行治療方案的個(gè)體，并且其中，在臨床研宄或治療方案 期間，檢測(cè)物質(zhì)已給予個(gè)體，
[0038] ii)使細(xì)胞樣品與提高線粒體內(nèi)膜對(duì)質(zhì)子的滲透性的物質(zhì)接觸，
[0039] iii)比較來自進(jìn)行臨床研宄或治療方案的個(gè)體的樣品的耗氧量與來自對(duì)照組的 對(duì)照樣品的耗氧量，其中，耗氧量的下降表明對(duì)線粒體的負(fù)面作用，
[0040] iv)使來自iii)的樣品與線粒體復(fù)合物I-功能抑制劑，如魚藤酮接觸，以表明依 賴于復(fù)合物II-底物氧化的細(xì)胞呼吸，
[0041] 和
[0042] V)使來自iv)的樣品與線粒體復(fù)合物III-功能抑制劑，如抗霉素A接觸以測(cè)定任 何非線粒體耗氧活性，如所述樣品的自動(dòng)氧化。
[0043] 如從上面所看到的，這些方法幾乎是相同的，僅變化了所檢測(cè)的樣品，即該樣品是 檢測(cè)物質(zhì)還是進(jìn)行臨床試驗(yàn)或治療方案的個(gè)體的細(xì)胞樣品。根據(jù)臨床試驗(yàn)或治療方案，進(jìn) 行臨床試驗(yàn)或治療方案的個(gè)體接受檢測(cè)或藥物物質(zhì)或潛在藥物物質(zhì)。這意味著，分離自該 個(gè)體的血液樣品的線粒體已暴露于所討論的藥物物質(zhì)或潛在的藥物物質(zhì)，并且因此，通過 本文描述的方法可以觀察這類物質(zhì)對(duì)線粒體呼吸的任何影響。
[0044] 線粒體呼吸后使用呼吸測(cè)量法（測(cè)量）。在本文的實(shí)例中描述了合適的設(shè)置，但是 如果需要的話，本領(lǐng)域技術(shù)人員將知道如何改變，或者調(diào)整設(shè)置，或者是否使用另一裝置。
[0045] 血液樣品可以是靜脈血液樣品。可以分離和使用血小板或白血細(xì)胞，或它們的組 合。
[0046] 增加線粒體內(nèi)膜對(duì)質(zhì)子的滲透性的物質(zhì)的合適的實(shí)例是羰基氰對(duì)_(三氟甲氧 基）苯腙（FCCP)、羰基氰間-氯苯腙（CCCP)、2, 4-二硝基苯酚（DNP)或另一質(zhì)子載體 (protonophore)〇
[0047] 在本文的實(shí)例和所附權(quán)利要求中給出了有關(guān)這些方法的進(jìn)一步的細(xì)節(jié)。
[0048] 下面給出了關(guān)于以上方法的細(xì)節(jié)。
[0049] 1.篩選并選擇來自健康個(gè)體的血液或所謂的血沉棕黃層（其是血小板和白血細(xì) 胞的濃縮溶液）的細(xì)胞中的早期或晚期階段的候選藥物
[0050] 這種方法包括：
[0051] i)使分離自人靜脈血液樣品的含有活線粒體的細(xì)胞樣品在37°C恒定溫度，在 400至25yMO2范圍的氧濃度下進(jìn)行高分辨率呼吸測(cè)量
[0052] ii)使細(xì)胞樣品與提高線粒體內(nèi)膜對(duì)質(zhì)子滲透性的物質(zhì)，如羰基氰對(duì)_(三氟甲氧 基）苯腙（FCCP)、羰基氰間-氯苯腙（CCCP)、2, 4-二硝基苯酚（DNP)或另一質(zhì)子載體接觸 以獲得存在于血小板中的線粒體的電子傳遞系統(tǒng)（electrontransportsystem)的最大容 量（capacity)〇
[0053] iii)加入包含介質(zhì)中的檢測(cè)物質(zhì)的檢測(cè)樣品；相比于介質(zhì)加入，通常以逐步增加 的劑量加入，
[0054] iv)比較加入檢測(cè)樣品之前和之后的耗氧量并且比較檢測(cè)和介質(zhì)之間的耗氧量， 其中，耗氧量下降表明對(duì)線粒體的負(fù)面作用，
[0055] V)使來自iii)的樣品與線粒體復(fù)合物I功能抑制齊I」，如魚藤酮接觸，以表明依賴 于復(fù)合物II-底物氧化的細(xì)胞呼吸，
[0056] 和
[0057] vi)使來自V)的樣品與線粒體復(fù)合物III-功能抑制劑，如抗霉素A接觸以測(cè)定任 何非線粒體耗氧活性，如所述樣品的自動(dòng)氧化，
[0058] 下降可能是顯著的或劑量依賴性的。
[0059] 如上面提到的，人血液樣品來自健康個(gè)體。通常，如本文實(shí)施例所描述的獲得樣 品。細(xì)胞通常是血小板或白血細(xì)胞或它們的組合。
[0060] 細(xì)胞可以在人血漿（在某些情況下，受試者自己的血漿）中懸浮，或者它們可以 在，含有例如蔗糖、ffiPES、K-乳糖酸鹽（K-Iactobionate)、氯化鎂、磷酸二氫鉀、EGTA和 BSA的含水緩沖液或其它合適的緩沖液中懸浮。pH通常調(diào)節(jié)至pH7. 0至7. 5之間，特別是 7. 1。通常，對(duì)于完整的血小板或白血細(xì)胞，溶解在血漿中是優(yōu)選的以盡可能模擬體內(nèi)環(huán)境。 然而，在某些情況下，或作為對(duì)血漿溶解液的補(bǔ)充，可以使用加入5mM葡萄糖的磷酸緩沖鹽 (可用于與血漿組比較），或更多細(xì)胞內(nèi)類型的含Kreb循環(huán)中間體的緩沖液用于透化血小 板或白血細(xì)胞。細(xì)胞內(nèi)類型可以用于透化血小板（和WBC)并且，其中，線粒體呼吸底物可 以過量存在（以可飽和的量）以便最大化電子傳遞并增加測(cè)定的分辨率。
[0061] 從人血液樣品獲得的細(xì)胞可以完整地或透化地進(jìn)行檢測(cè)。
[0062] 取決于使用完整的還是透化的血小板或白血細(xì)胞（SMT方案-底物-解偶聯(lián) 劑-抑制劑滴定（SUITprotocol-Substrate-Uncoupler-InhibitorTitration))，使用不 同的試驗(yàn)方案。通常使用完整血小板或白血細(xì)胞。在一個(gè)試驗(yàn)中，使用透化的血小板或白 血細(xì)胞以盡可能多地收集不同的呼吸復(fù)合物的容量信息。血小板的透化是通過將細(xì)胞施加 至使細(xì)胞的質(zhì)膜對(duì)底物和ADP可滲透的洋地黃皂苷或其它物質(zhì)而進(jìn)行的。其它物質(zhì)可以是 皂苷或Trit〇n-x(曲拉通-x)。如從本文的實(shí)例可看出的，發(fā)現(xiàn)洋地黃皂苷的最佳劑量是 Iyg/lxl〇6血小板。
[0063] 通常將細(xì)胞以200xIOfVml至400xIOfVml的濃度懸浮于裝置的玻璃室（glass chamber)中。
[0064] 檢測(cè)樣品可以以升高的濃度加入數(shù)次以識(shí)別對(duì)線粒體產(chǎn)生不利作用（即毒性作 用）的最小濃度。檢測(cè)物質(zhì)的初始和最終濃度取決于該物質(zhì)的效力，但一般會(huì)在亞微摩爾 至毫摩爾的范圍內(nèi)。
[0065] 因此，該方法可以用于確定哪些劑量水平是安全的以及哪些是不安全從而應(yīng)該避 免的。
[0066] 該方法也可以用于彼此比較兩種或更多種藥物物質(zhì)或候選藥物物質(zhì)以識(shí)別具有 最安全曲線（最安全譜）的物質(zhì)。因此，用研宄中的（一種或多種）其它物質(zhì)重復(fù)該方法 并且比較獲得的結(jié)果。相比正常水平具有最小的呼吸作用下降的物質(zhì)是有關(guān)線粒體毒性作 用的最安全的物質(zhì)。
[0067] 圖7-9示出了這種比較的結(jié)果。圖7示出了從使用抗糖尿病藥的兩個(gè)試驗(yàn)中獲得 的結(jié)果；一個(gè)試驗(yàn)涉及用藥物物質(zhì)曲格列酮滴定，以及另一試驗(yàn)使用羅格列酮。圖7清楚地 表明，有關(guān)線粒體毒性，羅格列酮是比曲格列酮更安全的藥物物質(zhì)。曲格列酮由于毒性作用 已經(jīng)不再存在于市場(chǎng)上。
[0068] 圖8示出了從使用米諾環(huán)素和多西環(huán)素的兩個(gè)試驗(yàn)獲得的結(jié)果，結(jié)果表明多西環(huán) 素比米諾環(huán)素更安全。
[0069] 圖9示出了從使用西立伐他汀和辛伐他?。╯imvastatin)的兩個(gè)試驗(yàn)獲得的結(jié) 果，結(jié)果表明辛伐他汀比西立伐他汀更安全。事實(shí)上，西立伐他汀已經(jīng)撤出市場(chǎng)，而辛伐他 汀仍然存在于市場(chǎng)上。
[0070] 加入羰基氰對(duì)_(三氟甲氧基）苯腙（FCCP)，或增加線粒體內(nèi)膜對(duì)質(zhì)子的滲透性 的另一物質(zhì)以獲得存在于血小板中的線粒體的電子傳遞系統(tǒng)的最大容量。