一種FXa活性檢測(cè)試劑及其制備方法和應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了一種肝素含量的檢測(cè)方法，是通過(guò)發(fā)色底物法，將待測(cè)樣品與FXa活性檢測(cè)試劑混合并孵育后，檢測(cè)發(fā)色底物的信號(hào)強(qiáng)度；最后通過(guò)計(jì)算信號(hào)強(qiáng)度并和標(biāo)準(zhǔn)曲線比對(duì)獲得待測(cè)樣品中肝素含量，其中發(fā)色底物為活化因子X(jué)(FXa)的發(fā)色底物，選自以下底物中的任一一種：Benzoyl-Ile-Glu-Gly-Arg-p-nitroanilide?HCl；CH3O-CO-D-CHA-Gly-Arg-p-nitroanilide?AcOH；Acetyl-D-Arg-Gly-Arg-p-nitroanilide?2HCl；4-Nz-D-Arg-Gly-Arg-p-nitroanilide?2HCl。本發(fā)明的檢測(cè)范圍包括普通未分級(jí)肝素、低分子量肝素和磺達(dá)肝素，且本發(fā)明檢測(cè)穩(wěn)定性和重復(fù)性好，能準(zhǔn)確反應(yīng)肝素含量，具有很高的靈敏度和準(zhǔn)確度，可以較快找到肝素的最佳劑量范圍，患者無(wú)需進(jìn)行多次檢測(cè)。此外，本發(fā)明還可用在自動(dòng)化儀器如血凝分析儀或生化分析儀上，實(shí)現(xiàn)自動(dòng)化有助于臨床推廣應(yīng)用，具有操作簡(jiǎn)便，靈敏度高，重復(fù)性好的特點(diǎn)。
【專利說(shuō)明】-種FXa活性檢測(cè)試劑及其制備方法和應(yīng)用

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于生物學(xué)檢測(cè)【技術(shù)領(lǐng)域】，涉及一種FXa活性檢測(cè)試劑及其制備方法和應(yīng) 用。

【背景技術(shù)】
[0002] 肝素（heparin)是一種糖胺聚糖，是被廣泛應(yīng)用的抗凝血藥物。肝素是由D-葡 糖胺、L-艾杜糖醛酸、N-乙酰葡糖胺及葡糖醛酸交替組成的粘多糖硫酸酯，分子量從5至 30KDa，其中硫酸根約占40%。肝素的抗凝血功能主要是通過(guò)它與抗凝血酶的結(jié)合來(lái)實(shí)現(xiàn)的。 抗凝血酶III (AT-ΠΙ)的精氨酸酶活性部位可以與含絲氨酸的凝血酶和凝血因子X(jué)lla、 XIa、Xa、IXa的絲氨酸酶活性部位結(jié)合，形成無(wú)凝血活性的抗凝血酶III-凝血因子復(fù)合物， 而達(dá)到抗凝血作用。肝素帶有大量負(fù)電荷，能與抗凝血酶III上帶正電荷的賴氨酸結(jié)合，肝 素中獨(dú)特的戊聚糖序列，就是肝素與抗凝血酶III的結(jié)合位點(diǎn)。肝素與抗凝血酶III結(jié)合， 使抗凝血酶III發(fā)生分子構(gòu)象變化，暴露精氨酸活性部位，增加與凝血因子中絲氨酸接觸 的概率，使反應(yīng)速率增加約1000倍，從而增強(qiáng)抗凝血酶ΠΙ的抗凝血活性。
[0003] 肝素作為臨床醫(yī)學(xué)中一種最常用的抗凝治療劑，使用肝素時(shí)要精確把握肝素用 量，以避免出現(xiàn)用量過(guò)少達(dá)不到抗凝效果，用量過(guò)多又會(huì)引起自發(fā)性出血的狀況，保持機(jī)體 出凝血功能有效平衡。但是，由于肝素是一種高度帶負(fù)電荷的異質(zhì)性混合物，容易與血液中 帶正電荷的蛋白非特異性結(jié)合，導(dǎo)致難以計(jì)算與抗凝血酶III特異性結(jié)合的肝素含量。因 此，在臨床應(yīng)用中，必須通過(guò)實(shí)驗(yàn)檢測(cè)肝素抗凝的實(shí)際效果從而得出肝素的最佳劑量。
[0004] 常見(jiàn)的應(yīng)用于臨床的肝素有普通未分級(jí)肝素 （Unfractionated heparin, UFH), 低分子量肝素（low-molecular-weight heparin, LMWH)和橫達(dá)肝素（fondaparinux)。普 通未分級(jí)肝素的平均分子量是15000。低分子量肝素的平均分子量是4000到6500。而磺 達(dá)肝素是化學(xué)合成的戊聚糖化合物，它的分子量為1728,基本上由與抗凝血酶結(jié)合的戊聚 糖序列組成。普通未分級(jí)肝素既可抑制抗凝血酶也可抑制活化因子X(jué)，低分子量肝素則主要 抑制活化因子X(jué)?；沁_(dá)肝素只能抑制活化因子X(jué)，而不能抑制抗凝血酶。
[0005] 普通未分級(jí)肝素價(jià)格相對(duì)低廉，是最早應(yīng)用到臨床的肝素。它是一種帶大量負(fù)電 荷的異質(zhì)性的混合物。在血液里，它和帶正電荷的蛋白非特異性結(jié)合，因此有多少肝素和抗 凝血酶特異性結(jié)合很難計(jì)算。這樣，普通未分級(jí)肝素的用量難以預(yù)測(cè)，用量過(guò)少達(dá)不到抗凝 效果，用量過(guò)多又會(huì)導(dǎo)致出血。所以在臨床應(yīng)用中，必須通過(guò)實(shí)驗(yàn)室的嚴(yán)格監(jiān)測(cè)來(lái)測(cè)量肝素 抗凝的實(shí)際效果來(lái)找到并維持最佳劑量。
[0006] 低分子量肝素比普通未分級(jí)肝素的糖鏈要短很多。這樣就減少了許多與血液中蛋 白的非特異結(jié)合。因此，它在血液中的半衰期比普通未分級(jí)肝素要長(zhǎng)，抗凝血效果也更容易 預(yù)測(cè)，由于和血小板作用引起的副作用也降低。磺達(dá)肝素雖然價(jià)格相對(duì)昂貴，但它基本上由 與抗凝血酶結(jié)合的戊聚糖序列組成，所以它的特異性更強(qiáng)，在血液中的半衰期也更長(zhǎng)。
[0007] 然而，低分子量肝素和磺達(dá)肝素在臨床應(yīng)用中，由于病人的體質(zhì)，性別，年齡，體 重，用藥等的不同，也會(huì)出現(xiàn)藥量不足或過(guò)量的情況。因此，為了避免引起出血和對(duì)病人實(shí) 施個(gè)體化治療，實(shí)驗(yàn)室的監(jiān)測(cè)必不可少。
[0008] 現(xiàn)有技術(shù)中關(guān)于測(cè)定肝素含量的方法有多種。其中，臨床中常用活化部分凝血活 酶時(shí)間（activated partial thromboplastin time, APTT)常用來(lái)間接反映肝素治療是 否恰當(dāng)，其基本操作是在血漿中加入鈣離子，腦磷脂和其他激活物質(zhì)如白陶土，這些物質(zhì)激 活內(nèi)源性凝血級(jí)聯(lián)系統(tǒng)，促進(jìn)血漿凝固，而活化部分凝血活酶時(shí)間（APTT)就是血漿凝固 所需的時(shí)間。肝素的用量可以根據(jù)APTT時(shí)間的長(zhǎng)短來(lái)進(jìn)行調(diào)整，從而找到最佳劑量范圍。 APTT是一種凝固法。作為檢測(cè)肝素的方法之一，它操作簡(jiǎn)單、快速、便宜。然而，通過(guò)活化部 分凝血活酶時(shí)間（APTT)推測(cè)肝素最佳劑量范圍的方法，在臨床實(shí)踐中經(jīng)常被質(zhì)疑，尤其是 對(duì)低分子量肝素和磺達(dá)肝素的應(yīng)用。主要是因?yàn)槔眠@種方法得出的肝素最佳劑量也常常 出現(xiàn)血栓和出血現(xiàn)象，而且應(yīng)用此法時(shí)，患者需要多次檢測(cè)、調(diào)整肝素劑量。因此，活化部分 凝血活酶時(shí)間（APTT)并不是一個(gè)能被用來(lái)準(zhǔn)確推測(cè)的肝素最佳劑量范圍的指標(biāo)。并且，活 化部分凝血活酶時(shí)間（APTT)只能用于普通肝素檢測(cè)，不能用于低分子肝素和磺達(dá)肝素檢 測(cè)。
[0009] 相對(duì)于凝固法，發(fā)色底物法具有靈敏度高，操作簡(jiǎn)便的特點(diǎn)。Demers等人 (Thrombosis and Hemostasia，69 (3)，ρρ· 231-235 (1993))報(bào)道了一種測(cè)定抗凝血酶活性 的方法。他們發(fā)現(xiàn)在測(cè)定過(guò)程中，如果采用FXa替代凝血酶，那么得到的抗凝血酶活性的結(jié) 果會(huì)更加準(zhǔn)確。他們這項(xiàng)研究的目的是測(cè)定抗凝血酶活性，而不是肝素。可值得注意的是， 該文獻(xiàn)中所用測(cè)定方法所使用的就是發(fā)色底物法。這說(shuō)明發(fā)色底物法是可以被成功地應(yīng)用 在血液檢測(cè)領(lǐng)域的。美國(guó)藥典第32版（United States Pharmacopeia 32，USP32)對(duì)肝素 活性測(cè)定采用發(fā)色底物法，這個(gè)方法的基本原理就是上面提到的肝素-抗凝血酶III復(fù)合 物能夠抑制活化的FXa，從而抑制其水解發(fā)色底物的顯色反應(yīng)。但此法需采用對(duì)數(shù)方程擬合 標(biāo)準(zhǔn)曲線，而進(jìn)行對(duì)數(shù)方程的計(jì)算導(dǎo)致檢測(cè)結(jié)果與實(shí)際偏差較大。
[0010] 此外，中國(guó)專利CN 103063592 A公開(kāi)了一種肝素活性的測(cè)定方法，包括樣品先 后與抗凝血酶、活化的牛凝血因子X(jué)、發(fā)色底物、乙酸混合后測(cè)其吸光度來(lái)計(jì)算肝素活性含 量，但其相對(duì)來(lái)說(shuō)更適應(yīng)于較低肝素活性樣品的檢測(cè)。中國(guó)專利CN 103063593 A公開(kāi)了一 種人抗凝血酶III濃縮物中肝素含量的測(cè)定方法，雖然測(cè)定了和抗凝血酶III結(jié)合的肝素 的含量，但其采用的是手動(dòng)加樣的微孔板方法，無(wú)法用在自動(dòng)檢測(cè)儀器上。
[0011] 綜上述，現(xiàn)有產(chǎn)品中并無(wú)檢測(cè)方法簡(jiǎn)便、檢測(cè)結(jié)果精確可靠且可適用于自動(dòng)檢測(cè) 儀器上的肝素含量檢測(cè)。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0012] 針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)存在的上述問(wèn)題，本發(fā)明的目的之一是提供一種相較于檢測(cè)AT-III 活性更為靈敏且應(yīng)用范圍更廣的用于檢測(cè)活化因子X(jué) (以下簡(jiǎn)稱FXa)活性的試劑，尤其是 用于檢測(cè)血液中肝素含量的FXa活性檢測(cè)試劑。為實(shí)現(xiàn)上述發(fā)明目的，本發(fā)明提供的技術(shù) 方案如下： 一種FXa活性檢測(cè)試劑，包括試劑1和試劑2,其中試劑1為活化因子X(jué) (FXa)的發(fā)色 底物，試劑2為活化因子X(jué) (FXa);其中活化因子X(jué) (FXa)的發(fā)色底物選自以下底物中的任 種： Benzoyl-Ile-Glu-Gly-Arg-p-nitroanilide · HC1 ;CH3〇-C〇-D-CHA_Gly-Arg-p-nitroa nilide · AcOH ;Acetyl-D_Arg-Gly-Arg-p-nitroanilide · 2HC1 ; 4-Nz-D-Arg-Gly-Arg-p-nitroanilide *2HC1〇
[0013] 優(yōu)選地，上述試劑1或試劑2為相應(yīng)的溶液或凍干劑，優(yōu)選為凍干粉劑。
[0014] 優(yōu)選地，上述發(fā)色底物的工作濃度為0. 05~2mM，優(yōu)選工作濃度為0. 最佳工 作濃度為〇. 5mM ; 上述FXa的工作濃度為0. 05?2 μ M，優(yōu)選工作濃度為0. f 1 μ M，最佳工作濃度為 0. 5 μ Μ(工作濃度的定義：在用上述任一試劑檢測(cè)樣本活性的過(guò)程中，該試劑的凍干劑采 用其復(fù)溶試劑復(fù)溶后，與稀釋樣本混合，所形成的分析混合物中各組分的濃度被定義為其 工作濃度）。
[0015] 優(yōu)選地，試劑1由包含發(fā)色底物、緩沖劑、無(wú)機(jī)鹽、表面活性劑和防腐劑的混合試 齊?制成。
[0016] 優(yōu)選地，試劑2由包含F(xiàn)Xa、緩沖劑、無(wú)機(jī)鹽、表面活性劑和防腐劑的混合試劑制 成。
[0017] 更優(yōu)選地，緩沖劑選自三羥甲基氨基甲烷緩沖液（以下簡(jiǎn)稱Tris緩沖液)或硼酸緩 沖液，最佳為三羥甲基氨基甲烷緩沖液（Tris緩沖液)。
[0018] 更優(yōu)選地，無(wú)機(jī)鹽選自氯化鈉或氯化鉀，最佳為氯化鈉。
[0019] 更優(yōu)選地，表面活性劑選自聚乙二醇-8000或吐溫-20,最佳為聚乙二醇-8000。
[0020] 更優(yōu)選地，防腐劑可選擇本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的防腐劑，如Proclin 300或疊氮 納，最佳為置氣納。
[0021] 優(yōu)選地，F(xiàn)Xa選自為人、牛、豬FXa中的任意一種，優(yōu)選牛FXa。
[0022] 作為優(yōu)選，上述試劑還包括含有肝素的人血漿標(biāo)準(zhǔn)品；人血漿標(biāo)準(zhǔn)品為含有準(zhǔn)確 肝素含量的人血漿。該標(biāo)準(zhǔn)品由正常健康人血漿添加穩(wěn)定劑和防腐劑，經(jīng)冷凍干燥制成。 正常健康人血漿可以從商業(yè)途徑獲得，也可以從健康個(gè)體獲得，將收集的正常健康人血漿 混合后進(jìn)行肝素活性檢測(cè)。血漿中加入適當(dāng)?shù)母拾彼?、疊氮鈉，混合后通過(guò)過(guò)濾除去不溶顆 粒，調(diào)節(jié)pH值至6. (T9. 0,優(yōu)選7. 5,分裝后凍干，并用WHO肝素國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)品血漿對(duì)肝素標(biāo)準(zhǔn) 品進(jìn)行定值。此外，也可省略此標(biāo)準(zhǔn)品而提供標(biāo)準(zhǔn)曲線。
[0023] 本發(fā)明的另一目的是提供上述的FXa活性檢測(cè)試劑的制備方法，包括分別制備試 齊U 1和試劑2 ;其中： 制備試劑1的方法為：將發(fā)色底物溶于緩沖劑中；再加入鹽酸，調(diào)節(jié)pH值至7~8 ;再依 次加入無(wú)機(jī)鹽和表面活性劑，室溫下攪拌10分鐘。
[0024] 其中，試劑1中各組分的終濃度或百分含量分別為：發(fā)色底物0. 緩沖劑 10?50禮，無(wú)機(jī)鹽0. 1?0. 3M，表面活性劑0. 5?1%。
[0025] 優(yōu)選地，還包括將試劑1的溶液制成凍干劑的步驟，可參考現(xiàn)有技術(shù)中的凍干粉 劑的制備工藝，以獲得穩(wěn)定性更高的試劑1。
[0026] 制備試劑2的步驟為：將FXa溶于緩沖劑；再加入鹽酸，調(diào)節(jié)pH值至疒8 ;再依次 加入無(wú)機(jī)鹽和表面活性劑，室溫下攪拌10分鐘。
[0027] 其中，試劑2中各組分的終濃度或百分含量分別為：FXa 0. 1~1μΜ，緩沖劑 l(T50mM，無(wú)機(jī)鹽0. 1?0. 3Μ，表面活性劑0. 5?1%。
[0028] 優(yōu)選地，還包括將試劑2的溶液制成凍干劑的步驟，可參考現(xiàn)有技術(shù)中的凍干粉 劑的制備工藝，以獲得穩(wěn)定性更高的試劑2。
[0029] 此外，上述試劑1和試劑2中還分別加入0. 2%的防腐劑，可參考現(xiàn)有技術(shù)中的方 法加入，在此不做贅述。
[0030] 本發(fā)明的另一目的是提供上述FXa活性檢測(cè)試劑的應(yīng)用，即將上述試劑作為檢測(cè) 試劑用于制備檢測(cè)肝素含量的檢測(cè)試劑。
[0031] 作為一種優(yōu)選方案，該檢測(cè)試劑可制備相應(yīng)的檢測(cè)試劑盒，包括盒體和裝有上述 試劑的試劑瓶，試劑瓶放置于所述盒體內(nèi)。
[0032] 作為一種優(yōu)選方案，上述檢測(cè)試劑盒分別包含試劑1或試劑2。該試劑盒檢測(cè)待測(cè) 樣品中肝素含量時(shí)，將待測(cè)樣品與試劑1混合并孵育后，再加入試劑2混合并孵育后，然后 讀取待測(cè)樣品中發(fā)色底物的信號(hào)強(qiáng)度；最后通過(guò)計(jì)算信號(hào)強(qiáng)度并和已知濃度標(biāo)準(zhǔn)品的標(biāo)準(zhǔn) 曲線比對(duì)得到血液中肝素含量。
[0033] 本發(fā)明的另一目的是提供另一種FXa活性檢測(cè)試劑，除上述試劑1和試劑2外，還 包括試劑3;同上述，試劑1為活化因子X(jué) (FXa)的發(fā)色底物，試劑2為活化因子X(jué) (FXa); 試劑3為抗凝血酶；其中活化因子X(jué) (FXa)的發(fā)色底物選自以下底物中的任一一種： Benzoyl-Ile-Glu-Gly-Arg-p-nitroanilide · HC1 ;CH3〇-C〇-D-CHA-Gly-Arg-p_nitroa nilide · AcOH ;Acetyl-D_Arg-Gly-Arg-p-nitroanilide · 2HC1 ; 4-Nz-D-Arg-Gly-Arg-p-nitroanilide *2HC1〇
[0034] 優(yōu)選地，試劑3為溶液或凍干劑，優(yōu)選為凍干粉劑。
[0035] 優(yōu)選地，上述抗凝血酶的工作濃度為0. f lU/mL，優(yōu)選工作濃度為0. 2?0. 5U/mL， 最佳工作濃度為〇. 5U/mL。
[0036] 優(yōu)選地，試劑3由包含抗凝血酶、緩沖劑、無(wú)機(jī)鹽、表面活性劑和防腐劑的混合試 齊?制成。
[0037] 更優(yōu)選地，抗凝血酶為人抗凝血酶。
[0038] 更優(yōu)選地，上述緩沖劑、氯化鈉、表面活性劑和防腐劑同試劑1或試劑2。
[0039] 本發(fā)明的另一目的是提供上述FXa活性檢測(cè)試劑的制備方法，包括分別制備試劑 1、試劑2和試劑3,其中試劑1和2的制備方法同上述，此外， 制備試劑3的步驟為：將抗凝血酶溶于濃度為l(T50mM的緩沖劑；再加入鹽酸，調(diào)節(jié)pH 值至疒8 ;再依次加入無(wú)機(jī)鹽和表面活性劑，室溫下攪拌10分鐘。
[0040] 其中，試劑3中各組分的終濃度或百分含量分別為：抗凝血酶0.2~0.5U/mL，緩沖 劑l(T50mM，氯化鈉0. 1?0. 3M，表面活性劑0. 5?1%。
[0041] 優(yōu)選地，還包括將試劑3的溶液制成凍干劑的步驟，可參考現(xiàn)有技術(shù)中的凍干粉 的制備工藝，以獲得穩(wěn)定性更高的試劑3。
[0042] 本發(fā)明的另一目的是提供上述FXa活性檢測(cè)試劑的應(yīng)用，即將上述試劑作為檢測(cè) 試劑用于制備肝素檢測(cè)試劑。值得一提的是，針對(duì)不同人群中抗凝血酶的表達(dá)量是不同的， 在極少部分低表達(dá)人群中，如新生兒等；如果不加入外源性抗凝血酶來(lái)測(cè)定肝素含量，那么 測(cè)定結(jié)果會(huì)有一些誤差。本發(fā)明針對(duì)此，提供了上述兩種不同的FXa活性檢測(cè)試劑在需糾 正這些誤差時(shí)的應(yīng)用，即采用不同的試劑分別檢測(cè)是否需要考慮被檢者體內(nèi)的內(nèi)源抗凝血 酶表達(dá)水平的肝素含量。
[0043] 作為一種優(yōu)選方案，該檢測(cè)試劑可制備相應(yīng)的檢測(cè)試劑盒，所述試劑盒包括盒體 和裝有上述試劑的試劑瓶，試劑瓶放置于所述盒體內(nèi)。
[0044] 作為一種優(yōu)選方案，上述檢測(cè)試劑盒分別包含試劑1、試劑2試劑3。該試劑盒檢 測(cè)待測(cè)樣品中肝素含量時(shí)，將待測(cè)樣品與試劑3混合并孵育后，再與試劑1混合并孵育后， 再加入試劑2混合并孵育后，然后讀取發(fā)色底物的信號(hào)強(qiáng)度；最后通過(guò)計(jì)算信號(hào)強(qiáng)度并和 已知濃度標(biāo)準(zhǔn)品的標(biāo)準(zhǔn)曲線比對(duì)得到血液中肝素含量。
[0045] 本發(fā)明的另一目的是提供一種肝素含量的檢測(cè)方法，具體是通過(guò)發(fā)色底物法，將 待測(cè)樣品與上述FXa活性檢測(cè)試劑混合并孵育后，檢測(cè)發(fā)色底物的信號(hào)強(qiáng)度；最后通過(guò)計(jì) 算信號(hào)強(qiáng)度并和標(biāo)準(zhǔn)曲線比對(duì)獲得待測(cè)樣品中肝素含量。
[0046] 其中，當(dāng)無(wú)需考慮被檢者內(nèi)源抗凝血酶表達(dá)水平時(shí)，上述FXa活性檢測(cè)試劑包括 試劑1和試劑2。
[0047] 其中，當(dāng)需要考慮被檢者內(nèi)源抗凝血酶表達(dá)水平時(shí)，上述FXa活性檢測(cè)試劑包括 試劑1、2和試劑3。
[0048] 上述檢測(cè)方法，具體包括以下步驟： 步驟a，標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作：根據(jù)不同肝素濃度的標(biāo)準(zhǔn)品及其相應(yīng)的信號(hào)強(qiáng)度繪制標(biāo)準(zhǔn) 曲線； 步驟b，待測(cè)樣品處理：獲得待測(cè)樣品的血漿，與上述FXa活性檢測(cè)試劑混合并孵育； 步驟c，檢測(cè)待測(cè)樣品中發(fā)色底物的信號(hào)強(qiáng)度； 步驟d，通過(guò)計(jì)算待測(cè)樣品中信號(hào)強(qiáng)度并和標(biāo)準(zhǔn)曲線比對(duì)獲得待測(cè)樣品中肝素含量。
[0049] 優(yōu)選地，當(dāng)無(wú)需考慮被檢者內(nèi)源抗凝血酶表達(dá)水平時(shí)，步驟b中待測(cè)樣品的處理 順序?yàn)椋簩⒋郎y(cè)樣品與試劑1混合并孵育后，再加入試劑2混合并孵育。
[0050] 優(yōu)選地，當(dāng)需要考慮被檢者內(nèi)源抗凝血酶表達(dá)水平時(shí)，步驟b中待測(cè)樣品的處理 順序?yàn)椋簩⒋郎y(cè)樣品與試劑3混合并孵育后，再與試劑1混合并孵育后，再加入試劑2混合 并孵育。
[0051] 更優(yōu)選地，步驟b中待測(cè)樣品處理的溫度為37° C，孵育溫度也為37° C。
[0052] 更優(yōu)選地，步驟a是采用緩沖劑將已知濃度的含有肝素的人血漿標(biāo)準(zhǔn)品稀釋至 0. 1~1. 0 IU/mL的四種或以上的已知濃度，作為標(biāo)準(zhǔn)溶液；再根據(jù)人血漿標(biāo)準(zhǔn)品中不同肝素 濃度與測(cè)得的相應(yīng)吸光值繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。
[0053] 更優(yōu)選地，步驟b中待測(cè)樣品的血漿是將新鮮抽取的靜脈血按9 :1的比例與枸櫞 酸抗凝液混勻后離心，分離即得待測(cè)樣品血漿。
[0054] 更優(yōu)選地，步驟b中待測(cè)樣品血漿與試劑1的體積比為1 :1，在37°C下混合并孵 育2分鐘。
[0055] 更優(yōu)選地，步驟b中待測(cè)樣品血漿與試劑2的體積比為1 :1，在37°C下混合并孵 育2分鐘。
[0056] 更優(yōu)選地，步驟b中待測(cè)樣品血漿與試劑3的體積比為1 :1，在37°C下混合并孵 育2分鐘。
[0057] 優(yōu)選地，上述信號(hào)為405nm下的吸光度。
[0058] 更優(yōu)選地，步驟c中吸光度的檢測(cè)時(shí)間不少于5分鐘。
[0059] 優(yōu)選地，肝素包括但不限于普通未分級(jí)肝素、低分子量肝素和磺達(dá)肝素。
[0060] 上述肝素含量的檢測(cè)方法應(yīng)用于自動(dòng)檢測(cè)儀上(如血凝分析儀或生化分析儀）進(jìn) 行檢測(cè)的具體條件為： 在自動(dòng)監(jiān)測(cè)儀上設(shè)定參數(shù)：反應(yīng)溫度：37°C ;檢測(cè)波長(zhǎng)：405nm ;檢測(cè)方法：終點(diǎn)法或動(dòng) 態(tài)法。
[0061] 應(yīng)當(dāng)注意的是，在使用不同的自動(dòng)檢測(cè)儀(血凝分析儀或生化分析儀）時(shí)，具體參 數(shù)應(yīng)根據(jù)儀器不同進(jìn)行相應(yīng)調(diào)整。
[0062] 為了使發(fā)色底物法在肝素檢測(cè)方面得到廣泛應(yīng)用，本發(fā)明提供一種與上述肝素檢 測(cè)方法匹配的檢測(cè)試劑。發(fā)色底物法的測(cè)量原理是利用肝素抑制活化因子X(jué)(FXa)的活性 從而抑制凝血，通過(guò)測(cè)量含肝素血漿對(duì)活化因子X(jué)(FXa)的抑制程度來(lái)推測(cè)肝素的最佳劑 量范圍。該肝素測(cè)量方法比活化部分凝血活酶時(shí)間（APTT)優(yōu)越。首先，本發(fā)明的檢測(cè)范圍包 括但不限于普通未分級(jí)肝素、低分子量肝素和磺達(dá)肝素，而活化部分凝血活酶時(shí)間（APTT) 只能用于檢測(cè)普通未分級(jí)肝素。同時(shí)，血漿中高濃度因子、凝血酶原、收集管中血漿量不足 以及血漿中很多凝血因子缺乏等因素都會(huì)對(duì)活化部分凝血活酶時(shí)間（APTT)的檢測(cè)結(jié)果產(chǎn) 生影響，而本發(fā)明測(cè)量結(jié)果則不受以上述因素的影響，檢測(cè)穩(wěn)定性和重復(fù)性好，能準(zhǔn)確反應(yīng) 肝素含量，具有很高的靈敏度和準(zhǔn)確度，可以較快找到肝素的最佳劑量范圍，患者無(wú)需進(jìn)行 多次檢測(cè)。此外，本發(fā)明還可用在自動(dòng)化儀器如血凝分析儀或生化分析儀上，實(shí)現(xiàn)自動(dòng)化有 助于臨床推廣應(yīng)用，具有操作簡(jiǎn)便，靈敏度高，重復(fù)性好的特點(diǎn)。因此，本發(fā)明應(yīng)用前景廣 闊。

【專利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0063] 圖1為實(shí)施例1所用肝素的標(biāo)準(zhǔn)曲線。
[0064] 圖2為實(shí)施例2所用肝素的標(biāo)準(zhǔn)曲線。
[0065] 圖3為實(shí)施例3所用肝素的標(biāo)準(zhǔn)曲線。

【具體實(shí)施方式】
[0066] 下面結(jié)合實(shí)施例及對(duì)比例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)、完整地說(shuō)明。以下所用試劑或 設(shè)備均為市售品種，如無(wú)特殊說(shuō)明，均按照說(shuō)明書操作，在此不做贅述。
[0067] 以下為結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步的說(shuō)明，但不應(yīng)視為對(duì)本發(fā)明的限定。
[0068] 1、實(shí)驗(yàn)材料和試劑 Tris (是Tris (Hydroxymethyl) aminomethane的常用縮寫；中文品名：三輕甲基氨基 甲烷），鹽酸，氯化鈉和聚乙二醇-8000購(gòu)自西格馬（Sigma，活化因子X(jué)(FXa)和活化因子 X(FXa)的發(fā)色底物： Benzoyl-Ile-Glu-Gly-Arg-p-nitroanilide. HC1 (S-2222)； CH3〇-C〇-D-CHA-Gly-Arg-p-nitroanilide. AcOH ； Acetyl-D-Arg-Gly-Arg-p-nitroanilide. 2HC1 (S-2772)； 4-Nz-D-Arg-Gly-Arg-p-nitroanilide *2HC1 (S-2782)，購(gòu)自 Chromogenix; 2、試驗(yàn)儀器 血凝分析儀購(gòu)自Sysmex ; 血漿來(lái)自合作醫(yī)院。
[0069] 實(shí)施例1 制備本發(fā)明提供的試劑盒一，包含試劑1和試劑2,用于測(cè)定血液中肝素含量。
[0070] 具體為：試劑1活化因子X(jué) (FXa)的發(fā)色底物，其具體制備方法為：取4-Nz-D-Ar g-Gly-Arg-p-nitroanilide *2HC1 (S-2782)溶于濃度為 20mM 的 Tris 緩沖液，再加入鹽酸 調(diào)節(jié)pH值至7. 4 ;再加入氯化鈉和聚乙二醇-8000,攪拌后制得試劑1，其終濃度分別為：4 -Nz-D-Arg-Gly-Arg-p-nitroanilide *2HC1 0.5 mM，氯化鈉 0.15 M，聚乙二醇-8000 1%。
[0071] 試劑2為活化因子X(jué) (FXa)，其具體制備方法為：取活化因子X(jué) (FXa)溶于濃度 為20mM的Tris緩沖液，再加入鹽酸調(diào)節(jié)pH值至7. 4 ;再加入氯化鈉和聚乙二醇-8000,攪 拌后制得試劑2,其終濃度分別為：活化因子X(jué) (FXa) 0.5 μ M，氯化鈉0.15 M，聚乙二 醇-8000 1%。
[0072] 肝素標(biāo)準(zhǔn)品的制備：將已知濃度的含有普通未分級(jí)肝素 （Unfractionated h印arin，UFH)的人血漿標(biāo)準(zhǔn)品稀釋成一定濃度的已知肝素濃度的標(biāo)準(zhǔn)液。重復(fù)上述操作， 配制多個(gè)不同濃度的已知肝素濃度的標(biāo)準(zhǔn)液分別為〇. 1 IU/ml，0. 4IU/ml，0. 7 IU/ml，1. 0 IU/ml〇
[0073] 標(biāo)準(zhǔn)曲線制作： (1)取200 μ L稀釋好的標(biāo)準(zhǔn)液與200 μ L試劑1混合均勻，并孵育2分鐘，孵育和反應(yīng) 的溫度均為37 °C。
[0074] (2)然后加入200 μ L試劑2,混合均勻，在405nm波長(zhǎng)測(cè)量吸光度5分鐘。
[0075] (3)根據(jù)肝素標(biāo)準(zhǔn)液梯度濃度與所對(duì)應(yīng)吸光值，采用線性方程繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，請(qǐng)見(jiàn) 附圖1，其標(biāo)準(zhǔn)曲線公式為y=_l. 428X+1. 7473 (R2=0. 9859)。
[0076] 樣品檢測(cè)： 取3份200 μ L稀釋好的血漿與200 μ 1試劑1混合均勻，37°C孵育2分鐘，然后加 入200 μ 1試劑2,37° C反應(yīng)在405 nm波長(zhǎng)測(cè)量吸光度5分鐘。每份樣品重復(fù)測(cè)量?jī)纱危?記錄試驗(yàn)結(jié)果，計(jì)算信號(hào)強(qiáng)度，和標(biāo)準(zhǔn)曲線比對(duì)得到活化因子X(jué)(FXa)的活性和血液中肝素 含量；此時(shí)測(cè)得的為無(wú)需考慮樣品的內(nèi)源抗凝血酶表達(dá)水平下的肝素含量。
[0077] 檢測(cè)所得試劑盒的特異性、靈敏度及線性范圍見(jiàn)如下實(shí)驗(yàn)。
[0078] 實(shí)施例2 本實(shí)施例與實(shí)施例1的差別僅在于實(shí)施例1所述標(biāo)準(zhǔn)品和樣品所含肝素為普通未分級(jí) 肝素 （Unfractionated heparin, UFH)，而本實(shí)施例中所述標(biāo)準(zhǔn)品和樣品所含肝素為低分 子量肝素（low-molecular-weight heparin, LMWH)。其他操作及配比與實(shí)施例1 一致。 [0079] 根據(jù)肝素標(biāo)準(zhǔn)液梯度濃度與所對(duì)應(yīng)吸光值，采用線性方程繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，請(qǐng)見(jiàn)附 圖 2,其標(biāo)準(zhǔn)曲線公式為 y=-L 0344x+L 3977(R2=0. 9867)。
[0080] 檢測(cè)所得試劑盒的特異性、靈敏度及線性范圍見(jiàn)如下實(shí)驗(yàn)。
[0081] 實(shí)施例3 制備本發(fā)明提供的試劑盒三，包含試劑1、試劑2和試劑3,用于測(cè)定血液中肝素含量， 此時(shí)測(cè)得的為需要考慮樣品的內(nèi)源抗凝血酶表達(dá)水平下的肝素含量。
[0082] 其中，試劑1和試劑2的制備以及標(biāo)準(zhǔn)曲線同實(shí)施例1。
[0083] 試劑3為抗凝血酶，其具體制備方法為：取抗凝血酶溶于濃度為20mM的Tris緩沖 液，再加入鹽酸調(diào)節(jié)pH值至7. 4。再加入氯化鈉和聚乙二醇-8000,得到試劑3,其終濃度分 別為：抗凝血酶0. 2?0. 5U/mL，氯化鈉0. 1?0. 3M，聚乙二醇0. 5?1%。
[0084] 根據(jù)肝素標(biāo)準(zhǔn)液梯度濃度與所對(duì)應(yīng)吸光值，采用線性方程繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，請(qǐng)見(jiàn)附 圖 3,其標(biāo)準(zhǔn)曲線公式為 y=-L 2914x+L 6414(R2=0. 9838)。
[0085] 樣品檢測(cè)： 取3份200 μ L稀釋好的血漿與200 μ L試劑3混合均勻，37° C孵育2分鐘，再加入 200 μ L試劑1，混合均勻孵育2分鐘，然后加入200 μ L試劑2, 37° C反應(yīng)在405nm波長(zhǎng)測(cè)量 吸光度5分鐘。每份樣品重復(fù)測(cè)量?jī)纱?，記錄試?yàn)結(jié)果，計(jì)算信號(hào)強(qiáng)度，和標(biāo)準(zhǔn)曲線(實(shí)施例 1)比對(duì)得到活化因子X(jué)(FXa)的活性和血液中肝素含量。
[0086] 檢測(cè)所得試劑盒的特異性、靈敏度及線性范圍見(jiàn)如下實(shí)驗(yàn)。
[0087] 實(shí)施例4 本實(shí)施例與實(shí)施例1的差別僅在于試劑1中發(fā)色底物為Benzoyl-Ile-Glu-Gly-Arg-p -nitroanilide.HCl (S-2222)。其他制備方法及檢測(cè)操作與實(shí)施例1 一致。
[0088] 該試劑盒的特異性、靈敏度及線性范圍的檢測(cè)結(jié)果與實(shí)施例1所得數(shù)據(jù)存在理論 誤差范圍的一致性。
[0089] 實(shí)施例5 本實(shí)施例與實(shí)施例1的差別僅在于試劑1中發(fā)色底物為CH30-C0-D-CHA-Gly-Arg-p-n itroanilide. AcOH。其他制備方法及檢測(cè)操作與實(shí)施例1 一致。
[0090] 該試劑盒的特異性、靈敏度及線性范圍的檢測(cè)結(jié)果與實(shí)施例1所得數(shù)據(jù)存在理論 誤差范圍的一致性。
[0091] 實(shí)施例6 本實(shí)施例與實(shí)施例1的差別僅在于試劑1中發(fā)色底物為Acetyl-D-Arg-Gly-Arg-p-ni troanilide. 2HC1 (S-2772)。其他制備方法及檢測(cè)操作與實(shí)施例1 一致。
[0092] 該試劑盒的特異性、靈敏度及線性范圍的檢測(cè)結(jié)果與實(shí)施例1所得數(shù)據(jù)存在理論 誤差范圍的一致性。
[0093] 實(shí)施例7 本實(shí)施例與實(shí)施例1的差別在于： 試劑1中各組分終濃度為：發(fā)色底物2mM，Tris緩沖液10mM，氯化鈉0. 3M，PEG-8000 1% ； 試劑2中各組分終濃度為：活化因子X(jué)(FXa) 2 μ M，Tris緩沖液10mM，氯化鈉0. 3M， PEG-8000 1%。其他制備方法及檢測(cè)操作與實(shí)施例1 一致。
[0094] 該試劑盒的特異性、靈敏度及線性范圍的檢測(cè)結(jié)果與實(shí)施例1所得數(shù)據(jù)存在理論 誤差范圍的一致性。
[0095] 實(shí)施例8 本實(shí)施例與實(shí)施例1的差別在于： 試劑1中各組分終濃度為：發(fā)色底物lrnM，Tris緩沖液20mM，氯化鈉0. 3M，PEG-8000 1% ； 試劑2中各組分終濃度為：活化因子X(jué)(FXa) 1 μ M，Tris緩沖液20mM，氯化鈉0. 3M， PEG-8000 1%。
[0096] 其他制備方法及檢測(cè)操作與實(shí)施例1 一致。
[0097] 該試劑盒的特異性、靈敏度及線性范圍的檢測(cè)結(jié)果與實(shí)施例1所得數(shù)據(jù)存在理論 誤差范圍的一致性。
[0098] 實(shí)施例9 本實(shí)施例與實(shí)施例3的差別在于： 試劑1中各組分終濃度為：發(fā)色底物〇.〇5mM，Tris緩沖液50mM，氯化鈉0. 1M， PEG-8000 0. 5% ； 試劑2中各組分終濃度為：活化因子X(jué)(FXa) 0. 05yM，Tris緩沖液50mM，氯化鈉0. 1M， PEG-8000 0. 5% ； 試劑3中各組分終濃度為：抗凝血酶0. 3U/mL，Tris緩沖液50mM，氯化鈉0. 1M， PEG-8000 0. 5%〇
[0099] 其他制備方法及檢測(cè)操作與實(shí)施例3 -致。
[0100] 該試劑盒的特異性、靈敏度及線性范圍的檢測(cè)結(jié)果與實(shí)施例3所得數(shù)據(jù)存在理論 誤差范圍的一致性。
[0101] 實(shí)施例10 本實(shí)施例與實(shí)施例3的差別在于： 試劑1中各組分終濃度為：發(fā)色底物O.lmM，Tris緩沖液20mM，氯化鈉0.1M，PEG-8000 0. 5% ； 試劑2中各組分終濃度為：活化因子X(jué)(FXa) 0. 1 μ M，Tris緩沖液20mM，氯化鈉0. 1M， PEG-8000 0. 5% ； 試劑3中各組分終濃度為：抗凝血酶0. 3U/mL，Tris緩沖液20mM，氯化鈉0. 1M， PEG-8000 0. 5%〇
[0102] 其他制備方法及檢測(cè)操作與實(shí)施例3 -致。
[0103] 該試劑盒的特異性、靈敏度及線性范圍的檢測(cè)結(jié)果與實(shí)施例3所得數(shù)據(jù)存在理論 誤差范圍的一致性。
[0104] 試劑盒的特異性、靈敏度及線性范圍的檢測(cè) 1.試劑盒特異性檢測(cè) 表1險(xiǎn)測(cè)肝索測(cè)定+試劑盒特異性

【權(quán)利要求】
1. 一種FXa活性檢測(cè)試劑，包括試劑1和試劑2,其特征在于，試劑1為活化因子X(jué) (FXa)的發(fā)色底物，試劑2為活化因子X(jué) (FXa);其中活化因子X(jué) (FXa)的發(fā)色底物選自以 下底物中的任--種： Benzoyl-Ile-Glu-Gly-Arg-p-nitroanilide · HC1 ;CH3〇-C〇-D-CHA-Gly-Arg-p_nitroa nilide · AcOH ;Acetyl-D_Arg-Gly-Arg-p-nitroanilide · 2HC1 ; 4-Nz-D-Arg-Gly-Arg-p-nitroanilide *2HC1〇
2. -種FXa活性檢測(cè)試劑，包括試劑1、試劑2和試劑3 ;其特征在于，試劑1為活化因 子X(jué) (FXa)的發(fā)色底物，試劑2為活化因子X(jué) (FXa);試劑3為抗凝血酶；其中活化因子X(jué) (FXa)的發(fā)色底物選自以下底物中的任--種： Benzoyl-Ile-Glu-Gly-Arg-p-nitroanilide · HC1 ;CH3〇-C〇-D-CHA_Gly-Arg-p-nitro anilide · AcOH ;Acetyl-D_Arg-Gly-Arg-p-nitroanilide · 2HC1 ; 4-Nz-D-Arg-Gly-Arg-p-nitroanilide *2HC1〇
3. 根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的FXa活性檢測(cè)試劑，其特征在于：所述發(fā)色底物的工作 濃度為〇. 05?2mM。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的FXa活性檢測(cè)試劑，其特征在于：FXa選自為人、牛、豬 FXa中的任--種。
5. 制備權(quán)利要求1所述的FXa活性檢測(cè)試劑的方法，其特征在于，包括分別制備試劑1 和試劑2 ;其中： 制備試劑1的方法為：將發(fā)色底物溶于緩沖劑中；再加入鹽酸，調(diào)節(jié)pH值至疒8 ;再依 次加入無(wú)機(jī)鹽和表面活性劑，室溫下攪拌10分鐘； 制備試劑2的方法為：將FXa溶于緩沖劑；再加入鹽酸，調(diào)節(jié)pH值至疒8 ;再依次加入 無(wú)機(jī)鹽和表面活性劑，室溫下攪拌10分鐘。
6. 制備權(quán)利要求2所述的FXa活性檢測(cè)試劑的方法，其特征在于，包括分別制備試劑 1、試劑2和試劑3 ;其中： 制備試劑1的方法為：將發(fā)色底物溶于緩沖劑中；再加入鹽酸，調(diào)節(jié)pH值至7~8 ;再依 次加入無(wú)機(jī)鹽和表面活性劑，室溫下攪拌10分鐘； 制備試劑2的方法為：將FXa溶于緩沖劑；再加入鹽酸，調(diào)節(jié)pH值至7~8 ;再依次加入 無(wú)機(jī)鹽和表面活性劑，室溫下攪拌10分鐘； 制備試劑3的方法為：將抗凝血酶溶于濃度為10-50mM的緩沖劑；再加入鹽酸，調(diào)節(jié)pH 值至疒8 ;再依次加入無(wú)機(jī)鹽和表面活性劑，室溫下攪拌10分鐘。
7. 根據(jù)權(quán)利要求1~4任一所述的FXa活性檢測(cè)試劑的應(yīng)用，其特征在于：將上述試劑 作為檢測(cè)試劑用于制備檢測(cè)肝素含量的檢測(cè)試劑。
8. 根據(jù)權(quán)利要求7所述的FXa活性檢測(cè)試劑的應(yīng)用，其特征在于：所述FXa活性檢測(cè) 試劑用于制備肝素含量的檢測(cè)試劑盒，包括盒體和裝有FXa活性檢測(cè)試劑的試劑瓶，試劑 瓶放置于所述盒體內(nèi)。
9. 根據(jù)權(quán)利要求8所述的FXa活性檢測(cè)試劑的應(yīng)用，其特征在于：所述檢測(cè)試劑盒分 別包含試劑1或試劑2。
10. 根據(jù)權(quán)利要求8所述的FXa活性檢測(cè)試劑的應(yīng)用，其特征在于：所述檢測(cè)試劑盒分 別包含試劑1、試劑2試劑3。
【文檔編號(hào)】G01N21/31GK104062243SQ201410159016
【公開(kāi)日】2014年9月24日 申請(qǐng)日期:2014年4月21日 優(yōu)先權(quán)日:2014年4月21日
【發(fā)明者】趙鐵銘 申請(qǐng)人:上海貞元診斷用品科技有限公司